第八章分光光度分析、電化學分析及自動化技術

第五章常用生物化學檢驗技術臨床生化檢驗常用的分析技術有光譜分析技術、電化學分析技術、電泳分析技術、層析和離心分析技術及自動化分析技術。其中光譜分析技術是最基本和最常用的技術，它具有靈敏、準確、快速、簡便、選擇性好等特點而被廣泛應用。第一節(jié)光譜分析技術光譜技術是根據(jù)物質吸收或發(fā)射輻射能而建立起來的一類分析方法，因不同分子的原子團和原子，其發(fā)射光譜和吸收光譜不同，而相同的物質在一定條件下，其發(fā)射光譜和吸收光譜的強度與該物質的含量成正比關系。因此可對物質進行定性和定量分析，此類技術稱為光譜技術。是一種最常用的生化檢驗測定技術，它主要包括吸收光譜（可見紫外、紅外原子吸收光譜法）、發(fā)射光譜（熒光法、火焰發(fā)射光譜法）和散射光譜（比濁法）。光是一種高速傳播的電磁輻射，具有波、粒二象性，光的波長（λ）的常用單位納米（nm），可見光波長400～760nm，＜400nm稱為紫外光，＞760nm稱為紅外光，波長愈短，能量愈大。可見，紫外吸收光譜是由于多原子分子的價電子在電磁輻射的作用下，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，這種因物質分子對輻射的選擇性吸收而得到的光譜稱為吸收光譜。處于高能態(tài)的分子（激發(fā)態(tài)分子）是不穩(wěn)定的，當返回基態(tài)時，便發(fā)射出相應的光譜，稱為發(fā)射光譜?？梢?，紫外吸收光譜用于定量分析的依據(jù)是光的吸收定律，即Lambert-Beer是律，它是吸收光譜法的基本定律。一、分光光度法的基本原理（一）吸光度與透光度當光線通過均勻、透明的溶液時，一部分光被散射，一部分光被吸收，另一部分光透過溶液。設入射光強度為Io，透射光強度為It，It與Io之比稱為透光度（T），即T常用百分數(shù)表示（T%），也稱為百分透光度。透光度的負對數(shù)稱為吸光度（A），又稱為消光度（E），光密度（OD），即吸光度與透光度的換算：如透光度=10％時A=lg100－lg10=2－1=1透光度=20％時A=lg100－lg20=2－1.3=0.7（二）Lambert-Beer定律1.Lambert定律當一束強度為Io的單色光透過某種吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，則透過的光線為It。當溶液濃度不變時，透過的液層愈厚，則光線強度的減弱愈顯著。吸光度隨液層厚度增加而增加，其關系是吸光度（A）與液層厚度成正比，即將上述比例式寫成等式，則引入比例常數(shù)，即吸光系數(shù)（K），得A=K·L當溶液濃度不變時，吸光度與液層厚度成正比，這就是Lambert定律。2.Been定律當一束強度為Io的單色光透過某種吸光溶液后，若液層厚度不變，而濃度不同時，溶液的濃度愈大，則透過光的強度愈弱，其定量關系是：當液層厚度不變時，吸光度與溶液濃度成正比，這就是Beer定律。合并Lambert定律和Beer定律即Lambert-Beer定律是說明吸光物質對單色光吸收的強度與該物質的濃度和液層厚度成正比。溶液的吸光強度與濃度的關系，如用坐標表示，即A-C曲線呈正比易制圖，使用方便（三）吸光系數(shù)吸光系數(shù)K的物理意義是吸光物質在單位濃度及單位厚度時的吸光度，在給定條件下（波長、溶液性質、濃度）吸光系數(shù)是物質的特征常數(shù)，K值愈大，能測定的濃度C愈小，則靈敏度愈高。吸光系數(shù)的表示方法εmolεmol1cm·λ2.百分吸光系數(shù)或稱比吸光系數(shù)，用表示，是指濃度為1％（W/V）的溶液在厚度為1cm時的吸光度。換算關系：二、分光光度計的基本結構分光光度計由光源、單色光器、比色杯、光電管、運算放大器和顯示器等部分組成。1.光源2.單色光器3.試樣室4.光電管5.運算放大器6.顯示器圖5-1分光光度計結構示意圖（一）光源可見光分光光度計常用光源是鎢燈，能發(fā)射出350nm～2500nm波長范圍的連續(xù)光譜，適用范圍是360nm～1000nm?，F(xiàn)常用的是鹵鎢燈，發(fā)光效率提高，使用壽命延長。紫外分光光度計常用光源是氫燈，其發(fā)射波長范圍為150nm～400nm。（二）單色光器將光源的復合光分散為單色光的裝置稱為單色光器。常用的單色光器有濾光片、棱鏡和光柵。（三）比色杯盛放比色溶液的裝置。用無色透明、耐腐蝕、耐酸堿的玻璃或石英材料做成。光徑有0.5～5cm，比色杯間的透光度誤差應小于0.5%。（四）檢測器由光電管和運算放大器組成，是將光信號轉換成電信號，并將電信號放大的裝置。（五）顯示器是將檢測器所檢測的電流通過儀表顯示出來的裝置。常用的有檢流計和數(shù)字顯示器。檢流計可顯示透光度（T%）和吸光度（A），數(shù)字顯示器可顯示T%、A和C（濃度）。三、分光光度法的定量方法1.對比法又稱標準對照法，通常在測定未知濃度樣品的同時，測定一已知濃度的標準液作比較，然后分別測定兩者的吸光度。因測定成分相同，故a值相同，比色時用同樣規(guī)格的比色皿故bS=bR，所以比色分析中測定標準液與未知液吸光度的比值也就等于其濃度的比值，即若標準液與樣品用量不等時，則再乘上。用對比法進行定量時，為了減少誤差，選用標準液濃度應盡可能接近待測樣品濃度。2.標準曲線法配制一系列濃度不同的標準液，按一定操作方法顯色后，用選定的波長分別測定它們的吸光度，然后以吸光度為縱坐標，標準液濃度為橫坐標，在坐標紙上標出各坐標點，通過原點連接各點應成一直線，即A-C曲線。注意事項：（1）應設置5～6個濃度。（2）設置的濃度范圍應足夠大，直至觀察到“拐點”（即不呈直線的濃度值），或到能滿足臨床應用的濃度為止，以便能準確地劃出線性范圍。（3）每一種濃度最好是做三個平行測定，并要求3支平行管吸光度的最大值與最小值之差應小于0.05，然后求平均值。（4）校正有時制備的標準曲線C與A相交的點不一定完全在一條直線上，定線時若采用目測法校正，如校正不當，反面會造成更大的誤差，科學的方法采用直線回歸方程來確定直線的位置，其計算方式是y=a+bx四、其它光譜分析技術（一）火焰光度法是一種發(fā)射光譜分析法，是利用火焰使金屬元素激發(fā)后，能發(fā)射出特征性譜線的特點進行測定的一種方法1.基本原理某些金屬元素的基態(tài)原子受到火焰的激發(fā)后，其外層電子獲得能量而從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，接著它們又以發(fā)射光譜的形式釋放出所獲得的能量，而返回基態(tài)，在相同條件下，同一元素所釋放的單位能量相同，故能形成固定光譜。而不同的元素受激發(fā)后所發(fā)射光譜不同。如鈉發(fā)射光譜波長589nm，鉀發(fā)射光譜波長767nm由于火焰供給的能量不強，只能激發(fā)堿金屬和堿土金屬元素，生化檢驗中常用于鉀、鈉的測定。元素的發(fā)射譜線強度與該元素濃度的關系可表示為：I=a·cba是與試樣組成、及其蒸發(fā)和激發(fā)過程有關的常數(shù)，b為自吸收系數(shù)，在濃度很低時，b≈1，所以上式可寫成I=a·c，即發(fā)射譜線強度與待測元素濃度成正比。2.火焰光度計的基本構造基本結構主要分三個部分：激發(fā)光源系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、檢測顯示系統(tǒng)（二）熒光分析法暗利用某些物質受紫外光照射后發(fā)出特有的熒光，籍此對物質進行'定性，定量分析的方法。1.基本原理某些物質的分子吸收了光能，從基態(tài)躍遷至某一電子激發(fā)態(tài)中的某一振動能級，處于激發(fā)態(tài)較高振動能級中的分子通過運動或與其他分子的碰撞而將過多的能量轉給其他分子，并返回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，然后發(fā)生自發(fā)輻射，躍遷到基態(tài)，發(fā)射一定波長的輻射能，此能量即熒光，熒光多為可見光，在一定濃度范圍內，其熒光強度與溶液濃度呈線性關系，是量關系式可表示為：F=φfIoεbc=KcK為常數(shù)，它與物質的性質，激發(fā)光強度、波長、液層厚度等條件有關。此公式是熒光分析的定量基礎，但它只適合于稀溶液，即εbc項不大于0.05，因此線性范圍的最大濃度為Cmax=。當溶液濃度超過Cmax時，熒光強度與濃度不呈線性的。2.影響熒光強度的因素（1）溫度、pHT↑，分子碰撞頻率↑，因此熒光強度隨溫度升高而減弱。pH可影響化合物電離或使熒光物質水解，如苯胺在pH7～12溶液中主要的分子形式存在，產生藍色熒光，而在Ph＜2或＞13的溶液中以離子形式存在，不能產生熒光。（2）激發(fā)光和發(fā)射光在定量測定時，一般應選擇熒光物質的最大激發(fā)波長（λex）和最大熒光波長（λem），但有些熒光物質化學性質不穩(wěn)定，受激發(fā)光照射后易分解，縮短樣品照射時間，改變激發(fā)光波長。（3）物質濃度的影響熒光分析只適合稀溶液，因熒光物質濃度高，分子間碰撞增加，使熒光強度減弱，這種現(xiàn)象稱為自熄滅，自熄滅現(xiàn)象隨濃度增加而增強。3.儀器與測定方法作為熒光分析的儀器有光電熒光計和熒光分光光度計。光電熒光計的結構與光電比色計很相似，不同之處是檢測器與光線成直角，并多一塊濾光片。如將濾光片改為棱鏡或光柵作單色器，就和可見紫外分光光度計相似而成熒光分光光度計。四類儀器的組成部件的比較光源單色器測定池光敏元件檢測器光電比色計鎢燈濾光片玻璃（二面透光）光電池光電管檢流計光電熒光計鹵鎢燈（300-700nm）兩塊濾光片玻璃（四面透光）光電管檢流計可見、紫外分光光度計鎢燈（400-760nm）氫燈（200-400nm）光柵或棱鏡玻璃石英光電管光電倍增管自動記錄儀熒光分光光度計氙弧燈（200-700nm）光柵或棱鏡玻璃石英光電倍增管自動記錄儀氙弧燈發(fā)射的強烈紫外線對人眼有害。熒光分析優(yōu)點：（1）靈敏度高比可見紫外吸收光譜高103～104倍。（2）特異性強通過選擇合適的激發(fā)光波長和熒光波長可避開其它物質干擾。（3）操作簡便、快速、重現(xiàn)性好。（4）樣品用量少不足之處：（1）應用范圍有一定局限性，因許多物質不能產生熒光。（2）對測定條件要求嚴格，如試劑、溶劑不應含有熒光雜質。（3）儀器價格較貴熒光分析法在醫(yī)學檢驗中可用于測定類固醇激素（腎上腺皮質激素、性激素）及代謝產物，單胺類神經遞質（幾茶酚胺，5-HT），某些維生素（VitA、B族）。（三）原子吸收分光光度分析屬吸收光譜分析1.基本原理：待測元素經原子蒸氣發(fā)生器轉化成氣態(tài)原子（處于基態(tài)），由空心陰報燈提供的待測元素的其振線經過待測元素的蒸氣，共振輻時強度被蒸氣中待測元素的基態(tài)原子吸收而減弱，其吸收規(guī)律遵循Beer定律，即在一定條件下，原子吸收與該物質濃度成正比。共振線：電子從基態(tài)躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級所吸收的譜線的為共振吸收線。簡稱為共振線。2.組成由光源、原子化器、分光系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)組成。（1）光源有空心陰極燈、無極放電燈和蒸氣放電燈。（2）原子化器將待測元素轉化為基態(tài)原子。（3）分光系統(tǒng)將待測元素的特征譜線與其它譜線分開。由透光狹縫、色散元件和準直鏡組成。（4）檢測系統(tǒng)將光信號轉化為電信號并進行放大處理，確定待測元素的含量。由檢測器和放大器組成。3.應用：在醫(yī)學檢驗中主要用于體液、毛發(fā)、指甲等組織鈣、鎂、鐵、鈉、鋅、鋁、汞、鉛、砷等多種元素的測定。優(yōu)點：（1）選擇性好，受干擾少，原子吸收是光的窄帶吸收，僅0.001～0.01nm，而分子對光的吸收是寬帶吸收，達幾個nm。（2）靈敏度較大火焰光度分析高1～2個數(shù)量級（3）測定快速、簡便（4）應用范圍廣，可測多種元素，但需更換不同空心陰報燈，儀器昂貴。第二節(jié)電化學分析電化學分析是一種以溶液電化學性質為基礎測定物質含量的分析方法。按測定量的電化學參數(shù)的不同，可分為電位法、電導法、庫侖法、極譜法和伏安法等，下面主要介紹電位法中的離子選擇電極法。離子選擇電極（ionselectiveelectrode，ISE）是一種電化學敏感器，它的電勢與溶液中給定離子的活度的對數(shù)成線性關系，故可以通過簡單的電位測量，直接測定溶液中離子活度。離子濃度與離子活度的關系a=f.c在稀溶液中（10－4mol/L以下）活度系數(shù)接近1。ISE分析法的優(yōu)點：1.是一種直接的非破壞性分析方法，可反復進行，不受樣品溶液顏色、渾濁等因素的干擾。2.分析速度快，單次分析通常只1～2miv3.測量范圍寬，4～5個數(shù)量級4.操作簡便5.測量的是離子活度，對臨床醫(yī)學和基礎醫(yī)學更有實用意義。一、ISE分析法的基本原理ISE大都屬于膜電極，膜中含有與待測離子相同的離子。膜的內表面與具有相同離子的固定濃度溶液接觸，其中插入一內參比電網極，膜的外表面與待測離子溶液接觸。由于電極膜材料、制備方法不同，使電極的穩(wěn)定性、選擇性和靈敏度也不同。膜電位的產生：當電極置于待測離子溶液中時，由于離子的交換和擴散作用，改變了兩相中原有的電荷分布，因而存在一定的電位差，因為內充溶液中有關離子的濃度恒定，內參比電極的電位固定，所以ISE的電位（E）只隨離子活度不同而改變，其電位可用Nernst方程式表示。ISE的E值不能直接測定，必須將ISE與參比電極浸入被測溶液中組成原電池，然后通過電動勢來測定E值。參比電極：是指在溫度、壓力恒定的條件下，當被測溶液離子濃度有所改變時，電極電位保持不變的電板。二、ISE的分類均相膜電極非均相膜電極均相膜電極非均相膜電極晶體膜電極剛性基質電極流動載體電極基本電極剛性基質電極流動載體電極非晶體膜電極離子選擇電極氣敏電極敏化電極酶電極（一）晶體膜電極其敏感膜為金屬微溶鹽，經加壓成片，制成單晶、多晶或混晶電極敏感膜，如氟電極，其敏感膜為LaF3單晶片。（二）非晶體膜電極1.剛性基質電極其敏感膜為薄玻璃，故稱為玻璃電極。成分一般為Na2O-AI2O3-SiO2改變這三種成分的配合比可分別制出對Li+、Na+、K+、Ag+的離子選擇電極。如：Na2O—AI2O3—SiO227%4%69%K+10.4%22.6%67%Na+2.流動載體電極其敏感膜是由溶解在與水不相混溶的有機溶劑中的離子締合劑或絡合劑作為離子交換體，再將此溶液滲透在具有惰性，多孔性和疏水性的塑料薄膜內。（三）氣敏電極是基于界面化學反應對氣體敏感的電極，它是在一般的離子選擇電極的基礎上，再覆蓋一層疏水的透氣膜（如聚四氟乙烯），如CO2、NH3電極。（四）酶電極它由離子敏感膜和覆蓋在表面含有酶的酶涂層所組成，敏感膜對待測物的酶促反應有選擇性的響應，如尿素酶電極。三、ISE的性能1.響應范圍及檢測下限響應范圍是指電極對待測離子的響應符合Nernst公式的線性區(qū)，此范圍越寬越好，一般在4～7個數(shù)量級之間，檢測下限是指能夠檢測被檢離子的最低濃度，一般在10－5～10－7mol/L。2.選擇性是指電極對待測離子和共存干擾離子的響應程度的差異。常用選擇性系數(shù)或選擇比來描述，選擇性系數(shù)越小，表示電極選擇性越強。3.響應斜率和轉換系數(shù)ISE在Nernst響應范圍內被測離子活度變化10倍所引起的電極電位變化的數(shù)值，即響應斜率（S），從理論上說，斜率為：但對某一ISE來說，實際S值與理論S值并不完全相符，其偏差用轉換系數(shù)表示，一般轉換系數(shù)達到理論值90％以上的電極性能較好。4.電報壽命取決于電極制作材料，結構和使用保管情況。四、ISE分析定量方法1.標準曲線法配制一系列不同濃度標準溶液，測定其電位值Es，繪制Es-lgc標準曲線，在相同條件下測定樣品溶液電位值Ex。2.電極校正法用標準溶液校正ISE，制成直讀式儀表。五、ISE分析方法的誤差1.電動勢測量，對于一價離子的響應，電勢測量每差1mV引起濃度的相對誤差為4％，對于二價離子則為8％，因此對于測量電勢的儀表精度要求達到0.1mV。2.溫度Nernst公式中的斜率，內參比電極的電位，以及離子活度等都與溫度有關，因此在整個測量過程中應保持溫度恒定。3.pH溶液pH值可影響被測離子在溶液中的存在形式，從而影響相應離子的活度，如LaF3電極測定F－如pH＜5，F(xiàn)－則會生成HF，使結果偏低。4.滯后效應使用ISE若先測濃溶液后，再測稀溶液時電位平衡緩慢并出現(xiàn)誤差，這一現(xiàn)象稱為“滯后效應”。第三節(jié)電泳技術一、電泳的基本原理（一）電泳的概念溶液中帶電顆粒在直流電場中向電荷相反方向移動的現(xiàn)象稱為電泳。利用電泳現(xiàn)象對物質進行分離的技術叫電泳技術。電泳技術的應用始于1937年，瑞典Tiselius利用界面電泳將血清蛋白質分離成五種成分。1948年Wieland發(fā)明紙電泳，使電泳技術大為簡化。此后，電泳技術發(fā)展迅速，特別是電泳技術與層析法，免疫學方法的結合，使其分辨率達到mg/ml水平，成為醫(yī)學檢驗的一種重要分析技術。（二）蛋白質的兩性電離和等電點蛋白質分子中有電離帶正電荷的氨基，也有電離帶負電荷的羧基，故蛋白質是一種兩性電解質。在酸性條件下，羧基電離受抑制，－NH2－NH3＋帶正電。在堿性條件下，羧基電離受增強，－COOH－COO—帶負電。在某一pH溶液中，蛋白質分子中氨基與羧基電離趨勢相等（或正負離子相等），靜電荷為零，此時溶液的pH稱為該蛋白質的等電點（pI）。（三）電泳遷移率指帶電粒子在單位電場強度作用下的電泳速度，通常用μ表示μ=V/EV為粒子移動速度（cm/s）E為電場強度（V/cm）遷移率取決于帶電粒子的性質（粒子所帶電量Q，粒子大小、r、形狀）介質粘度η，對于球狀分子，根據(jù)Stoke定律V=QE/6πrηU=Q/6πrη在實際測定中，電泳速度V以單位時間t（秒）內移動的距離d（厘米）表示V=d/t（cm/s）電場強度E以單位長度L（厘米）上所施加的電勢差V（伏特）表示E=V/L（V/cm）所以通過測量d，L，V，t便可計算出顆粒的遷移率。由于不同的帶電粒子其遷移率的不同，因此在同一電場中的移動距離不同，故能將其分離，根據(jù)公式dA=V·t/L×μAdB=V·t/L×μBA.B移動距離差為△d=（dA－dB）=（μA－μB）×V·t/L分離距離與電壓和電泳時間成正比，與支持物長度成正比。二、電泳技術的分類和電泳儀（一）電泳的分類1.根據(jù)被分離樣品的多少分析電泳，制備電泳。2.根據(jù)電泳電壓的高低常壓電泳，高壓電泳。3.根據(jù)是否使用支持介質自由電泳，區(qū)帶電泳。4.根據(jù)電泳系統(tǒng)的組成是否均一連續(xù)電泳，不連續(xù)電泳。（二）電泳儀由直流電源和電泳槽兩部分組成。1.直流電源將交流電源經整流，濾波后獲得。分為（1）恒壓電源電泳過程中的電流恒定不變。但電泳過程中的熱效應，降低外周電路的電阻，使電流慢慢增大。（2）恒流電泳電泳過程中的電流恒定不變。用這種電流的輸出電壓可隨外周阻力減少而減少，從而保持電流恒定。（3）恒功率電源電泳中輸出功率恒定不變。主要用于等電聚焦電泳。2.電泳槽盛裝緩沖液和進行電泳分析的場所，一般用塑料和有機玻璃制成，它包括電極，緩沖液槽，電泳支架，透明蓋組成。電泳槽的外形有水平式，垂直式，圓盤式等多種。電極應具有良好的導電性，抗腐蝕性和抗電解作用。以鉑金材料最為理想，最好貫穿整個緩沖液槽。三、影響電泳的因素（一）電場強度電場強度增大，電泳速度加快，但是同時電流增大，產熱增多，水分蒸發(fā)加速，甚至使蛋白質變性。電場強度降低，電泳速度減慢，電泳時間延長。醋酸纖維薄膜電泳的電場強度一般為10～15V/cm（二）電泳緩沖液維持電泳介質pH恒定，并起導電作用。1.組成由弱酸和弱酸鹽組成，常用的有磷酸鹽，硼酸鹽，巴比妥鹽和三羥甲基氨基甲烷（Tris）等，其中巴比妥緩沖液用得最多，由巴比妥鈉和巴比妥組成。選擇緩沖液時應考慮的因素。（1）化學性能穩(wěn)定，不易水解。（2）緩沖液的pH應與弱酸的pK值接近，有較強緩沖能力。（3）緩沖液中正負離子應有相近的遷移率，避免電暈出現(xiàn)正負離子分布不均。（4）緩沖液的離子應該是一價的，多價離子有較厚的雙電層，移動性差。（5）緩沖液的電導率要低，避免通電時產生較多的熱。2.pH緩沖液pH決定了蛋白質的帶電狀態(tài)，電泳時應選擇一個合適pH，使各種蛋白質在這一pH時凈電荷差別最大以利于分離。血清蛋白醋酸纖維薄膜電暈常用pH8.6的巴比妥緩沖液。各種蛋白質均帶負電荷，電泳時向正極移動。緩沖液pH的計算電泳過程水會發(fā)生電極。正極：2OH－H2O+1/2O2↑+2epH↓負極：2H++2eH2↑pH↑故電泳2～4次后應將緩沖液正極交換，減少這種影響。3.離子強度是指溶液中各種離子的摩爾濃度（ci）與其電荷數(shù)平方（Zi2）乘積總和的1/2。即I=1/2∑cizi2I的單位是mol/L。如0.1mol/LNaCLI=0.1mol/L0.2mol/LMgCL2I=0.6mol/L對于緩沖液I計算，由于弱酸的電離度很低，一般只計算鹽的。I愈大，緩沖能力越大，pH越穩(wěn)定，但緩沖液所載分電流增加，樣品所載的分電流減少，電泳速度減慢，導電能力增加，產熱增加。I過小，緩沖能力小，pH不穩(wěn)定，緩沖液所載分電流減少，樣品所載分電流增加，緩沖液粘度系數(shù)降低，電泳速度加快。但樣品在支持物上擴散嚴重，分辨率降低。兼顧兩方面的影響，一般在0.05～0.1mol/L。（三）支持介質對支持介質的基本要求是具有化學惰性，不與被分離的樣品或緩沖液起化學反應，并具有一定的堅韌度。1.吸附使被分離樣品滯留，而降低電泳速度，造成拖尾而使分辨率降低。2.電滲電泳過程中液體對固體支持物的相對移動稱為電滲。實際上是電泳材料表面的電荷引起水的定向移動。當電滲作用方向與電泳方向一致，電泳速度加快，順水行舟。當電滲作用方向與電泳方向相反，電泳速度減慢，逆水行舟。四、常用電泳技術區(qū)帶電泳是目前應用最廣泛的一種電泳技術，區(qū)帶電泳的支持介質常用的有濾紙，醋酸纖維薄膜，凝膠等。（一）濾紙電泳（PE）是應用最早的支持介質。優(yōu)點：材料價廉易得，有一定機械強度。缺點：電泳時間長，8～10小時，吸附作用大，造成拖尾而降低了分辨率，目前已淘汰。（二）醋酸纖維薄膜電泳（CAE）1957年Kohn首先采用，醋酸纖維素是將纖維素分子中葡萄糖單體上的羥基乙酰化而形成纖維素醋酸酯，然后用丙酮和水的混合溶劑溶解，涂成均勻薄膜。優(yōu)點：對蛋白質吸附作用很小，分辨率高，區(qū)帶清晰，不吸附燃料，區(qū)帶周圍燃料可完全清掉，檢測靈敏度較高，樣品用量少0.3～2μl，電泳時間短20min～1h，可透明，便于用光密度掃描儀定量。缺點：有輕度電滲作用，吸水性較差，較脆。（三）瓊脂糖凝膠電泳（AGE）瓊脂糖是從瓊脂中分離得到的一種多糖。主要由半乳糖和L-3，6-脫水半乳糖構成。常用濃度0.5～1.0%。優(yōu)點：吸附作用，電滲作用很小，故分辨率重現(xiàn)性好，應用廣，同工酶，脂蛋白，免疫電泳，樣品用量少0.6～3.0μl，電泳時間短30min～1h。透明度好，電泳后可直接掃描定量，也可烘干制成薄膜。缺點：電泳完畢后區(qū)帶易擴散，可及時固定。點樣方法，挖孔法，濾紙插入法。（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是一種人工合成的高分子材料，60年代新用于電泳分析，能將血清蛋白分為20多種組成。1.優(yōu)點：（1）具有分子篩作用，分離效果好。（2）化學穩(wěn)定性高，是一種穩(wěn)定的親水膠體。（3）幾乎沒有吸附和電滲作用。（4）機械強度好，無色透明，可直接光密度掃描。（5）可調節(jié)凝膠孔徑以適合不同分子量的分離。2.聚合丙烯酰胺（Acr）+甲義丙烯酰胺（Bis）聚丙烯酰胺單體交聯(lián)劑化學摧化過硫酸銨-TEMED（四甲基乙二胺）系統(tǒng)引發(fā)劑加速劑加速劑TEMED促使引發(fā)劑過硫酸銨形成自由基，自由基與Acr接觸，使Acr單體形成自由基而活化，引發(fā)聚合，聚合速度與pH、單體濃度、溫度有關。光催化核黃素-TEMED系統(tǒng)，核黃素經光照被還原成無色核黃素，在和痕量氧的條件下，無色核黃素又被氧化成核黃素自由基，使Acr活化，從而引發(fā)聚合。優(yōu)點：核黃素用量少（10mg/l），對樣品分析無影響，聚合時間可通過調節(jié)光照時間，強度來控制。3.孔徑與機械強度凝膠孔徑由凝膠總濃度和交聯(lián)度決定。凝膠總濃度T（g/dl）表示100ml凝膠中Acr和Bis的總克數(shù)，T值越大，孔徑越小。交聯(lián)度C（%）表示交聯(lián)劑Bis占凝膠總濃度T的百分比，C值越大，孔徑越小。T值固定不變時，C值在5%時，凝膠孔徑最小，大于或小于5%，孔徑都會增大。常用標準膠T=7.5g/dl，孔徑約5nm。凝膠的機械強度、彈性、透明度全要取決于T及Acr與Bis的比值。通常要求T為2%～5%Acr/Bis=205%～10%Acr/Bis=4015%～20%Acr/Bis=125～2004.分類圓柱型根據(jù)凝膠的形狀：水平式平板型垂直式連續(xù)（均相），操作方便。根據(jù)凝膠系統(tǒng)和緩沖液組成不連續(xù)（多相），分離效果好。5.分離原理聚丙烯胺凝膠電泳大多屬于不連續(xù)電泳。（1）兩種不同孔徑的凝膠系統(tǒng)；（2）電泳過程中形成不均勻不連續(xù)系統(tǒng)上層大孔徑濃縮膠T2~3g/dl、Tris-HCL、pH6.7。下層小孔徑分離膠，T5～10g/dl，Tris-HCL，pH8.9。電極緩沖液Tris-甘氨酸pH8.3。（3）電極槽，兩層凝膠中的緩沖液pH和組成不同。高分辨率主要是由于下面三種效應1.樣品濃縮效應Cl－遷移率最大快離子，解離度最小的甘氨酸離子遷移率最小慢離子。蛋白質離子介于兩之間，快離子與慢離子之間形成低導電區(qū)，有較高的電位梯度，促進蛋白質和慢離子的移動，使蛋白質樣品被壓縮為一薄層。2.分子篩效應蛋白質進入分離膠，由于凝膠有一定的孔徑，不同的蛋白質分子大小不同，受到的阻力不同，小分子受阻力小，走在前面，大分子受阻力大，走在后面。3.電荷效應同一般電荷。五、蛋白質區(qū)帶的定性和定量分析（一）蛋白質區(qū)帶的染色蛋白質電泳分離后可以直接用紫外光密度掃描儀定量（利用蛋白質對280nm紫外光的吸收），但需專門的儀器，故臨床上一般采用染色來進行定性或定量分析。蛋白質染色劑大多是陰離子燃料，易與蛋白質陽離子結合，因此在pH〈pI的酸性溶液中較強。常用的染色劑有氨基黑10B，溴酚藍，麗春紅S。（二）蛋白質區(qū)帶的定性分析經染色后，首先應仔細觀察有無異常區(qū)帶。如多發(fā)性骨髓瘤病人有大量單克隆蛋白質（主要是IgG或IgA）電泳時可在β和γ之間呈現(xiàn)一條區(qū)帶，稱為M區(qū)帶。（三）蛋白質區(qū)帶的定量分析蛋白質電泳的定量分析通常以各區(qū)帶占總量的百分率表示如同時測定了蛋白質總量，也可換算成各組分的絕對量（g/L）表示。如血清蛋白質電泳經氨基黑10B染色A：66%α1：3%α2：7%β：10%γ：15%總蛋白75g/L49.5g/L2.25g/L5.25g/L7.25g/L11.25g/L1.光密度儀直接掃描法透明的電泳圖譜可用光密度儀直接掃描得出各組分的百分率。操作簡便，迅速，誤差小，結果較準確。2.洗脫比色法染色后將各區(qū)帶分別剪下侵入適當?shù)娜軇┲?，將蛋白質吸附的染料全部洗脫，然后進行比色，求出各組分的百分含量。操作繁瑣，費時，準確度不如光密度儀直接掃描法。六、電泳新技術簡介（一）等電聚焦電泳（IEFE）是利用具有線性pH梯度的兩性電解質為載體，分離等電點不同的蛋白質等兩性分子的一種電泳新技術。其分辨率可達0.01pH單位，特別適用于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質分子。正常人血清蛋白質采用此法可分出50多條區(qū)帶。1.基本原理在電泳系統(tǒng)中建立一個從正極到負極，pH由低到高的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度。處于這一系統(tǒng)的各種蛋白質，根據(jù)各自pI與所處環(huán)境pH值的差別帶上正電或負電，電泳時逐漸靠近與其pI相同的pH位點，而不斷失去凈電荷，直至達到pH=pI，凈電荷為零時，不再受電場力的作用，而達到聚焦。基本條件：（1）建立一個穩(wěn)定、重復性良好的連續(xù)pH梯度。（2）有一個抗對流的材料，防止已分離樣品重新混合。（3）電泳后有適當?shù)姆椒▉龛b定分離的區(qū)帶。2.pH梯度的建立能建立穩(wěn)定pH梯度的兩性電解質是一種多羧基、多氨基的脂肪族化合物。如瑞典LKB公司生產的商品名為“Ampholine”的，它由丙烯酸和多乙烯多胺合成。理想的兩性電解質載體應具備以下特點：（1）各成分的導電能力彼此相近。（2）各成分的pI彼此接近，并在pI附近有良好的緩沖能力。（3）分子量小，易于與樣品分離。（4）對280nm紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品測定。（二）雙向電泳是先把樣品從一個方向進行電泳分離，然后在與其成90。方向上進行第二次電泳分離。如第一次電泳可以其電荷性質為基礎；第二次電泳則以分離量不同進行分離。通常將等電聚焦電泳為第一相電泳，以SDS-聚丙烯酰胺凝膠為第二相電泳。（三）轉移電泳又稱印跡轉移電泳。此項技術是1975年由E，M，Southern在進行DNA片段的研究中首先使用。將凝膠電泳所得區(qū)帶經吸附作用轉移到硝酸纖維薄膜（NC膜）上，由于轉移過程類似于將墨跡吸到吸水紙上，故稱為(Southernbolt印跡法)。1977年Alwine將此法應用于RNA研究，取名Nerthernblot。1979年Towbin又將其擴展到蛋白質研究，將其風趣的稱為Westernblot.1981年，Reinhart等將等電聚焦電泳后的蛋白質轉移到NC上，取名為Easternblot.轉移電泳技術包括三個步驟1.采用凝膠電泳分離蛋白質或核酸，電泳方式有單向，雙相，梯度，等電聚焦等。2.轉移電泳，將已分離的蛋白質或核酸經電泳轉移到NC或重氮芐氨基甲基紙上，前者為非共價吸附，后者為共價結合。3.鑒定膜上的蛋白質或核酸，方法有，放射自顯影，酶標免疫化學等。轉移電泳的優(yōu)點，對分離蛋白質的鑒定，比在凝膠上的操作要簡便，轉移電泳實際上是將凝膠電泳的高分辨率與放射標記或酶標等免疫化學法的高靈敏度結合起來。第四節(jié)層析技術層析法又稱色譜法、色層分離法，1906年由俄國植物學Tswett首先用于植物色素的分離提取而得名。目前，層析技術發(fā)展迅速已成為生物化學、分子生物等及生物工程等學科常用的分離分析方法，如氣體、無機離子、AA、糖類、脂類、Vit、藥物，以及大分子物質蛋白質、核酸等物質的分析。一、層析的概念與分類（一）基本概念層析法是利用待分離物質中不同組分的某些與理化性質（在兩相中溶解、吸附、親和作用等）的差異而建立起來的一種分離技術。所有的層析系統(tǒng)均由因定相和流動相組成，固定相是固體物質或固定于固體物質的液體，流動相是可以流動的物質，如水、某些溶劑和氣體。當待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于混合物中各組分的理化性質的差異，它們在固定相和流動相中的分配比不同，隨溶媒的向前移動，各組分不斷地在兩相中進行再分配，與固定相作用力越弱的組分，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動速度快，反之，與固定相作用強的組分，則向前移動速度慢，由于產生了差速遷移而達到分離目的，如紙層析、薄層層析、薄膜層析、層析移動的速度用比移值或阻滯因子（Rf）來表示。（二）層析法分類液固層析法（LSC）液液層析法（LLC）1.按兩相所處的狀態(tài)不同分類按流動相的狀態(tài)不同，再按固定相的狀態(tài)不同。液固層析法（LSC）液液層析法（LLC）液相層析法（LC）氣固層析法（GSC）氣液層析法（GLC）層析法氣固層析法（GSC）氣液層析法（GLC）氣相層析法（GC）2.按層析分離機制（分離原理）分類1）吸附層析法（AC）固定相是固體吸附劑，利用各組分在吸附劑表面吸附能力的差別而分離。2）分配層析法（PC）固定相是液體，利用各組分在流動相和靜止液相（固定相）中的分配系數(shù)不同的分離。3）離子交換層析法（IEC）固定相是離子交換劑，利用各組分對離子交換劑親和力的不同而分離。4）凝膠層析法（GPC）固定相為多孔性凝膠，利用各組分分子大小、形狀不同在凝膠中受阻滯的程度不同而分離。5）親和層析法（affinitychromatogrphy）利用各組分生物學特殊性不同而建立的一種層析方法，固定相只能和一種待分離成分專一結合，使其與其他物質分離，如利用抗原、抗體的結合來分離相應的抗原或抗體。3.按操作形式不同分類1）柱層析法（columnchromatogrphy，CC）固定相裝于柱內，使樣品沿一個方向移動向到分離。2）薄層層析法（thinleyezchromatogrphy，TLC）將顆粒狀的固定均勻地鋪在薄板上，點樣后用流動相展開。3）紙層析法（paperchromatogrphy，PC）用濾紙作為液體的載體，點樣后用流動相展開。4）薄膜層析法（thinfilmchromatogrphy，TFC）用高分子有機吸附劑制成薄膜，以類似紙層析的方法進行物質的分離。（三）層析中的常用術語1.保留值（retentionvalue）表示標本中各組分在層析柱中停留的時間的長短或組分流出時所需流動相體積的多少，用來描述層析峰在層析圖上的位置。2.層析峰區(qū)域寬度常用的表示法有三種（1）標準偏差σ：當峰呈對稱的正態(tài)分布時，σ是峰高0.607處峰寬度的1/2。（2）半峰高寬度（W1/2）：層析峰高一半處的峰寬度，W1/2=2.354σ。（3）層析峰底寬（W）：是指通過層析峰兩拐點作切線交于基線上的截距。W=4σ。3.分離度（resolution）是定量描述相鄰兩組分在層析柱內分離情況的指標，可峰底分離度、峰半高寬分離度和峰高分離度等不同方式表示，峰底分離度等于相鄰兩組分層析峰保留值之差與層析峰平均底寬之比。是國內外廣泛采用的一個分離度指標，用R表示。4.比移值（Rf）是溶質譜帶中心移動的距離與流動相移動的距離之比。5.分配系數(shù)在層析分離中，物質既進入固定相，又進入流動相，此過程稱分配過程。物質在固定相和流動相達到平衡時，它在兩相中平均容度的比值稱分配系數(shù)。二、層技術在生化檢驗中的應用（一）薄層層析在生化檢驗中的應用薄層層析根據(jù)固定相的不同有吸附、分配和離子交換等技術，以吸附薄層層析為例說明其基本方法。1.固定相與流動相及選擇（1）固定相為吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素等，固定相選擇應考慮的因素。①酸堿性如硅膠是弱酸性吸附劑，適合于酸性和中性物質的分離，氧化鋁是微堿性吸附劑，適合于堿性和中性物質分離，硅藻土、纖維素屬中性吸附劑。②吸附能力常稱為活度，主要受含水量的影響，含水量高活度低，從強到弱分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5級，活度強吸附作用強，一般分離水溶性物質活度弱些，而分離脂溶性物質活度要強些。③顆粒狀大小為了使每次測定的Rf值恒定，吸附劑要求顆粒大小均勻、適當，顆粒細、吸附能力強，展開慢、顆粒粗、吸附能力弱，展開快、分離效果差，一般顆粒直徑為，無機類0.07～0.1mm（150～200目），有機類0.1～0.2（70～140目）。（2）流動相即展開劑，展開劑的選擇是薄層層析中又一關鍵，一般極性大的化合物需用極性大的展開劑。2.薄層層析法操作技術（1）制板常用方法有三種。干法、濕法和燒結法。干法制板（軟板），常用厚度0.25～3.0mm，方法簡便，但不堅固易吹散，只能水平放置，點樣，顯色需加小心；濕法制板（硬板），加入一定粘合劑（石膏、羧甲基纖維素鈉、淀粉等）；燒結法制板，吸附劑加入一定量無水乙醇調成糊狀制板，然后放入高溫爐中加熱至750℃、60～75min，機械強度好，可反復使用。制成的板要求涂布均勻、光潔，晾干、活化。（2）點樣用毛細玻管點樣，斑點直徑約2mm，板據(jù)需要可點2～3次，點樣處距下端1.5cm。（3）展開將層析板放入加有展開劑的層折槽中，立即蓋嚴，展開距離10cm取出，劃出溶劑前沿線。（4）顯色，等溶劑揮發(fā)后，用相應顯色劑顯色。3.薄層層折法的定性及定量定性分析主要依據(jù)Rf值，與標準液的Rf比較。定量采用專用的薄層掃描儀，測量斑點的深淺、大小，并與標準液斑點比較。4.應用主要用于AA、肽、核昔酸、糖類、脂類和激素生物質的分離和鑒定。（二）凝膠層折在生化檢驗中的應用又稱凝膠過濾、分子篩層折、排阻層折。固定相是多孔凝膠，商品凝膠是干燥顆粒，當吸附一定量液體后溶脹成一種柔軟而富有彈性的物質，由于凝膠有一定孔徑，對分子大小不同的組分的阻滯作用不同。在被分離物質中，大分子組分由于直徑大，不易進入凝膠孔徑內，隨流動相向前移快，小分子組分則能進入凝膠微孔內，向前移動慢，而達到分離。1.凝膠的種類和性能常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠。（1）葡聚糖凝膠將右旋葡萄糖的線性聚合長鏈間，用交聯(lián)劑1-氯代-2、3-環(huán)氧丙烷通過醚橋交聯(lián)而成。穩(wěn)定性好，不溶于水，但在酸性條件下糖苷鍵易水解，由于分子中含有大量羥基，因此有很大的親水性，吸水后溶脹成透明，而且有三維空間網狀結構的彈性顆粒，孔隙的大小與交聯(lián)度有關，交聯(lián)度大，孔隙小、吸水量小，商品膠型號多以吸水量10倍表示，如每克干膠吸水量為2.5g，即為G-25型，國外最著名的交聯(lián)葡聚糖商品名為Sephadex。（2）聚丙烯酰胺凝膠層析用的聚丙烯酰胺凝膠商品名為生物凝膠-P（Bio-gel-P），是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis），經自由基引發(fā)聚合而成，型號有P-2，P-4，P-6，P-10，P-30，P-60，P-100，P-150，P-200，P-300，可分離子肽及蛋白質量，100～40萬。具有隋性，但在酸堿性較強的情況下不如葡聚糖凝膠穩(wěn)定，適用pH范圍2-11，使用范圍與效果和葡聚糖凝相似。（3）瓊脂糖凝膠屬于天然凝膠，從瓊脂中提取結構為D-半乳糖和L-3.6-脫水半乳糖的殘基交替所組成的多聚糖，常用商品名是Sepharose和Bio-gel-A，型號有Sepharose2B、4B、6B，數(shù)字表示瓊脂糖含量（W/W）。機械強度大，分子量使用范圍寬（達108），吸附生物高分子能力最低，常用于高分子物質的分離，但穩(wěn)定性很差，使用條件限制較嚴（T0～40℃、pH4～9）。2.凝膠層析中應注意的幾個問題。（1）柱直徑與長度凝膠層析一般為柱層析，柱直徑一般在1～5cm，長度L與直徑D比值L/D一般為7～10，但對移動緩慢的物質宜30～40。（2）凝膠的選擇一般要以大分子物除去小分子物質時，如從蛋白質溶液中去除鹽和AA，可選用交聯(lián)度大的，如葡聚糖G-25或G-50，反之欲將小分子物質收集濃縮而去除大分子，則應選用交聯(lián)度小的，如G-100或G-150。（3）樣品的濃度和體積大分子物質溶液粘度隨濃度增大而增大，而影響分離效果，一般將粘度控制在5cp（厘泊）以下，樣品體積小于凝膠總體積的5%～10%。3.凝膠層析的應用（1）去鹽高分子（如蛋白質核膠、多糖等）溶液中的低分子雜質，可用凝膠層折法除去，這一過程稱為去鹽。（2）高分子溶液的濃縮如蛋白質的稀溶液需要濃縮時，可加入葡聚糖G-25或G-50的干膠，蛋白質稀溶液中的水份及小分子物質進入凝膠顆粒內部孔隙中，蛋白質則在顆粒外，將溶脹后的凝膠分離除去，得到濃縮的蛋白質濃液。（3）用于分離提純廣泛用于酶、蛋白質、AA、核苷酸、多糖、激素、抗生素、生物堿等物質的分離提純。（4）用于測定高分子物質的分子量用一系列已知分子量的標準樣品，放入同一凝膠柱，在同一條件下層折，測定每種組分的保留體積，并以保留體積對分子量的對數(shù)作圖，得到分子量標準曲線。（三）高效液相層析在生化檢驗中的應用高效液相層析（highperformamceliquidchromatogaphy，HPLC），又稱為高效液相色譜法，始于60年代末，是在經典液相層析法基礎上引進氣相層析理論發(fā)展起來的，它具有氣相層析的全部優(yōu)點，同時克服了氣相層析的缺點，具有分離能力強，測定靈敏度高（ng水平），應用范圍廣（極性到非極性、小分子到大分子、熱穩(wěn)定與不穩(wěn)定化合物），在室溫下進行等優(yōu)點。HPLC裝置儀器化，它包括輸液系統(tǒng)、層析柱和檢測系統(tǒng)三部分，輸液系統(tǒng)主要是一高壓泵將流動相輸入，層析柱按分離機理不同分為：吸附、分配、離子交換等類型，檢測器應用最多的是紫外吸收檢測器、熒光檢測器、信號送入數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或記錄儀。在臨床生化檢驗中HPLC已用于類固醇激素、兒茶酚胺的測定，同工酶的分離，治療藥物的監(jiān)測和篩選。第六節(jié)自動生化分析技術臨床生化自動分析儀，就是把生化分析中的取樣、加試劑、去干擾、混合、保溫反應、檢測、結果計算、顯示和打印，以及清洗等步驟自動化的儀器。它完全模仿并代替了手工操作。不僅提高了工作效率，而且減少了主觀誤差，穩(wěn)定了檢驗質量。由于這類儀器一般都具有靈敏、準確、快速、節(jié)省和標準化等優(yōu)點，使得生化自動分析儀在臨床生化分析中得到了廣泛應用。一、自動生化分析儀的類型（一）管道式分析儀管道式分析儀的特點是測定項目相同的各待測樣品與試劑混合后的化學反應，是在同一管道中經流動過程完成的。這類儀器一般可分為空氣分段系統(tǒng)式和非分段系統(tǒng)式。所謂空氣分段系統(tǒng)是指在吸入管道的每一個樣品、試劑以及混合后的反應液之間，均由一小段空氣間隔開；而非分段系統(tǒng)是靠試劑空白或緩沖液來間隔每個樣品的反應液。整套儀器是由樣品盤、比例泵、混合管、透析器、恒溫器、比色計和記錄器幾個部件所組成。空氣分段系統(tǒng)式自動生化分析儀結構示意圖將幾個單通道管道式分析儀結合起來，對一個樣品同時測定幾個項目。這類大型分析儀至今仍有使用者。它對每個樣品可同時分析12個項目，每小時可分析60個樣品。（二）分立式分析儀所謂分立式，是指每個待測樣品與試劑混合后的化學反應分別在各自的反應杯中完成。分立式分析儀與管道式分析儀在結構上的主要區(qū)別為：前者各個樣品和試劑在各自的反應杯中起反應，而后者是在同一管道中起反應；前者采用由采樣器和加液器組成的稀釋器來取樣和加試劑，而不用比例泵；前者一般沒有透析器，如要除蛋白質等干擾，需另行處理。恒溫器必須能容納需保溫的試管和試管架，所以比管道式分析儀的體積要大。除此以外，其它部件與管道式的基本相似。分立式分析儀的基本結構如圖。分立式自動生化分析儀結構示意圖（三）離心式分析儀離心式分析儀是1969年以后發(fā)展起來的一種分析儀，由Anderson設計，其特點是化學反應器裝在離心機的轉子位置，該圓形反應器稱為轉頭，先將樣品和試劑分別置于轉頭內，當離心機開動后，圓盤內的樣品和試劑受離心力的作用而相互混合發(fā)生反應，最后流入圓盤外圈的比色槽內，通過比色計進行檢測。這類分析儀特點是在整個分析過程中，各樣品與試劑的混合、反應和檢測等每一步驟，幾乎都是同時完成的，不同于管道式和分立式分析儀的“順序分析”，而是基于“同步分析”的原理而設計。轉頭轉動時，各比色槽被輪流連續(xù)監(jiān)測，如轉速為960r/min，轉頭上有20個比色槽，則每分鐘可接受19200個電信號，配有微機進行控制和數(shù)據(jù)處理。離心式自動生化分析儀結構示意圖離心式分析儀主要由兩部分組成，一為加樣部分，二為分析部分。加樣部分包括樣品盤、試劑盤、吸樣臂（或管）、試劑臂（加液器）和電子控制部分（鍵盤和顯示器等）。加樣時轉頭置于加樣部分。加樣完畢后將轉頭移至離心機上。分析部分，除安裝轉頭的離心機外，還有溫控和光學檢測系統(tǒng)，并有微機信息處理和顯示系統(tǒng)。（四）干片式分析儀干片式分析儀是80年代問世的。首先EastmanKodak公司以其精湛的化學工藝造出了測定血清中血糖、尿素、蛋白質、膽固醇等的干式試劑片。當加上定量的血清后，在干片的前面產生顏色反應，用反射光度計檢測即可進行定量。這類方法完全去除了液體試劑，故稱干化學法。干片試劑結構示意圖見圖。干片不僅包括試劑，也可由電極構成，所以這類分析儀也可進行電解質的測定。這類干片均為一次性使用，故成本較貴。（五）半自動生化分析儀半自動生化分析儀指在分析過程中的部分操作（如加樣、保溫、吸入比色、結果記錄等某一步驟）需手工完成，而另一部分操作則可由儀器自動完成。這類儀器的特點是體積小，結構簡單，靈活性大，既可分開單獨使用，又可與其他儀器配套使用，價格便宜，一般在分立式分析儀中多常見。這類儀器一般不受試劑、方法的限制，國產試劑、自己配制的試劑及自行設計的方法均可在儀器上進行檢測，而且由于儀器的體積小、重量輕、操作方便、反應迅速，尤其適合中、小型檢驗單位作為日常生化檢測的主要儀器，也適用于作急診生化檢測及外出執(zhí)行任務時使用。二、自動生化分析的方法臨床生化常用方法根據(jù)其測定的原理可分為兩類。一類方法是物理方法，測定是物質固有的物理特性。另一類是物理化學方法，也就是將所測定物質進行一些化學轉化后再進行測定。動態(tài)法是在所測定的物質濃度在不斷變化中，由傳感器獲得相應的改變的信號進行計算的方法。平衡法是由傳感器得到相對不變的信號進行計算的方法。（一）平衡法（終點法）指在樣本中加入試劑后，反應達到平衡時測定吸光度值計算待測物質濃度的方法。這類方法的特點是被測物質在反應過程中完全被轉化或消耗掉，即達到反應的終點。通常這類方法操作簡單，一般不需要作標準管，通過一些已知的理化常數(shù)，例如摩爾吸光系數(shù)等不難將結果計算出來。其缺點是反應時間較長，特別不適合于離心式自動分析儀。還有少數(shù)酶反應，底物并未完全消耗掉，只是達到一個動態(tài)平衡，此時，往往需要同時作標準管。（二）固定時間法（二點法）在反應過程中測定兩個時間點的吸光度（A1、A2），利用兩者差值（A2－A1）計算待測物質濃度的方法。固定時間法在自動分析儀中的應用，有助于我們解決反應的特異性問題，最明顯的例子就是苦味酸法測肌酐和溴甲酚綠法測白蛋白。人們早就知道很多物質如維生素C、乙酰乙酸、葡萄糖、果糖以及某些藥物也能和苦味酸呈色。近年來發(fā)現(xiàn)這些干擾物質呈色較慢，提出用自動生化儀只測定開始一分鐘的反應，明顯提高了苦味酸法測肌酐的特異性。用溴甲酚綠測白蛋白法，此法由于簡單易行，但隨即發(fā)現(xiàn)一部分球蛋白如α球蛋白也能和溴甲酚綠結合，但這類反應比較遲，所以目前更多地使用自動分析儀測定開始一分鐘的反應來計算白蛋白量。（三）動態(tài)法（速率法）在反應過程中進行多點測定其吸光度，計算出單位時間內吸光度的變化量，通過吸光度的變化量計算待測物質濃度的方法。動態(tài)法由于是多點測定，故結果的準確性較高，因此，動態(tài)法在自動分析儀中的應用十分廣泛。三、自動生化分析儀實驗參數(shù)的設置一般自動分析儀有12個主要數(shù)據(jù)，即波長、溫度、標本及試劑量、空白時間（Tb）、開始收集實驗數(shù)據(jù)時間（Ti）、實驗數(shù)據(jù)收集窗時間（TW）、實驗數(shù)據(jù)收集完成時間（Td）和最后時間（Tf）、速率時間（Tr）、線性限度（L）、異常吸收率（ABN）、曲線擬合、濃度因素（F）。這些參數(shù)都是通過方法學的研究之后，根據(jù)反應的具體情況加以確定的。（一）波長根據(jù)顏色反應的光吸收曲線選擇最大吸收峰波長作為主波長，如果在最大吸收峰處有干擾物質，可選擇次最大吸收峰波長作為主波長。為了消除干擾物質的干擾，一般設有副波長（輔助波長），選擇的原則是干擾物質主波長和輔助波長處有相同的光吸收，測定時用主波長的吸光度減去輔助波長的吸光度，可消除干擾物質的干擾。（二）溫度自動生化分析儀一般均有25℃、30℃和37℃三種溫度設置，IFCC推薦選用30℃。（三）樣品量及試劑量可根據(jù)手工法按比例縮減或者重新設計。要考慮到檢測靈敏度、線性范圍，盡可能將樣品稀釋倍數(shù)大些，以降低樣品中其它成分的影響。（四）分析時間的確定用高、中、低濃度的標準液進行實驗用研究模式，進行酶促反應時間曲線或反應速度時間曲線的觀察，根據(jù)吸收率動態(tài)變化的具體數(shù)據(jù)，確定有關的分析時間。（五）線性判斷標準（線性限L）要根據(jù)實驗結果選擇一個適當?shù)奈舛茸兓秶鳛榫€性判斷標準，當吸光度在線性范圍時，可認為吸光度和物質濃度成正比。當吸光度不在線性范圍時，可通過增減樣品的量使其吸光度達到線性范圍內。四、自動生化分析儀的性能評價目前，臨床生化自動分析儀的規(guī)格型號很多，生產廠也很多，隨著技術的革新和應用的要求，在性能和結構上都有了很大改進和發(fā)展。正確評價與合理選用這些儀器十分重要。（一）自動化程度對一臺生化分析儀來說，自動化程度越高，說明儀器功能越強。儀器的自動化程度高低取決于儀器所使用微處理機的功能大小，根據(jù)儀器計算機功能的不同，自動化分析儀一般可分為全自動和半自動兩種。全自動分析儀比較適合于樣品量多，化驗項目多，人力相對不足的綜合性大醫(yī)院的臨床化驗室應用。而對于樣品數(shù)量、化驗項目少的小醫(yī)院或?？漆t(yī)院使用半自動分析儀則更為合適。（二）分析效率這里的分析效率，系指在測定方法相同的情況下不同分析儀的分析速度。顯然，分析速度決定于一次測定中可測樣品多少和可測項目的多少。對不同類型的分析儀，由于其結構和設計原理的不同，微機應用程序不同造成自動化程度的差異，也直接影響到分析儀的分析效率。離心式分析儀采用同步分析原理設計，測定中所有樣品的混合、反應及比色幾乎同時進行。另外，其加樣部分與分析部分又可各自獨立工作，在一批樣品分析的同時，可進行另一批樣品的加樣，節(jié)約了時間。因此，這類分析儀的分析速度快于其它類型。當然這也不是絕對的，當樣品很少時，甚至只有一個樣品，但為了保持離心機的平衡，也必須在轉頭的空槽中用蒸餾水一一加入方可。這樣分析顯然還不如用半自動的分析儀更為快一些。（三）應用范圍自動生化分析儀的應用范圍包括可測試的生化項目、其它項目、反應的類型及分析方法的種類等。應用范圍廣的分析儀不僅能測多種臨床生化檢驗指標，而且還可進行藥物監(jiān)測和各種特異蛋白的分析、微量元素測定等。分析方法除了分光光度法外，還能進行濁度比色法、離子選擇性電極法、熒光法等測定。既能用終點法，又可用動態(tài)法測定。它可使酶免疫技術、固相酶技術得以應用，從而在科研和技術生產開發(fā)工作中，發(fā)揮更大的效益。有些分析儀采用了獨特的雙波長光路設計，可消除“背景噪聲”，排除樣品中溶血、脂血及膽紅素等成分的干擾，精確靈敏，在一些特殊的測量分析中很有用。通常小型的、程序固定式的半自動化的分析儀，其工作應用范圍相對較窄，選擇時應予注意。（四）分析準確度生化分析儀測量的準確度愈高愈好。準確度取決于各部件（加液、溫控、波長、記時等）的加工精確度及其精確的工作狀態(tài)。如有的分析儀采用樣品液體感應探針，準確吸樣，使樣品攜帶率低于0.5％，不僅能準確地吸取微量樣品，而且還能充分混合樣品及試劑，使測量結果精確度提高。另外，克服分析儀中交叉污染，也是保證測定結果準確的重要環(huán)節(jié)。生化分析儀一般對取樣探針有自動清洗裝置，從而保證測試結果的準確率。除此之外，儀器的壽命、儀器的維修保養(yǎng)方式和途徑、測定所需樣品和試劑的數(shù)量，以及配套試劑盒的供應等，特別是儀器的性能價格比，在選用時都應一并考慮，使選用的分析儀能夠物盡其用，且又經濟實惠，能夠取得最大的效益。附錄資料：不需要的可以自行刪除

Excel表格的基本操作教程Excel快捷鍵和功能鍵Ctrl組合快捷鍵按鍵說明Ctrl+(取消隱藏選定范圍內所有隱藏的行。Ctrl+)取消隱藏選定范圍內所有隱藏的列。Ctrl+&將外框應用于選定單元格。Ctrl+_從選定單元格刪除外框。Ctrl+~應用“常規(guī)”數(shù)字格式。Ctrl+$應用帶有兩位小數(shù)的“貨幣”格式（負數(shù)放在括號中）。Ctrl+%應用不帶小數(shù)位的“百分比”格式。Ctrl+^應用帶有兩位小數(shù)的“指數(shù)”格式。Ctrl+#應用帶有日、月和年的“日期”格式。Ctrl+@應用帶有小時和分鐘以及AM或PM的“時間”格式。Ctrl+!應用帶有兩位小數(shù)、千位分隔符和減號(-)（用于負值）的“數(shù)值”格式。Ctrl+-顯示用于刪除選定單元格的“刪除”對話框。Ctrl+*選擇環(huán)繞活動單元格的當前區(qū)域（由空白行和空白列圍起的數(shù)據(jù)區(qū)域）。在數(shù)據(jù)透視表中，它將選擇整個數(shù)據(jù)透視表。Ctrl+:輸入當前時間。Ctrl+;輸入當前日期。Ctrl+`在工作表中切換顯示單元格值和公式。Ctrl+'將公式從活動單元格上方的單元格復制到單元格或編輯欄中。Ctrl+"將值從活動單元格上方的單元格復制到單元格或編輯欄中。Ctrl++顯示用于插入空白單元格的“插入”對話框。Ctrl+1顯示“單元格格式”對話框。Ctrl+2應用或取消加粗格式設置。Ctrl+3應用或取消傾斜格式設置。Ctrl+4應用或取消下劃線。Ctrl+5應用或取消刪除線。Ctrl+6在隱藏對象、顯示對象和顯示對象占位符之間切換。Ctrl+7顯示或隱藏“常用”工具欄。Ctrl+8顯示或隱藏大綱符號。Ctrl+9隱藏選定的行。Ctrl+0隱藏選定的列。Ctrl+A選擇整個工作表。如果工作表包含數(shù)據(jù)，則按Ctrl+A將選擇當前區(qū)域。再次按Ctrl+A將選擇整個工作表。當插入點位于公式中某個函數(shù)名稱的右邊時，則會顯示“函數(shù)參數(shù)”對話框。當插入點位于公式中某個函數(shù)名稱的右邊時，按Ctrl+Shift+A將會插入參數(shù)名稱和括號。Ctrl+B應用或取消加粗格式設置。Ctrl+C復制選定的單元格。如果連續(xù)按兩次Ctrl+C，則會顯示MicrosoftOffice剪貼板。如果工作表包含數(shù)據(jù)，則按Ctrl+A將選擇當前區(qū)域。再次按Ctrl+A將選擇整個工作表。當插入點位于公式中某個函數(shù)名稱的右邊時，則會顯示“函數(shù)參數(shù)”對話框。當插入點位于公式中某個函數(shù)名稱的右邊時，按Ctrl+Shift+A將會插入參數(shù)名稱和括號。Ctrl+B應用或取消加粗格式設置。Ctrl+C復制選定的單元格。如果連續(xù)按兩次Ctrl+C，則會顯示MicrosoftOffice剪貼板。Ctrl+D使用“向下填充”命令將選定范圍內最頂層單元格的內容和格式復制到下面的單元格中。Ctrl+F顯示“查找”對話框。按Shift+F5也會顯示此對話框，而按Shift+F4則會重復上一次“查找”操作。Ctrl+G顯示“定位”對話框。按F5也會顯示此對話框。Ctrl+H顯示“查找和替換”對話框。Ctrl+I應用或取消傾斜格式設置。Ctrl+K為新的超鏈接顯示“插入超鏈接”對話框，或為選定的現(xiàn)有超鏈接顯示“編輯超鏈接”對話框。Ctrl+L顯示“創(chuàng)建列表”對話框。Ctrl+N創(chuàng)建一個新的空白文件。Ctrl+O顯示“打開”對話框以打開或查找文件。按Ctrl+Shift+O可選擇所有包含批注的單元格。Ctrl+P顯示“打印”對話框。Ctrl+R使用“向右填充”命令將選定范圍最左邊單元格的內容和格式復制到右邊的單元格中。Ctrl+S使用其當前文件名、位置和文件格式保存活動文件。Ctrl+U應用或取消下劃線。Ctrl+V在插入點處插入剪貼板的內容，并替換任何選定內容。只有在剪切或復制了對象、文本或單元格內容后，才能使用此快捷鍵。Ctrl+W關閉選定的工作簿窗口。Ctrl+X剪切選定的單元格。Ctrl+Y重復上一個命令或操作（如有可能）。Ctrl+Z使用“撤消”命令來撤消上一個命令或刪除最后鍵入的條目。顯示了自動更正智能標記時，按Ctrl+Shift+Z可使用“撤消”或“重復”命令撤消或恢復上一次自動更正操作。功能鍵按鍵說明F1顯示“幫助”任務窗格。按Ctrl+F1可關閉并重新打開當前任務窗格。按Alt+F1可創(chuàng)建當前范圍中數(shù)據(jù)的圖表。按Alt+Shift+F1可插入新的工作表。F2編輯活動單元格并將插入點放在單元格內容的結尾。如果禁止在單元格中進行編輯，它也會將插入點移到編輯欄中。按Shift+F2可編輯單元格批注。F3將定義的名稱粘貼到公式中。按Shift+F3將顯示“插入函數(shù)”對話框。F4重復上一個命令或操作（如有可能）。按Ctrl+F4可關閉選定的工作簿窗口。F5顯示“定位”對話框。按Ctrl+F5可恢復選定工作簿窗口的窗口大小。F6切換到已拆分（“窗口”菜單，“拆分”命令）的工作表中的下一個窗格。按Shift+F6可切換到已拆分的工作表中的上一個窗格。如果打開了多個工作簿窗口，則按Ctrl+F6可切換到下一個工作簿窗口。F7顯示“拼寫檢查”對話框，以檢查活動工作表或選定范圍中的拼寫。如果工作簿窗口未最大化，則按Ctrl+F7可對該窗口執(zhí)行“移動”命令。使用箭頭鍵移動窗口，并在完成時按Esc。F8打開或關閉擴展模式。在擴展模式中，“EXT”將出現(xiàn)在狀態(tài)行中，并且按箭頭鍵可擴展選定范圍。通過按Shift+F8，您可以使用箭頭鍵將非鄰近單元格或范圍添加到單元格的選定范圍。當工作簿未最大化時，按Ctrl+F8可執(zhí)行“大小”命令（在工作簿窗口的“控制”菜單上。按Alt+F8可顯示用于運行、編輯或刪除宏的“宏”對話框。F9計算所有打開的工作簿中的所有工作表。如果先按F9再按Enter（對于數(shù)組公式則按Ctrl+Shift+Enter），則會計算選定的公式部分，并將選定部分替換為計算出的值。按Shift+F9可計算活動工作表。按Ctrl+Alt+F9可計算所有打開的工作簿中的所有工作表，不管它們自上次計算以來是否已更改。如果按Ctrl+Alt+Shift+F9，則會重新檢查相關公式，然后計算所有打開的工作簿中的所有單元格，其中包括未標記為需要計算的單元格。按Ctrl+F9可將工作簿窗口最小化為圖標。F10選擇菜單欄或同時關閉打開的菜單和子菜單。按Shift+F10可顯示選定項目的快捷菜單。按Alt+Shift+F10可顯示智能標記的菜單或消息。如果存在多個智能標記，按該組合鍵可切換到下一個智能標記并顯示其菜單或消息。按Ctrl+F10可最大化或還原選定的工作簿窗口。F11創(chuàng)建當前范圍內數(shù)據(jù)的圖表。按Shift+F11可插入一個新工作表。按Alt+F11將打開VisualBasic編輯器，您可以在其中通過使用VisualBasicforApplications(VBA)來創(chuàng)建宏。按Alt+Shift+F11將打開Microsoft腳本編輯器，您可以在其中添加文本、編輯HTML標記以及修改任何腳本代碼。F12顯示“另存為”對話框。其他有用的快捷鍵按鍵說明箭頭鍵在工作表中上移、下移、左移或右移一個單元格。按Ctrl+箭頭鍵可移動到工作表中當前數(shù)據(jù)區(qū)域（數(shù)據(jù)區(qū)域：包含數(shù)據(jù)的單元格區(qū)域，該區(qū)域周圍為空白單元格或數(shù)據(jù)表邊框。）的邊緣。按Shift+箭頭鍵可將單元格的選定范圍擴大一個單元格。按Ctrl+Shift+箭頭鍵可將單元格的選定范圍擴展到與活動單元格同一列或同一行中的最后一個非空白單元格。當菜單處于可見狀態(tài)時，按向左鍵或向右鍵可選擇左邊或右邊的菜單。當子菜單處于打開狀態(tài)時，按這些箭頭鍵可在主菜單和子菜單之間切換。當菜單或子菜單處于打開狀態(tài)時，按向下鍵或向上鍵可選擇下一個或上一個命令。在對話框中，按箭頭鍵可在打開的下拉列表中的各個選項之間移動，或在一組選項的各個選項之間移動。按Alt+向下鍵可打開選定的下拉列表。Backspace在編輯欄中刪除左邊的一個字符。也可清除活動單元格的內容。Delete從選定單元格中刪除單元格內容（數(shù)據(jù)和公式），而不會影響單元格格式或批注。在單元格編輯模式下，按該鍵將會刪除插入點右邊的字符。End當ScrollLock處于開啟狀態(tài)時，移動到窗口右下角的單元格。當菜單或子菜單處于可見狀態(tài)時，也可選擇菜單上的最后一個命令。按Ctrl+End可移動到工作表上的最后一個單元格，即所使用的最下方一行與所使用的最右邊一列的交匯單元格。按Ctrl+Shift+End可將單元格的選定范圍擴展到工作表上所使用的最后一個單元格（右下角）。Enter從單元格或編輯欄中完成單元格輸入，并（默認）選擇下面的單元格。在數(shù)據(jù)表單中，按該鍵可移動到下一條記錄中的第一個字段。打開選定的菜單（按F10激活菜單欄），或執(zhí)行選定命令的操作。在對話框中，按該鍵可執(zhí)行對話框中默認命令按鈕（帶有突出輪廓的按鈕，通常為“確定”按鈕）的操作。按Alt+Enter可在同一單元格中另起一個新行。按Ctrl+Enter可使用當前條目填充選定的單元格區(qū)域。按Shift+Enter可完成單元格輸入并選擇上面的單元格。Esc取消單元格或編輯欄中的輸入。按該鍵也可關閉打開的菜單或子菜單、對話框或消息窗口。Home移到工作表中某一行的開頭。當ScrollLock處于開啟狀態(tài)時，移到窗口左上角的單元格。當菜單或子菜單處于可見狀態(tài)時，選擇菜單上的第一個命令。按Ctrl+Home可移到工作表的開頭。按Ctrl+Shift+Home可將單元格的選定范圍擴展到工作表的開頭。PageDown在工作表中下移一個屏幕。按Alt+PageDown可在工作表中向右移動一個屏幕。按Ctrl+PageDown可移到工作簿中的下一個工作表。按Ctrl+Shift+PageDown可選擇工作簿中的當前和下一個工作表。PageUp在工作表中上移一個屏幕。按Alt+PageUp可在工作表中向左移動一個屏幕。按Ctrl+PageUp可移到工作簿中的上一個工作表。按Ctrl+Shift+PageUp可選擇工作簿中的當前和上一個工作表?？崭矜I在對話框中，執(zhí)行選定按鈕的操作，或者選中或清除復選框。按Ctrl+空格鍵可選擇工作表中的整列。按Shift+空格鍵可選擇工作表中的整行。按Ctrl+Shift+空格鍵可選擇整個工作表。如果工作表包含數(shù)據(jù)，則按Ctrl+Shift+空格鍵將選擇當前區(qū)域。再按一次Ctrl+Shift+空格鍵將選擇整個工作表。當某個對象處于選定狀態(tài)時，按Ctrl+Shift+空格鍵可選擇工作表上的所有對象。按Alt+空格鍵可顯示Excel窗口的“控制”菜單。Tab在工作表中向右移動一個單元格。在受保護的工作表中，可在未鎖定的單元格之間移動。在對話框中，移到下一個選項或選項組。按Shift+Tab可移到前一個單元格（在工作表中）或前一個選項（在對話框中）。在對話框中，按Ctrl+Tab可切換到下一個選項卡。在對話框中，按Ctrl+Shift+Tab可切換到前一個選項卡。Excel表格的基本操作教程

也許你已經在Excel中完成過上百張財務報表，也許你已利用Excel函數(shù)實現(xiàn)過上千次的復雜運算，也許你認為Excel也不過如此，甚至了無新意。但我們平日里無數(shù)次重復的得心應手的使用方法只不過是Excel全部技巧的百分之一。本專題從Excel中的一些鮮為人知的技巧入手，領略一下關于Excel的別樣風情。

一、讓不同類型數(shù)據(jù)用不同顏色顯示

在工資表中，如果想讓大于等于2000元的工資總額以“紅色”顯示，大于等于1500元的工資總額以“藍色”顯示，低于1000元的工資總額以“棕色”顯示，其它以“黑色”顯示，我們可以這樣設置。1.打開“工資表”工作簿，選中“工資總額”所在列，執(zhí)行“格式→條件格式”命令，打開“條件格式”對話框。單擊第二個方框右側的下拉按鈕，選中“大于或等于”選項，在后面的方框中輸入數(shù)值“2000”。單擊“格式”按鈕，打開“單元格格式”對話框，將“字體”的“顏色”設置為“紅色”。2.按“添加”按鈕，并仿照上面的操作設置好其它條件(大于等于1500，字體設置為“藍色”；小于1000，字體設置為“棕色”)。3.設置完成后，按下“確定”按鈕?？纯垂べY表吧，工資總額的數(shù)據(jù)是不是按你的要求以不同顏色顯示出來了。

Excel表格的基本操作教程六、讓數(shù)據(jù)按需排序如果你要將員工按其所在的部門進行排序，這些部門名稱既的有關信息不是按拼音順序，也不是按筆畫順序，怎么辦?可采用自定義序列來排序。1.執(zhí)行“格式→選項”命令，打開“選項”對話框，進入“自定義序列”標簽中，在“輸入序列”下面的方框中輸入部門排序的序列(如“機關,車隊,一車間,二車間,三車間”等)，單擊“添加”和“確定”按鈕退出。2.選中“部門”列中任意一個單元格，執(zhí)行“數(shù)據(jù)→排序”命令，打開“排序”對話框，單擊“選項”按鈕，彈出“排序選項”對話框，按其中的下拉按鈕，選中剛才自定義的序列，按兩次“確定”按鈕返回，所有數(shù)據(jù)就按要求進行了排序。二、建立分類下拉列表填充項我們常常要將企業(yè)的名稱輸入到表格中，為了保持名稱的一致性，利用“數(shù)據(jù)有效性”功能建了一個分類下拉列表填充項。1.在Sheet2中，將企業(yè)名稱按類別(如“工業(yè)企業(yè)”、“商業(yè)企業(yè)”、“