植物分子育種之細胞工程

關于植物分子育種之細胞工程第1頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五植物分子育種是指把供體帶有目的性狀的遺傳信息分離提取出來，導入待改良植物細胞中，使它整合、表達和遺傳，并根據(jù)人們的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需要選育出帶有目的性狀的優(yōu)良個體，培育出具有農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值的新品種。第2頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五細胞工程：是指以細胞為對象，應用生命科學理論，借助工程學原理與技術，有目的地利用或改造生物遺傳特性，以獲得特定的細胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門綜合性科學技術

基因工程：目的基因的定位、分離、重組、表達等。

分子標記輔助育種：DNA分子遺傳標記，或DNA標記。第3頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五

第一節(jié)植物細胞工程概述第4頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五一、植物細胞工程概念(Definitionofplantcellengineering)：1、植物細胞工程是植物生物技術的一個重要組成部分，是在離體培養(yǎng)條件下，細胞水平上對植物材料進行遺傳操作的技術，即對植物體的任何一個部分（器官、組織、細胞、原生質(zhì)體）進行離體誘導使其稱為完整植株的技術。第5頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五小麥胚組織培養(yǎng)示意圖第6頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五

技術應用植物組織與細胞培養(yǎng)技術―作物品種改良

植物細胞大批量培養(yǎng)技術―名貴藥物、生物藥品植物細胞融合技術―――――創(chuàng)造新植物種植物染色體工程技術――――創(chuàng)造作物新類型DNA重組技術―――――――植物改良外源基因?qū)爰夹g――――――植物改良與物理、化學技術相結(jié)合―――植物改良2、植物細胞工程所涉及到的主要技術和應用第7頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五二、研究任務

通過植物細胞工程這一技術手段，在離體培養(yǎng)條件下研究植物組織、器官、細胞、原生質(zhì)體經(jīng)離體誘導形成的愈傷組織形態(tài)發(fā)生規(guī)律、外界環(huán)境條件和培養(yǎng)基對它的作用以及由其誘導而形成的再生植株群體的遺傳穩(wěn)定性和變異性。第8頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五三、植物細胞工程的基本理論1、植物細胞工程的基本理論：（1）細胞是構(gòu)成植物有機體的結(jié)構(gòu)和生命活動的基本結(jié)構(gòu)單位。（2）植物細胞的全能性，即植物細胞是在生理上和發(fā)育上具有潛在全能性（totipotent）的功能單位。第9頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五*1838年，M．J．Schleiden提出細胞學說，1839年T．Schwann認為細胞學說也適用于動物。即細胞是生物有機體結(jié)構(gòu)與功能的及基本單位。*1902年，德國植物學家G．Haberlandt提出了“細胞全能性”理論。他本人被譽為“植物組織培養(yǎng)之父”。2、植物細胞工程發(fā)展過程第10頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五*1934年，White（懷特，美國）培養(yǎng)番茄根尖建立了無性繁殖系，獲得了離體根培養(yǎng)的真正成功。1937年，他又發(fā)現(xiàn)了B族維生素對離體根生長的重要作用。1939年，懷特成功培養(yǎng)了煙草原形成層細胞。懷特研制出了White培養(yǎng)基。*1934年，Gautheret（高斯雷特，法國）培養(yǎng)山毛櫸、黑楊的形成層組織，發(fā)現(xiàn)了生長素IAA的促進作用。1939年，他培養(yǎng)胡蘿卜根形成層也獲得成功。第11頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五*1937～1938年，Nobecourt（諾必考特,法國）培養(yǎng)胡蘿卜根和馬鈴薯塊莖的薄壁組織成功。

在這個階段，由于White、Gautheret和Nobecourt等人的出色工作，建立了植物組培的綜合培養(yǎng)基。三人一起被譽為植物組織培養(yǎng)的奠基人。1943年，White重新提出了植物細胞全能性學說，并著了《植物組織培養(yǎng)手冊》一書。第12頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五*1958年，在美國Steward（施圖爾德,英國）等從胡蘿卜愈傷組織和細胞培養(yǎng)中誘導產(chǎn)生了胚狀體，形成了完整的植株。首次證實了植物細胞全能性理論。進入60年代，植物組織培養(yǎng)技術進入飛速發(fā)展階段，并應用于生產(chǎn)。*1960年，Morel（莫雷爾）培養(yǎng)蘭花莖尖成功，實現(xiàn)了快速繁殖和去病毒的目的。該方法繁殖系數(shù)極高。第13頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五

在我國，早在20世紀30年代，李繼侗等進行銀杏離體培養(yǎng)，獲得了小植株。并發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入銀杏胚乳提取物可促進離體胚生長。羅宗洛等對玉米根尖培養(yǎng)成功。羅士韋將菟絲子莖尖培養(yǎng)成功并在試管內(nèi)開花。第14頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五植物細胞工程涉及部分概念

植物組織培養(yǎng)(Planttissueculture)外植體（Explant）：用于體外培養(yǎng)的植物組織。在組織培養(yǎng)中，我們把由活體植物（母體）上切取下來用作離體培養(yǎng)的那部分組織或器官。在組織培養(yǎng)中，我們把由活體植物（母體）上切取下來用作離體培養(yǎng)的那部分組織或器官。

愈傷組織(Callus)：從植物各種器官的外植體增殖而形成的一種無特定結(jié)構(gòu)和功能的細胞團。器官發(fā)生（Organogenesis）：在組織培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)中由培養(yǎng)物形成根和芽的現(xiàn)象愈傷組織器官發(fā)生第15頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五

胚狀體（somaticembryos）：在離體培養(yǎng)過程中由外植體或愈傷組織產(chǎn)生與受精卵發(fā)育方式類似的胚胎結(jié)構(gòu)現(xiàn)象脫分化（dedifferentiation）：已分化的細胞在一定因素作用下重新恢復分裂機能并改變其原來的發(fā)展方向而沿著一條新的途徑發(fā)育的過程。再分化（redifferentiation）：脫分化的細胞團或組織經(jīng)重新分化而產(chǎn)生新的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的組織或器官的一種現(xiàn)象。體細胞無性系變異（SomacloneandSomaclonalvariation）第16頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五第二節(jié)植物細胞全能性以及分化和去分化第17頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五一、細胞全能性概述一個細胞所具有的生產(chǎn)完整生物個體的固有能力稱之為細胞的全能性。細胞全能性的相對性不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應；即使對于植物細胞而言，細胞全能性也并不意味著任何細胞均可以直接產(chǎn)生植物個體；動植物細胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。第18頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五

植物細胞按照分裂能力分為三類：第一類是始終保持分裂能力，如莖尖、根尖及形成層細胞；第二類是永久失去分裂能力的終端分化細胞。如篩管、導管、氣孔保衛(wèi)細胞等特化細胞；第三類是在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可以重新啟動分裂的G0細胞，如表皮細胞及各種薄壁細胞。一個植物細胞向分生狀態(tài)恢復過程所能進行的程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。第19頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五根據(jù)細胞類型不同從強到弱：營養(yǎng)生長中心＞形成層＞薄壁細胞＞厚壁細胞（木質(zhì)化細胞）＞特化細胞（篩管、導管細胞）根據(jù)細胞所處的組織不同從強到弱：頂端分生組織＞居間分生組織＞側(cè)生分生組織＞薄壁組織（基本組織）＞厚角組織＞輸導組織＞厚壁組織第20頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五細胞全能性脫分化細胞分裂再分化個體再生細胞全能性的表達是通過細胞脫分化和再分化實現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細胞全能性的前題，再分化是細胞全能性表達的最終體現(xiàn)。第21頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五二、細胞脫分化培養(yǎng)條件下使一個已分化的細胞回復到原始無分化狀態(tài)或分生細胞狀態(tài)的過程就是細胞脫分化離體培養(yǎng)下，脫分化過程發(fā)生在第一次有絲分裂之前。靜止細胞啟動分裂是分化細胞成功脫分化的重要標志。第22頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（一）細胞脫分化過程可分為3個階段：第23頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五(二)細胞生理與結(jié)構(gòu)變化第24頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（三）、細胞脫分化的調(diào)控機理細胞周期對脫分化的調(diào)控PSK的發(fā)現(xiàn)及其對細胞脫分化的影響激素誘導表達基因與細胞脫分化細胞脫分化與染色體解凝聚第25頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五1細胞周期對植物細胞脫分化的調(diào)控第26頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五CycD基因首先表達生成CycD,在相關調(diào)節(jié)因子的幫助下CycD復合體使CDKa活化，進而對Rb(G1期限制點調(diào)控分子)磷酸化，使細胞通過“限制點”進入分裂周期后，則CDKb與CycB以及相關的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)完成從S期到M期的調(diào)控。2、第27頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五用3、植物激素的調(diào)控作用第28頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五植物硫化激動素(PSK)

是近年來發(fā)現(xiàn)的一種植物體內(nèi)小分子肽類生長調(diào)節(jié)因子,具有促進細胞增殖等多種生物活性.第29頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五第30頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五第31頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（四）、細胞脫分化與愈傷組織形成細胞脫分化是細胞狀態(tài)的改變，但成功的脫分化必然會導致細胞分裂。對于單個細胞而言，分化細胞啟動分裂發(fā)生在細胞完全脫分化之后。第32頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五器官，組織培養(yǎng)時細胞分裂首先發(fā)生在傷口部位－愈傷組織的形成是脫分化的細胞重新進入活躍分裂的結(jié)果，但不是脫分化的過程。－有些外植體的細胞脫分化以后，直接形成胚性細胞進而形成成體細胞胚。－在組織器官培養(yǎng)時，愈傷組織內(nèi)的細胞脫分化過程是不一致的。第33頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五三培養(yǎng)細胞再分化所謂細胞分化（differentiation）,是指導致細胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式的過程。從分化的遺傳控制角度講，細胞分化是各個處于不同時空條件下的細胞，基因表達與修飾差異的反應，所以，分化也可以說是相同基因型的細胞由于基因選擇性表達所反應的不同表現(xiàn)型。細胞分化中基因組變化：基因表達產(chǎn)物及其調(diào)控與修飾是細胞分化的本質(zhì)所在，越來越多的研究顯示，細胞分化主要受基因在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，其中一些特異性蛋白質(zhì)基因的表達調(diào)控在細胞分化過程中起到了重要作用。第34頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五極性與細胞分化所謂極性（polarity），是指植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理分化上的梯度差異。在很多情況下，細胞的不均等分裂是細胞極性建立的標志。第35頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五TE的形成與細胞分化通常把離體培養(yǎng)中TE(trachearyelements,管狀分子)細胞的出現(xiàn)作為組織分化的標志。而極性的建立似乎又是微管發(fā)生的一個信號，極性建立后生長素按極性方向流動，導致TE細胞分化。由于TE細胞在分化過程中具有細胞壁加厚，原生質(zhì)體自溶等容易觀察的細胞特征，從而又為植物細胞分化研究提供了模式體系。第36頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五激素對細胞分化的調(diào)控作用激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細胞脫分化和再分化的主要因素。生長素和細胞分裂素、GA3、ABA、乙烯如：細胞分裂素和生長素對于細胞生長和分化具有同等重要的協(xié)調(diào)作用，他們的量與比值的不同配合，對于細胞分化起著重要調(diào)節(jié)作用。先用生長素處理，后用細胞分裂素處理，則有利于細胞分裂而不利于細胞分化。反之，則有利于細胞分化。如果兩者同時處理，則可促使分化頻率的提高。第37頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五

研究顯示，植物激素對細胞生長與分化的調(diào)控是一個復雜的級聯(lián)調(diào)控過程，離體培養(yǎng)條件下，由于外植體細胞所處的生理狀態(tài)不同以及內(nèi)源激素水平的差異，試圖尋找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很難的。第38頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五第三節(jié)培養(yǎng)基的基本成分和主要培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)成功的關鍵和保證。培養(yǎng)基是培養(yǎng)成功的關鍵，并因物種、同一物種不同型、同一基因型不同外植體的要求不同而有差異。第39頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五Media

同一物種不同基因型同一基因型不同外植體genus第40頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五*1902年Haberlandt試圖離體培養(yǎng)綠色葉肉細胞以解決碳源問題，但未能實現(xiàn)。因此離體培養(yǎng)必需依賴外來源。

*常用碳源為蔗糖、果糖、葡萄糖，其中蔗糖是最常用的，濃度為2－5％。

*其它形式碳源有麥芽糖、半乳糖、甘露醇、乳糖

***高壓滅菌和過濾滅菌對碳源的影響一、有機營養(yǎng)物（Organiccompounds）1、糖第41頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五培養(yǎng)基的發(fā)展過程1865年Knop鹽溶液培養(yǎng)基1939年Gautheret

愈傷組織培養(yǎng)基1943年White根培養(yǎng)基1925年Uspeaski和Uspenskaia海藻培養(yǎng)基1962年Mnjrashige&SkoogMS培養(yǎng)基改良培養(yǎng)基B5--十字花科(Gamborg等，1968)N6(朱自清等,1975,1987)&NitschH(Nitsch,1969)---禾本科植物花粉培養(yǎng)WS(Wolter&Skoog1966)&LS(Lingmal&skoog1962)---木本植物

第42頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五MS培養(yǎng)基30、40年代簡單培養(yǎng)基無機鹽濃度低，雜質(zhì)高，培養(yǎng)效果差維生素氨基酸生長調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)無機鹽濃度（含有較高濃度的硝酸鹽、銨鹽、鉀鹽）胡蘿卜黑櫻桃MS基本培養(yǎng)基改良MS培養(yǎng)基

椰乳、水解酪蛋白、氨基酸等

增加各種無機鹽濃度，尤其是N和K的濃度第43頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五糖的作用*在胡蘿卜的細胞培養(yǎng)中，高濃度蔗糖下形成的胚狀體較少，但其發(fā)育更接近于合子胚的情況。*在由煙草開花植株莖形成的愈傷組織及豬耳草莖、葉組織的再生中，葡萄糖促進花芽形成。*在某些試驗中發(fā)現(xiàn)，在同一激素比例下，隨糖濃度的不同，器官形成的類型也可能不同。第44頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五

含氮物質(zhì)------維生素類物質(zhì)和肌醇等維生素類物質(zhì)：硫胺素---維生素B1

吡哆素---維生素B6

煙酸---維生素B3

泛酸鈣---維生素B5

肌醇；水解酪蛋白（CH）；椰乳（CM）；玉米乳；麥芽提取液（ME）番茄汁（TJ）；酵母提取液（YE）2、氮**各種培養(yǎng)基中無機N都以兩種形式供應：硝態(tài)氮和銨態(tài)氮配合使用，若單獨應用硝態(tài)氮遠優(yōu)于銨態(tài)氮，因硝態(tài)氮的培養(yǎng)基易造成堿漂移，加入少量銨鹽會抑制這種漂移。

第45頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五含氮物質(zhì)作用*肌醇、腺嘌呤、酪蛋白水解物（CH）、酵母提取物（YE）和椰子汁等，對胚狀體和芽的形成有良好的促進作用。*活性炭在花藥培養(yǎng)中對提高誘導頻率有良好作用，已發(fā)現(xiàn)在胡蘿卜、洋蔥等植物的體細胞培養(yǎng)中，加入活性炭也促進胚狀體和器官的形成。第46頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五愈傷組織器官發(fā)生植株再生生長素、細胞分裂素、赤霉素等激素之間的互相平衡作用3生長激素A、生長素（用于細胞分裂和根的分化）常用生長素：IBA—吲哚丁酸；NOA—萘氧基乙酸

IAA—吲哚乙酸；2,4,5－T—2,4,5－三氯苯氧乙酸;NAA—萘乙酸；P－CPA---對氯苯氧基乙酸;2,4-D---2,4-二氯苯氧乙酸**NAA和IBA常與細胞分裂素結(jié)合用于芽的增長。**生長素可溶解在稀NaOH中或溶于乙酸。第47頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五B、細胞分裂素

常用的有：Kt---激動素

BAP---芐氨基嘌呤

2－iP---異戊烯腺嘌呤

**溶于稀酸或稀堿C、赤霉素：GA3，較生長素和細胞分裂素少用，可溶于水。

*有報道可以促進高粱形成的不定胚再生小植株的正常發(fā)育。

*注意激素的種類、濃度（絕對量）和配比對愈傷組織誘導、植株再生的作用。第48頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五二無機營養(yǎng)物質(zhì)1氮和鐵對某些組織胚狀體形成的作用*胡蘿卜細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中的氮含量與胚狀體形成密切有關。煙草花藥培養(yǎng)中鐵對胚狀體的形成有良好促進作用。2無機鹽濃度*在芽形成后，根的誘導形成通常降低培養(yǎng)基中無機鹽的濃度并去除培養(yǎng)基中細胞激動素，或再加一種生長素(IAA、NAA、IBA)。通常采用White或1/2MS培養(yǎng)基。第49頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五**愈傷組織缺無機營養(yǎng)表現(xiàn)癥狀:（Heller,1965）N----某些愈傷組織出現(xiàn)花青甙，沒有導管形成N、P或K----細胞過度增大且形成層減少S----愈傷組織非常明顯褪綠Fe----細胞分裂停止B----細胞分裂和細胞伸長遲緩Mg和Mn----影響細胞伸長第50頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五(4)瓊脂

**瓊脂并不是培養(yǎng)基必要的成分，對培養(yǎng)物起到支持作用。**使用濃度0.8-1.0%。**培養(yǎng)基類型:固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。**培養(yǎng)基的pH值:

a通常為5.0-6.0

bpH<5.0培養(yǎng)基不能很好膠化，pH>6.0培養(yǎng)基硬度大。

c目前多采用pH=5.8。第51頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五MS基本培養(yǎng)基（mg/L）,pH=5.8

硝酸銨1650鉬酸鈉0.25硝酸鉀1900硫酸銅0.025氯化鈣440氯化鈷0.025硫酸鎂370硫酸亞鐵27.8磷酸二氫鉀170Na2EDTA37.3碘化鉀0.83甘氨酸硼酸602肌醇100硫酸錳22.3蔗糖（％）3硫酸鋅8.6第52頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五常用培養(yǎng)基的分類與特性根據(jù)目前常用培養(yǎng)基配方中含鹽量多少可將培養(yǎng)基分為以下四大類。（一）含鹽量較大的培養(yǎng)基較高濃度的硝酸鹽、銨鹽和鉀鹽，微量元素種類也很多MS培養(yǎng)基以及改良的MS培養(yǎng)基。LS（Linsmaier和Skoog，1965）、BL（Brown和Lawrence，1968）、ER（Eriksson，1965）。該類培養(yǎng)基有利于愈傷組織的誘導、生長和細胞培養(yǎng)。其中MS培養(yǎng)基在各類植物的組織、器官、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)中都取得很好的效果，是應用范圍最廣和適應性最強的培養(yǎng)基。第53頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（二）硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基這類培養(yǎng)基鹽濃度也很高，尤其是硝酸鉀的含量較高，如B5（Gamborg等，1968）、N6（朱至清等，1975）、SH（Schenk和Hildebrandt，1972）。培養(yǎng)基中的和由NH4H2PO4提供。B5培養(yǎng)基含有較低的銨。實踐證明，有些植物的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物在B5培養(yǎng)基上更適宜，比在MS培養(yǎng)基上生長得要好，尤其是那些對銨比較敏感的植物組織和細胞的離體培養(yǎng)效果更好。N6培養(yǎng)基中也含有較低濃度的銨離子，尤其是氨態(tài)氮和硝態(tài)氮的比例很合理，在禾谷類植物的花藥、花粉和原生質(zhì)體培養(yǎng)中得到廣泛應用。第54頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（三）含鹽量中等的培養(yǎng)基

這類培養(yǎng)基中大量元素為MS的1/2，微量元素種類減少，但含量增加，維生素種類比MS多，如H培養(yǎng)基（Bourgin和Nitsch，1979）。第55頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（四）低鹽濃度的培養(yǎng)基這類培養(yǎng)基包括White培養(yǎng)基（1943）、WS（Wolter和Skoog，1966）和HE培養(yǎng)基（Heller，1953）等，其中White培養(yǎng)基由于無機鹽的數(shù)量比較低，更適合木本植物的組織培養(yǎng)。

以上四類培養(yǎng)基中，前兩類培養(yǎng)基比較適合愈傷組織誘導和細胞培養(yǎng)，但選用哪一類培養(yǎng)基，應依植物種類、基因型和外植體等而定；后兩類培養(yǎng)基有利于根的形成。誘導愈傷組織常用的培養(yǎng)基為MS和B5。高鹽濃度的培養(yǎng)基可能對培養(yǎng)過程中愈傷組織數(shù)量及鮮重的增加有利。

第56頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五**培養(yǎng)基選擇與制備

1、培養(yǎng)基選擇

2、培養(yǎng)基制備

A、逐一稱取藥品直接配成用于接種用的培養(yǎng)基。

B、先配成母液備用。第57頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五**促進組織和細胞培養(yǎng)中器官分化和胚狀體的形成應注意以下幾點：①降低或除去原來細胞增殖培養(yǎng)基中的生長素，這點在用2,4-D誘導細胞脫分化時更要注意；或用NAA、IAA代替2,4-D。但也要注意在某些情況中，低濃度的2,4-D對胚狀體形成的促進作。②調(diào)整培養(yǎng)基中生長素/細胞激動素的比例，通常較高濃度的細胞激動素利于長芽，而較高濃度的生長素利于長根，但細胞激動素對胚狀體的形成通常不利。③除了激素的比例外，也要注意所加激素的絕對量的響。第58頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五④要注意所用生長素和細胞激動素的種類，因為同類激素的不同化合物在不少情況下作用也不同。在某些情況下也可以考慮配合使用其它類激素如ABA、赤霉素等或生長抑制物質(zhì)等⑤提高培養(yǎng)基中的氮含量及其它鹽的濃度。⑥在不少情況下，還要注意順序改變培養(yǎng)基的激素成分及其它營養(yǎng)物質(zhì)。第59頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五第三節(jié)植物細胞及組織培養(yǎng)第60頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五1、定義植物細胞培養(yǎng)：指在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)。得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖，而獲得大量的細胞群體的一種技術。一、植物細胞培養(yǎng)第61頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五植物細胞培養(yǎng)的意義1．懸浮細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然植物成分2．植物細胞培養(yǎng)可進行突變體篩選第62頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五植物細胞按照培養(yǎng)對象分類：單細胞培養(yǎng)單倍體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)第63頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五2、植物單細胞培養(yǎng)方法

(1)固體培養(yǎng)：是在微生物培養(yǎng)基基礎上發(fā)展起來的植物細胞培養(yǎng)方法。一般添加一定比例的瓊脂起固化作用。(2)固定化培養(yǎng)：屬于固體培養(yǎng)，指將游離細胞包埋在多糖或多聚化合物制備的網(wǎng)狀支持物中，培養(yǎng)液呈流動狀態(tài)的無菌操作技術。第64頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五(3)液體培養(yǎng)：也是在微生物培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的?？煞譃?

振蕩培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)靜止培養(yǎng)紙橋培養(yǎng)(4)細胞懸浮培養(yǎng)：屬于液體培養(yǎng)，指植物細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中大規(guī)模進行培養(yǎng)。第65頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五(5)分批培養(yǎng)：又稱成比培養(yǎng)，指在一個固定容積的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，當培養(yǎng)基中主要的營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時生長就停止。(6)連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中由于不斷注入新鮮培養(yǎng)基，故培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)能夠連續(xù)得到補充，培養(yǎng)物的容積一般是恒定的。第66頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五3、植物單細胞制備（1）獲得植物單細胞三種途徑由完整的植物器官分離單細胞的方法由培養(yǎng)組織中分離單細胞花粉葉肉組織是分離單細胞的最好材料。第67頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（2）．制備方法機械法：指通過機械磨碎、切割植物體從而獲得游離的單細胞。優(yōu)點：細胞不受酶傷害。缺點：只適合于排列松散的薄壁細胞、效率低、產(chǎn)量少。

1969年，Gnanam和Kulandaivelu用該方法分離出幾種成熟葉片葉肉細胞。

第68頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五酶解法：指用專一的水解酶在溫和條件下分解胞間層，分離細胞。優(yōu)點：最有效的一種方法。缺點：成本較高，酶對細胞有一定傷害。

1968年，Takebe等用該方法分離煙草葉肉細胞成功。

第69頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五愈傷組織誘導法：指將愈傷組織反復繼代，再轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)。添加生長素或酶。第70頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五建立懸浮細胞培養(yǎng)系第71頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五4、單細胞培養(yǎng)方法舉例

(1)．平板培養(yǎng)法指將一定量細胞接種到或混合到一薄層固體培養(yǎng)基里進行培養(yǎng)的方法。此法是Bergman(貝格曼，1960)首創(chuàng)。平板培養(yǎng)的優(yōu)點是便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察,選擇單細胞株和篩選突變體。第72頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五平板培養(yǎng)法具體步驟：①單細胞懸浮液的制備，并記數(shù)。②調(diào)節(jié)細胞密度。③培養(yǎng)基選擇與凝固劑選擇，澆平板。④接種培養(yǎng)。第73頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五平板培養(yǎng)法第74頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（2）．看護培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)法看護培養(yǎng)：是指用一塊活躍生長的愈傷組織來促進培養(yǎng)細胞持續(xù)分裂和增殖的培養(yǎng)方法。謬爾（Muir，1953）首創(chuàng)此法。該方法的優(yōu)點是簡便易行，效果好。但不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程。第75頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五第76頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五飼養(yǎng)層培養(yǎng)：是用處理過的、無活性或分裂慢的細胞來飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細胞，使其分裂和生長。飼養(yǎng)層培養(yǎng)具體方法有四種：①飼養(yǎng)細胞與靶細胞混合。②前者位于下層，后者相反。③一起培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中。④雙層濾紙植板培養(yǎng)第77頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五第78頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（3）．液體淺層靜置培養(yǎng)法

液體淺層靜置培養(yǎng)法：指將一定密度的懸浮細胞放在培養(yǎng)皿中形成一淺薄層，封口靜止培養(yǎng)。該方法優(yōu)點：易于補加新鮮培養(yǎng)基，便于鏡檢。

第79頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（4）培養(yǎng)細胞生長的測定方法①細胞計數(shù)法：用血球計數(shù)板，以cells/ml表示。②細胞體積：將細胞離心于離心管內(nèi)，測定細胞層所占體積。細胞密實體積（PCV）法③細胞鮮重或干重第80頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（5）．微室培養(yǎng)是指在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。此法是DeRopp(戴洛普，1955)首創(chuàng)，Torry(托瑞，1957)、Jones(瓊斯，1960)改進。優(yōu)點是便于在顯微鏡下進行少量單細胞活體連續(xù)觀察。

第81頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五第82頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五5、懸浮細胞培養(yǎng)的同步化方法（1）物理方法體積選擇法：又稱分級過篩法冷處理法（2）化學法饑餓法抑制法不連續(xù)密度梯度離心法第83頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五6、細胞的保存（1）．繼代培養(yǎng)保存法懸浮培養(yǎng)的細胞每隔1～2周更換一次新鮮培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。（2）．低溫保存法一般選擇5～10℃溫度下培養(yǎng)，每隔10天更換一次培養(yǎng)液。（3）．冰凍保存低溫保存超低溫保存第84頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五7、植物細胞培養(yǎng)的應用（1）．與整株植物相比，細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)次生代謝物的優(yōu)點如下：生產(chǎn)條件可控制?？蛇x擇優(yōu)良的細胞系和優(yōu)化的培養(yǎng)條件提高代謝物產(chǎn)量。節(jié)約土地、能源，生產(chǎn)不受季節(jié)限制。無菌培養(yǎng)，可減少病蟲害。通過特定生物轉(zhuǎn)化途徑獲得均一有效成分。探索新的合成途徑，獲得新的有用物質(zhì)。第85頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（2）．細胞培養(yǎng)產(chǎn)品系列藥用代謝物，包括苷類、甾醇類、生物堿、醌類、蛋白質(zhì)類等。天然食品、食品添加劑，如色素、香料、甜味劑等。殺蟲劑、殺菌劑。飼料、精細化工產(chǎn)品，

第86頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五

植物組織培養(yǎng)包括種子培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、芽培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和莖尖培養(yǎng)。二、植物組織培養(yǎng)的類型第87頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五1、種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)（Seedculture）是指在離體條件下通過種子獲得苗或植株的培養(yǎng)。第88頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五2、胚培養(yǎng)

胚培養(yǎng)（Embryoculure）是指離體成熟胚或幼胚的培養(yǎng)。第89頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五3、器官培養(yǎng)

器官培養(yǎng)（Organculture）是指離體植物器官的培養(yǎng)，可以包括不同的類型，如莖尖（shoottip）、芽培養(yǎng)、根培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)。第90頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五4、細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)（Cellculture）是指保持較好分散性的離體細胞或很小的細胞團的液體培養(yǎng)。第91頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五5、原生質(zhì)體培養(yǎng)

原生質(zhì)體培養(yǎng)（Protoplasmculture）是指利用纖維素酶和果膠酶去除植物細胞壁而獲得的完整的具有活力的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。第92頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五純化的葉肉原生質(zhì)體第93頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五第94頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（一）微型繁殖技術1）保持優(yōu)良品種的遺傳特性;2）高效快速地實現(xiàn)種苗的大量繁殖,在短時間中獲得大量的優(yōu)質(zhì)種苗.第95頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（二）作物脫毒第96頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（三）人工種子第97頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（四）單倍體育種第98頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五花藥花粉細胞培養(yǎng)接種脫分化愈傷組織分化出小植物再分化單倍體植株移栽正常植株染色體加倍第99頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五（五）植物體細胞雜交第100頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五第四節(jié)細胞工程在植物分子育種中的生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)第101頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五1959年，圖萊克（Tulecke）和尼克爾（Nickell）首次將微生物培養(yǎng)用的發(fā)酵工藝應用于植物細胞懸浮培養(yǎng)。第102頁，共119頁，2022年，5月20日，3點45分，星期五一、培養(yǎng)特性1．植物細胞本身的特性（1）植物細胞較大。（2）培養(yǎng)體系有較多的大小不等細胞團。（3）細胞壁在培養(yǎng)中易被攪拌器損傷。（4）培養(yǎng)周期較長，分批