“產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選”設(shè)計(jì)方案

一、二、

產(chǎn)淀粉酶α粉酶）細(xì)菌株篩選實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諒沫h(huán)境中采集樣品并從中分離純化某種微生物的完整操作步驟。鞏固以前所學(xué)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。學(xué)習(xí)淀粉酶活性的測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)原理：α淀粉酶是一種液化型淀粉酶，它的生菌芽孢桿菌，廣泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉類物質(zhì)的土壤等樣品中。從自然界篩選菌種的具體做法致可以分成以下四個(gè)步驟采樣、富集培養(yǎng)、初步篩選、分離純化和性能測(cè)定。a)采樣：即采集含菌種的樣品采集含菌樣品前應(yīng)調(diào)查研究一下自己打算篩選的微生物在哪些地方分布最多，然后才可著手做各項(xiàng)具體工作土壤中幾乎各種微生物都可以找到而壤可說是微生物的大本營(yíng)如房土壤粉加工廠和菜園土壤中淀粉的分解菌較多。b)富培養(yǎng)：富集培養(yǎng)就是在所采集的土壤等含菌樣品中加入某些物質(zhì)造一些有利于待分離微生物生長(zhǎng)的其他條件能解利用這類物質(zhì)的微生物大量繁殖而便于我們從其中分離到這類微生物。c)初步篩選：i.ii.

（選擇培養(yǎng)基篩使用選擇培養(yǎng)基對(duì)菌種進(jìn)行培養(yǎng)過養(yǎng)基的特殊成分，來篩選出目的菌種，從而進(jìn)行培養(yǎng)。（鑒別培養(yǎng)基篩利用鑒別培養(yǎng)基過添加一些特殊的試劑或成分來鑒別出目的菌種，從而篩選出來并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。三、

d)分純化：通過上述的篩選只能說我們要分離的目的菌種已經(jīng)存在要把夾雜在其中的雜菌除去，從而得到純種的菌落種分離的方法很多，主要有：平板劃線分離法、稀釋分離法、單孢子或單細(xì)胞分離法、菌絲尖端切割法等。e)性測(cè)定：分離純化得到的菌種之后分的菌種是否具有實(shí)驗(yàn)所要求的性能必要進(jìn)行性能測(cè)定后才能決定取舍。實(shí)驗(yàn)材料：培養(yǎng)基配制：a)培養(yǎng)基按以下比例配制后，加蒸餾水調(diào)至100%；b)富培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%、蛋白1%、萄糖0.5%、0.5%、肉膏0.5%pH7.0；c)分離培養(yǎng)基粉餅1.5%粉0.02%、4NaCl、0.2%檸檬酸鈉、酸銨（解后加入24HPO0.2%、。24主要試劑和溶液的配制：a)淀粉溶液準(zhǔn)稱取淀粉2g溶于100ml0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液中。b)0.1mol/L的檸檬酸緩沖液pH=1.0的酸

-6-4-5--6-4-5-四、

c)1%的，二基水楊：精確稱取二硝基水楊酸，溶于氫氧化鈉溶液中加入蒸餾水再加入四水酒石酸鉀鈉30g待溶解后用蒸餾水定容100ml，蓋緊瓶塞，隔絕CO。2d)0.1%葡糖溶液：準(zhǔn)稱取80℃烘干至恒重的無水葡萄糖0.1g，離子水溶解后定容至100ml。e)0.1%標(biāo)麥芽糖溶液：稱麥芽糖100mg，蒸餾水溶解并定容至100ml。實(shí)驗(yàn)方法：采樣與稀釋：a)從實(shí)驗(yàn)樓前的小樹林中采集土樣，稱取5g土樣，放入裝有45mL無水的三角瓶中震20min后靜置5min。后對(duì)其進(jìn)行濃度梯度稀釋到,分稀釋到10

、

、

濃度下。

富集培養(yǎng)：a)從上述土壤稀釋液中各取1注無菌培養(yǎng)皿中，然后倒入滅菌并融化冷卻至50℃左右富集培養(yǎng)基，小心搖動(dòng)冷凝后，倒置于℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)。初步篩選：a)培養(yǎng)24小后，取出平板，向平板中注入1滴蘭氏碘液，因淀粉遇碘變藍(lán)色如落周圍有無色透明圈明該菌能分解淀粉即該菌株可以產(chǎn)生淀粉酶。通過影印法或點(diǎn)種法將可以產(chǎn)生淀粉酶的菌株接種到相同的無菌培養(yǎng)中，重復(fù)操作進(jìn)行培養(yǎng)。分離純化：a)初篩所得的菌落中選擇菌落周圍透明圈和菌落直徑之比值較大的菌落劃線分離。將劃線分離后的培養(yǎng)皿放入℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小。性能測(cè)定：a)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：i.

取支預(yù)潔凈滅菌干燥的試管，編號(hào)，加入試劑見表1。個(gè)濃度做3個(gè)平行樣本。搖勻，至沸水浴中煮沸。出后流水冷卻，加蒸餾水定容至，以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在520nm的長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，并建立通過吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。表1淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試管號(hào)

麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）

麥芽糖含量（mg）

蒸餾水（ml）

3二基水楊酸（ml）

b)酶力測(cè)定：i.ii.iii.

首先制備待測(cè)粗酶液：取培養(yǎng)好菌株的分離培養(yǎng)基進(jìn)行離20min，收集上清液即為待測(cè)粗酶液。取20ml預(yù)潔凈滅菌干燥的具塞度試管，編號(hào)。并按步驟操作：取粗酶液1.0ml→加2%的可溶性淀粉1ml蒸水3ml于℃水浴中預(yù)熱→加0.1ml/l檸酸緩沖液（pH6.0于60℃水浴中保溫→加，二基水楊酸，水浴中煮沸5min，迅速冷卻，加蒸餾水定容至20ml。空白對(duì)照：取粗酶液1.0ml加入pH1.0的酸鈍化淀粉酶