2022年醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞工程2培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查及特性鑒定

CELLENGINEERING細(xì)胞工程第一頁(yè)，共四十一頁(yè)。第一章緒論4個(gè)學(xué)時(shí)

第二章實(shí)驗(yàn)室配置(pèizhì)及基本技術(shù)2個(gè)學(xué)時(shí)

第三章植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)4個(gè)學(xué)時(shí)

第四章植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)6個(gè)學(xué)時(shí)

第五章植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)3個(gè)學(xué)時(shí)

第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交3個(gè)學(xué)時(shí)

第七章人工種子及植物種質(zhì)資源保存2個(gè)學(xué)時(shí)

第八章胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)2個(gè)學(xué)時(shí)第九章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)4個(gè)學(xué)時(shí)

第十章動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體4個(gè)學(xué)時(shí)

第十一章動(dòng)物組織與胚胎工程1個(gè)學(xué)時(shí)

第十二章試管動(dòng)物與克隆動(dòng)物1個(gè)學(xué)時(shí)

課程初步安排(ānpái)：36學(xué)時(shí)

第二頁(yè)，共四十一頁(yè)。第八章動(dòng)物(dòngwù)細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)方法第二節(jié)體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特性第三節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定(jiàndìng)第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的低溫保存第五節(jié)細(xì)胞同步化第六節(jié)器官培養(yǎng)（自學(xué)）第三頁(yè)，共四十一頁(yè)。

第三節(jié)培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定一、培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查（一）肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度（二）倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)（三）培養(yǎng)細(xì)胞的污染檢測(cè)(jiǎncè)和排除二、細(xì)胞系的鑒定

第四頁(yè)，共四十一頁(yè)。第五頁(yè)，共四十一頁(yè)。（三）培養(yǎng)細(xì)胞的污染(wūrǎn)檢測(cè)和排除

培養(yǎng)細(xì)胞的污染：混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物，包括：－微生物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）－化學(xué)物質(zhì)（影響細(xì)胞生存(shēngcún)非細(xì)胞所需的化學(xué)成分）－細(xì)胞（非同一種的其他細(xì)胞）第六頁(yè)，共四十一頁(yè)。常見(jiàn)微生物污染。微生物污染包括細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒污染。無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞(xìbāo)等是主要污染源。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境以及品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基嚴(yán)格無(wú)菌配制是減低污染之最好方法。

第七頁(yè)，共四十一頁(yè)。1、微生物污染(wūrǎn)及其排除微生物污染的途徑微生物污染對(duì)細(xì)胞(xìbāo)的影響微生物污染的檢測(cè)微生物污染的防治第八頁(yè)，共四十一頁(yè)。a.空氣：空氣流動(dòng)性大，如隔離不嚴(yán)，易造成不潔空氣的污染。b.器材：培養(yǎng)器皿、器械，CO2培養(yǎng)箱。c.操作：無(wú)菌觀念(guānniàn)不強(qiáng)。d.血清：質(zhì)量不好、檢查不嚴(yán)。e.組織樣本：避免用碘消毒。第九頁(yè)，共四十一頁(yè)。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中加入的抗菌素的抗污染能力也有限，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無(wú)法挽救。1）一般在細(xì)胞受到有害物污染早期或污染程度較輕時(shí)，如果能及時(shí)處理并去除污染物，部分細(xì)胞有可能恢復(fù)。2）當(dāng)污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中，輕者細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，分裂相減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)較多的顆粒狀物質(zhì)；較重者細(xì)胞增殖停止，分裂相消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了大量堆積物，細(xì)胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。3）不同微生物污染物對(duì)細(xì)胞的影響也有差別(chābié)，支原體和病毒對(duì)細(xì)胞形態(tài)和機(jī)能的影響是長(zhǎng)期、緩慢和潛在的；霉菌和細(xì)菌繁殖迅速，能在很短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或是產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞。第十頁(yè)，共四十一頁(yè)。真菌的污染真菌的種類很多，污染培養(yǎng)細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白色念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)(duōshù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物，一般肉眼可見(jiàn)。短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁。倒置顯微鏡下可見(jiàn)在細(xì)胞間有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀及樹(shù)枝狀菌絲懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。高倍鏡下可見(jiàn)到很多菌絲有鏈狀排列的菌珠，念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。第十一頁(yè)，共四十一頁(yè)。細(xì)菌污染細(xì)菌的污染較為多見(jiàn)是大腸桿菌，白色葡萄球菌，假單胞菌等。加用抗菌素的培養(yǎng)用液一般可預(yù)防和排除個(gè)別少量細(xì)菌的污染。一旦發(fā)生易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象。倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面和周?chē)写罅考?xì)菌存在。細(xì)胞生長(zhǎng)停止并有中毒表現(xiàn)。必要時(shí)可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實(shí)細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變(gǎibiàn)不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液向肉湯細(xì)菌培養(yǎng)基內(nèi)滴加，37％下培養(yǎng)檢測(cè)是否污染。第十二頁(yè)，共四十一頁(yè)。Fungus第十三頁(yè)，共四十一頁(yè)。支原體污染支原體是一種大小(dàxiǎo)介于細(xì)菌和病毒之間（最小直徑0.2um）并獨(dú)立生活的微生物。約有1％可通過(guò)濾菌器。無(wú)細(xì)胞壁，形態(tài)呈高度多形性，可為圓形、絲狀或梨形，在光鏡下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。支原體污染以后多吸附或散在分布于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁，多數(shù)情況下，細(xì)胞病理變化輕微且可由于傳代、換液而緩解，易被忽視；個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)皿脫落。確定有無(wú)支原體污染可做如下檢測(cè)：相差顯微鏡檢測(cè)、熒光染色法、電鏡檢查、DNA分子雜交檢查等。第十四頁(yè)，共四十一頁(yè)。培養(yǎng)細(xì)胞的污染一旦明確，多數(shù)將無(wú)法救治，如果污染的細(xì)胞不是具有重要價(jià)值，一般發(fā)現(xiàn)污染后應(yīng)盡快棄之，以防污染擴(kuò)大影響其它細(xì)胞。防止污染關(guān)鍵在于嚴(yán)格無(wú)菌操作，為防止污染和搶救有價(jià)值的細(xì)胞，目前一般可采用一下措施(cuòshī)：（1）抗生素（2）加溫處理（3）動(dòng)物體內(nèi)接種第十五頁(yè)，共四十一頁(yè)。細(xì)胞系特征及細(xì)胞系間交叉污染(wūrǎn)的測(cè)定同工酶分析血型(xuèxíng)及主要組織相容性抗原的測(cè)定G顯帶技術(shù)DNA分析二、細(xì)胞系的鑒定(jiàndìng)第十六頁(yè)，共四十一頁(yè)。細(xì)胞系組織(zǔzhī)來(lái)源的鑒定具有特征性標(biāo)志的超微結(jié)構(gòu)分析免疫學(xué)試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞骨架蛋白組織(zǔzhī)特異性抗原的鑒定細(xì)胞特殊功能的生化檢查方法細(xì)胞來(lái)源及特征數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)化第十七頁(yè)，共四十一頁(yè)。第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的低溫(dīwēn)保存細(xì)胞的冷凍保存是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的常用方法。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比。可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染(wūrǎn)，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。其原理是在低于-70℃的超低溫條件下，細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。第十八頁(yè)，共四十一頁(yè)。液體的固化有兩種方式，一種是形成尖銳的冰晶，另一種是進(jìn)入無(wú)定形的玻璃化狀態(tài)(zhuàngtài)。根據(jù)凍存液在凍結(jié)后是否形成冰晶，凍存細(xì)胞可分為兩種方法：非玻璃化凍存玻璃化凍存第十九頁(yè)，共四十一頁(yè)。冰晶損傷：凍存細(xì)胞過(guò)程中，因細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰形成冰晶而致的細(xì)胞損傷，包括細(xì)胞膜和細(xì)胞器的損傷。溶質(zhì)損傷：凍存細(xì)胞過(guò)程中，因細(xì)胞外水分結(jié)冰形成冰晶，使得未結(jié)冰的溶液(róngyè)中電解質(zhì)濃度升高而引起的細(xì)胞損傷。非玻璃(bōlí)化凍存一、非玻璃(bōlí)化凍存（一）非玻璃化凍存原理第二十頁(yè)，共四十一頁(yè)。非玻璃化低溫凍存和復(fù)蘇細(xì)胞的原則：緩慢降溫(jiàngwēn)，快速?gòu)?fù)蘇在凍存液中加入冷凍保存劑第二十一頁(yè)，共四十一頁(yè)。緩慢冷凍過(guò)程(guòchéng)中：細(xì)胞外水分先結(jié)冰－胞外電解質(zhì)濃度升高－細(xì)胞內(nèi)水分滲出－在細(xì)胞外形成冰晶－減少胞內(nèi)冰晶的形成，減少胞內(nèi)冰晶損傷快速?gòu)?fù)蘇過(guò)程中：避免原有冰晶融化后，又以新的晶核為中心形成更大結(jié)晶即水的重結(jié)晶現(xiàn)象，減少冰晶損傷，提高凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率慢凍快融以及冷凍(lěngdòng)保護(hù)劑的作用冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用：是指可以(kěyǐ)保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。首先要求對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性。第二十二頁(yè)，共四十一頁(yè)。主要包括有甘油、DMSO、乙二醇、乙酰胺、甲醇等；分子質(zhì)量一般較小，易溶于水，易結(jié)合水分子，易穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；可降低細(xì)胞的冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程(guòchéng)?？商岣呒?xì)胞膜對(duì)水的通透性，凍存時(shí)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水分滲出細(xì)胞外，減少胞內(nèi)冰晶損傷?？上♂尲?xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，減少溶質(zhì)損傷。滲透性保護(hù)劑第二十三頁(yè)，共四十一頁(yè)。主要包括有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡萄糖、白蛋白、羥乙基淀粉等；一般是些大分子物質(zhì)，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)部，可溶于水，可結(jié)合水分子；可稀釋細(xì)胞外電解質(zhì)的濃度，減少溶質(zhì)損傷。可降低細(xì)胞外自由水的含量(hánliàng)，減少細(xì)胞外冰晶的形成。非滲透性保護(hù)劑第二十四頁(yè)，共四十一頁(yè)。細(xì)胞(xìbāo)凍存方法（二）凍存及復(fù)蘇(fùsū)方法第二十五頁(yè)，共四十一頁(yè)。1.預(yù)先配制凍存液,避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。含有20%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,10%DMSO；2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞胰蛋白酶消化（懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則不需處理）將消化好的細(xì)胞收集于離心管并計(jì)數(shù)，離心1000rpm/min,5min；3.去除消化液及培養(yǎng)液，加入配制好的凍存培養(yǎng)液，使細(xì)胞密度為5×106～1×107/ml。用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，分裝入無(wú)菌凍存管中，1～1.5ml/管。凍存管必須旋緊確保密封；4.凍存管上應(yīng)寫(xiě)明細(xì)胞的名稱(míngchēng)、凍存時(shí)間等信息。裝好已作標(biāo)記的小袋或支架同時(shí)作好記錄；5.封好的凍存管即可直接凍存。凍存方法(fāngfǎ)第二十六頁(yè)，共四十一頁(yè)。標(biāo)準(zhǔn)程序（精確控制冷凍速度需要細(xì)胞凍存器）1.當(dāng)溫度在-25℃以上(yǐshàng)時(shí)，降溫速率為－1～－2℃/min；2.當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，降溫速率為－5～－10℃/min；3.當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存器。簡(jiǎn)易程序(方法之一)1.將凍存管放置于塑料盒或小紙盒中，周?chē)潭ㄒ悦鈨A倒；2.將安置好的小盒放入小型泡沫包裝盒內(nèi)，再放入－70℃冰箱中，盡可能減緩降溫速率；3.3h后，取出凍存管移入液氮容器內(nèi)。慢凍程序(chéngxù)：第二十七頁(yè)，共四十一頁(yè)。（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴中并輕輕搖動(dòng)令其內(nèi)容盡快融化（1分鐘左右）；（2）從水浴中取出凍存管，酒精消毒后開(kāi)啟，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上(yǐshàng)培養(yǎng)液，混合后低速離心，出去上清夜，再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次；（3）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)。復(fù)蘇(fùsū)方法注意取凍存管時(shí)操作人員(rényuán)應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止凍存管可能爆裂之傷害!!!第二十八頁(yè)，共四十一頁(yè)。液氮罐第二十九頁(yè)，共四十一頁(yè)。凍存溫度。是指能長(zhǎng)久保存細(xì)胞的一個(gè)深低溫度。在這樣的溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢或停止，經(jīng)長(zhǎng)期保存和復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。從實(shí)際和效益的觀點(diǎn)出發(fā)，液氮溫度（﹣196℃）是目前(mùqián)最佳冷凍保存溫度。冷凍速度融凍速度冷凍保護(hù)劑（三）影響細(xì)胞(xìbāo)凍存的因素第三十頁(yè)，共四十一頁(yè)。冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸：利用特殊容器盛液氮或干冰保存。效果好但麻煩。充液法：選生長(zhǎng)至1/3～1/2瓶底壁、生長(zhǎng)狀態(tài)(zhuàngtài)好的細(xì)胞，棄掉舊培養(yǎng)液，補(bǔ)充新培養(yǎng)液至瓶頸，留微量空氣，封口膜封口。貼身攜帶，達(dá)目的地后倒掉多余培養(yǎng)液，次日換液。培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞的運(yùn)輸?shù)谌豁?yè)，共四十一頁(yè)。第五節(jié)細(xì)胞(xìbāo)同步化概念：細(xì)胞同步化(synchronization)是指在自然過(guò)程中發(fā)生的或是經(jīng)人為處理造成的細(xì)胞周期同步化，前者稱自然同步化，后者稱為人工同步化。類型(lèixíng)：自然同步化:人工同步化:選擇同步化－細(xì)胞沉降分離法，有絲分裂選擇法誘導(dǎo)同步化－DNA合成阻斷法,中期阻斷法第三十二頁(yè)，共四十一頁(yè)。一、分離(fēnlí)同步化細(xì)胞（一）各期細(xì)胞(xìbāo)的分離1、離心洗脫法2、細(xì)胞分類(fēnlèi)揀選法3、梯度沉降法（二）分裂期細(xì)胞的分離第三十三頁(yè)，共四十一頁(yè)。M期細(xì)胞的分離：M期細(xì)胞與培養(yǎng)皿的附著性低，振蕩脫離器壁收集(shōují)。－優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，同步化程度高，細(xì)胞不受藥物的傷害。－缺點(diǎn)：獲得細(xì)胞數(shù)量少（分裂細(xì)胞約占1%～2%）第三十四頁(yè)，共四十一頁(yè)。二、誘導(dǎo)(yòudǎo)細(xì)胞同步化（一）G1/S期細(xì)胞(xìbāo)的分離1、低溫處理法2、營(yíng)養(yǎng)饑餓(jīè)法3、胸腺嘧啶核苷阻斷法（二）分裂中期細(xì)胞的分離第三十五頁(yè)，共四十一頁(yè)。采用低毒或無(wú)毒的DNA合成抑制劑特異地抑制DNA合成，而不影響處于其他時(shí)期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，從而將被抑制的細(xì)胞抑制在DNA合成期的實(shí)驗(yàn)方法。5-氟脫氧尿嘧啶、羥基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高濃度AdR、GdR和TdR均可抑制DNA合成使細(xì)胞同步化。其中高濃度TDR對(duì)S期細(xì)胞毒性較小，因此常用TdR雙阻斷法誘導(dǎo)細(xì)胞同步化。－優(yōu)點(diǎn)是同步化程度高，適用于任何(rènhé)培養(yǎng)體系?？蓪缀跛械募?xì)胞同步化。－缺點(diǎn)是產(chǎn)生非均衡生長(zhǎng)，個(gè)別細(xì)胞體積增大。

G1/S期細(xì)胞(xìbāo)的分離第三十六頁(yè)，共四十一頁(yè)。TdR雙阻斷(zǔduàn)法進(jìn)行細(xì)胞同步化將過(guò)量的TdR加入細(xì)胞培養(yǎng)液，凡處于S期的細(xì)胞立刻被抑制(yìzhì)，而其他各期的細(xì)胞則照常運(yùn)轉(zhuǎn)，培養(yǎng)一定時(shí)