沙雷氏Z4菌株Tn5轉座突變株的群體淬滅活性篩選體系的建立及優(yōu)化

沙雷氏Z4菌株Tn5轉座突變株的群體

淬滅活性篩選體系的建立及優(yōu)化摘要：利用Tn5轉座子插入突變技術構建沙雷氏Z4菌株突變體庫，研究不同因素對轉座突變的影響，在此基礎上初步探究了突變株的群體淬滅能力.結果表明，采用雙親本接合法，選擇對數生長期的沙雷氏Z4菌株與大腸桿菌S17-1(pRL1063a)菌液1：1混合，3ITC培養(yǎng)3h后，涂布于含50院/mL卡那霉素和25院/mL四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基上，長出的突變株數量最多；隨機選擇突變株進行群體淬滅能力測試，結果篩選到了3株群體淬滅能力明顯與沙雷氏Z4野生型有差異的突變株.本研究采用的Tn5轉座突變技術為研究群體淬滅菌的基因功能以及生理代謝提供了有效的分子遺傳工具，也為研究群體淬滅提供了新的途徑.關鍵詞：Tn5轉座子插入突變技術；群體淬滅；沙雷氏菌群體感應(QuorumSensing,QS)現(xiàn)象普遍存在于微生物群落中，指微生物在生長過程中根據群體密度變化而調控基因表達的一種生理行為［1-3］.研究發(fā)現(xiàn)［4］,微生物QS是通過自誘導因子(Autoinducer,AI)的濃度調控基因表達.目前發(fā)現(xiàn)的自誘導因子包含N-酰基高絲氨酸內脂(AcylHomoserineLactone,AHL)［5］、自誘導因子2(Autoinducer-2,AI-2)［6］、擴散信號因子(DiffusibleSignalingFactor,DSF)［7］等.其中，AHL信號分子主要由高絲氨酸內酯環(huán)和?；鶄孺溄M成，側鏈依據不同長度可分為C4—C18等多種類型.細菌通過群體感應系統(tǒng)調控多種生理行為，如生物膜的形成與成熟［8］、生物發(fā)光現(xiàn)象［9］、毒力因子產生［10］等.群體感應給環(huán)境、農業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)領域發(fā)展帶來機遇的同時也帶來困難和挑戰(zhàn)，因此干擾細菌的群體感應系統(tǒng)是目前研究的熱點之一.群體淬滅(QuorumQuenching,QQ)是指在不影響細菌生長的情況下，阻斷或干擾群體感應，抑制或者破壞細菌QS系統(tǒng)，從而阻斷細菌信息交流的一種有力手段［11］,常被應用于疾病控制和減緩生物膜污染等［12-13］方面.盡管已在Rhodococcussp.［13］、Bacillussp.［14-15］、Serratiasp.［16］等多種屬細菌中發(fā)現(xiàn)QQ現(xiàn)象，但對其作用機理仍知之甚少.我們課題組前期已篩選出一株具有高效群體淬滅能力的沙雷氏Z4菌(Serratiasp.Z4),本研究采用Tn5轉座子插入突變技術，構建沙雷氏Z4菌突變體庫.通過研究不同供受體混合比例、不同培養(yǎng)時間、不同抗生素選擇壓力以及不同菌株生長狀態(tài)對突變的影響，進一步優(yōu)化Tn5轉座突變條件.在此基礎上，研究優(yōu)化條件后獲得的突變株對兩種AHL信號分子——N-己酰基-L-高絲氨酸內酯（C6-HSL）和N-辛?；?L-高絲氨酸內酯（C8-HSL）的降解能力，篩選具有QQ能力差異的沙雷氏Z4突變株，為未來Z4菌更好地應用提供分子技術及基礎理論.1實驗材料1.1菌株與質粒本實驗使用的菌株及質粒見表1.其中，沙雷氏Z4菌株是本實驗室從溫州市經濟開發(fā)區(qū)濱海工業(yè)區(qū)第一污水處理廠采集的污泥中分離獲得;大腸桿菌S17-1作為雙親本接合實驗的供體菌;質粒pRL1063a是經過改造的具有Tn5轉座子的自殺載體；紫色色桿菌CV026和根癌農桿菌KYC55購自于北京百歐博偉生物技術有限公司，作為群體感應生物傳感器.表1菌株及質粒名稱 描述 來源菌株沙雷氏Z4菌株大腸桿菌S17-1紫色色桿菌CV026根癌農桿菌KYC55（pJZ372\pJZ384\pJZ410）抗四環(huán)素；QQ功能作為供體菌抗卡那霉素；QS生物傳感器抗慶大霉素、壯觀霉素、四環(huán)素；QS生物傳感器本實驗室本實驗室北京百歐博偉北京百歐博偉質粒pRL1063a攜帶Tn5轉座子，抗卡那霉素本實驗室1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（g/L）.胰蛋白胨10、酵母浸出粉5、氯化鈉10.調pH7.4-7.5之間，121。。高壓滅菌30min.固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂粉.AT培養(yǎng)基（g/L）[17].配置20XATsalt（g/L）：硫酸銨40、硫酸鎂1.56、七水硫酸鐵0.1、一水硫酸錳0.044；配置20XATbuffe（g/L）：磷酸二氫鉀214，調pH7.3；配置50%葡萄糖；各組分單獨滅菌或過濾除菌.AT培養(yǎng)基：20XATsalt50mL、20XATbuffe50mL、50%葡萄糖10mL、無菌水896mL、1.5%瓊脂粉.用于檢測群體淬滅能力時，需加入相應的抗生素以及5-漠-4-氯-3-吲噪-K-D-半乳糖苷（X-gal）.1.3實驗試劑試劑母液的配置見表2.表2試劑貯液的配置試劑名稱 貯存液濃度及配置方法卡那霉素（Km）100mg/mL，水溶液，4。。保存壯觀霉素（Spe）100mg/mL，水溶液，4。。保存慶大霉素（Gm）100mg/mL，水溶液，4。。保存四環(huán)素（Tc）50mg/mL，70%乙醇溶液，-20。。避光保存N-己?；?L-高絲氨酸內酯（C6-HSL）1mg/mL，甲醇溶液，-20。。保存N-辛?；?L-高絲氨酸內酯（C8-HSL）1mg/mL，甲醇溶液，-20。。保存5-漠-4-氯-3-吲哚-QD-半乳糖苷（X-gal）100mg/mL，二甲亞砜溶液，-20。。避光保存2實驗方法2.1菌株活化將所需的菌株分別在相應的培養(yǎng)基以及溫度下活化，見表3.表3菌株培養(yǎng)條件菌株名稱培養(yǎng)基抗生素及其濃度溫度/C沙雷氏Z4菌株LB25gg/mLTc30大腸桿菌S17-1(pRL1063a)LB100gg/mLKm37紫色色桿菌CV026LB50gg/mLKm30根癌農桿菌KYC55LB/AT50gg/mLGm;50gg/mLSpe;2gg/mLTc302.2雙親本接合借鑒張茜等［18］所采用的雙親本接合法，挑取供體菌大腸桿菌S17-1（pRL1063a）和受體菌沙雷氏Z4菌單菌落，分別接于含有100gg/mLKm和25此/mLTc的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)16h；至對數生長期（OD600為1.500左右）分別收集供體菌及受體菌以1：1比例混合，12000rpm離心2min,棄上清；加入1mLLB液體培養(yǎng)基重懸浮后，30。。振蕩培養(yǎng)3h，使兩者充分接合;取50gL菌液涂布于含有50gg/mLKm和25gg/mLTc的LB固體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h.2.3Tn5轉座突變株的PCR驗證挑取雙抗篩選固體培養(yǎng)基上的單菌落于新的LB液體培養(yǎng)基上（含相應抗生素），根據分子克隆實驗指南［19］，提取突變株基因組DNA；根據pRL1063a中的luxAB序列設計合成特異性擴增弓I物（luxABP1:5'-TTTGTTCGGCTTGGTATCGC-3'和luxABP2:5'-ATTGCTTAGGTCCTTCTCA-3'）,以突變株基因組DNA為模板進行聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）驗證.PCR反應體系及反應程序見表4.表4PCR反應體系及反應程序組分體積/gL組分體積/gLTaqPCRMasterMix10模板DNA1luxABP11ddH2O7luxABP21反應程序：94C4min；94C30sec；55C90sec；72C1min；30個循環(huán)；72C10min；4C保存.2.4轉座突變條件優(yōu)化采用單因素實驗，在其他條件不變的情況下，分別改變Tn5轉座子插入突變中的供體菌和受體菌的混合比例（1：1、1：2、1：3、1：4、1：5）、供受體菌混合培養(yǎng)時間（1h、3h、5h）、抗生素選擇壓力（Km含量分別為100gg/mL、75gg/mL、50gg/mL和25gg/mL、Tc=25gg/mL）以及沙雷氏Z4菌的生長狀態(tài)（OD600分別為0.200、1.500和4.000），統(tǒng)計長出的突變株數量，獲得最佳的轉座突變條件.2.5群體淬滅差異突變株篩選在優(yōu)化的突變條件下進行沙雷氏Z4菌株Tn5轉座突變，建立沙雷氏Z4菌株突變體庫.具體步驟如下：將2.3中PCR驗證為陽性的突變株接于同時含有50gg/mLKm和25gg/mLTc的LB液體培養(yǎng)基中，30C振蕩培養(yǎng)12-16h；用無菌LB液體培養(yǎng)基稀釋Z4突變株OD600至2.600-2.700之間；取10mL菌液，加入信號分子C6-HSL或C8-HSL至終濃度為10gmol/L,30°C振蕩培養(yǎng)4h；取培養(yǎng)液過濾除菌，作為待測液，-20C保存?zhèn)溆?紫色色桿菌CV026報告菌為紫色色桿菌ATCC31532的mini-Tn5的突變體［20］,自身不能合成AHLs信號分子，當出現(xiàn)外源AHLs信號分子時，會產生紫色色素［20］.本實驗借鑒李晴等［21］群體淬滅活性檢測方法，將CV026接種于含50gg/mLKm的LB液體中，30C振蕩培養(yǎng)至OD600為1.000左右;加熱融化100mL的LB固體培養(yǎng)基，靜置冷卻至40C-50C，加入終濃度為50gg/mLKm和10mLOD600為1.000左右的CV026菌液，倒固體培養(yǎng)基冷卻凝固，打孔，加入待測液，30C正置培養(yǎng)24h，觀察紫色圈大小，以C6-HSL顯色圈作為陽性對照.若具有QQ能力，則待測液中的C6-HSL會被降解而使得顯色圈小于陽性對照；若無QQ能力，則顯色圈會同陽性對照的直徑大小一致.根癌農桿菌KYC55報告菌在含有外源AHLs信號分子和X-gal的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，會產生大量的"-半乳糖苷酶與X-gal反應呈現(xiàn)藍色.本實驗借鑒盛吉洋［22］的檢測方法，將KYC55接種于含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，30C振蕩培養(yǎng)24h；加熱融化AT固體培養(yǎng)基，靜置冷卻至40C-50C，加入相應抗生素、終濃度為100gg/mL的X-gal和10mLKYC55菌液，打孔，加入待測液，30C正置培養(yǎng)24h，觀察藍色圈大小，以C8-HSL顯色圈作為陽性對照.若具有QQ能力，則待測液中的C8-HSL會被降解而使得顯色圈小于陽性對照；若無QQ能力，則顯色圈會同陽性對照的直徑大小一致.用信號分子C6-HSL和C8-HSL作為陽性對照，Z4野生型菌株降解信號分子作為陽性對照，水作為陰性對照.若觀察到突變株降解信號分子的顯色圈比Z4野生型顯色圈的直徑大，則Tn5插入了編碼群體淬滅酶基因中，從而獲得群體淬滅缺失突變菌株.3結果與分析3.1沙雷氏Z4菌株Tn5轉座突變株的PCR鑒定對沙雷氏Z4菌株進行Tn5轉座突變，通過Km和Tc雙抗篩選，構建了庫容量較多的沙雷氏Z4菌株突變體庫.以隨機挑選5株Z4突變株基因組DNA、Z4野生型基因組DNA以及pRL1063a質粒DNA為模板進行PCR驗證（圖1）,結果都得到了大小約為1.6kb的條帶，與1:DNA分子量標記2-3:pRL1063a質粒DNAPCR條帶（陽性對照）4-5:Z4野生型基因組DNA

PCR條帶（陰性對照）6-15:5種突變子基因組DNAPCR條帶16:DNA分子量標記1 2 3 45678910111213141516豈 W圖1沙雷氏Z4突變株中Tn5插入驗證的PCR圖譜

預期結果相符.說明Tn5轉座子已成功插入了沙雷氏Z4菌株中，且獲得了同時具有Km以及Tc抗性的沙雷氏Z4菌株Tn5轉座突變體.3.2供受體菌混合比例對Tn轉座突變效率的影響研究表明［23］供體菌和受體菌之間的混合比例對篩選突變株非常關鍵，只有當受體菌數量適量高于供體菌時才能獲得較高的突變株數量.收集菌濃一致的供體菌一一大腸桿菌S17-l(pRL1063a)以及受體菌——沙雷氏Z4菌菌液，將兩者分別按照1：1、1：2、1：3、1：4、1：5的比例接種于含有50此/mLKm和25gg/mLTc的LB固體培養(yǎng)基上，對長出的突變株進行統(tǒng)計(圖2、圖3).圖2不同比例混合的沙雷氏Z4菌與大腸桿菌S17-1(pRL1063a)對Tn5轉座突變效率的影響圖3不同比例混合的沙雷氏Z4菌(受體菌)與大腸桿菌S17-1(pRL1063a)(供體菌)對Tn5轉座突變效率的影響結果表明，供受體比例在1：1至1：3之間，Tn5轉座突變能獲得較多的突變株，而隨著沙雷氏Z4菌數量逐漸增多，獲得的突變株數量逐漸減少.可能是因為在30。。下沙雷氏菌生長速度快于大腸桿菌，當受體沙雷氏Z4菌數量大大增加時，會抑制大腸桿菌S17-1(pRL1063a)的生長，導致Tn5轉座子只能插入少部分的沙雷氏Z4菌中，使得突變株數量減少.因此，選擇供受

體菌混合比例為1:1.3.3混合培養(yǎng)時間對Tn轉座突變效率的影響以1：1比例混合的沙雷氏Z4菌與大腸桿菌S17-l(pRL1063a),分別于30。。混合震蕩培養(yǎng)1h、3h和5h，觀察突變株生長情況(圖4).結果表明，不同混合培養(yǎng)時間后，都可以長出很多的沙雷氏Z4突變菌株，且隨著混合培養(yǎng)時間延長，突變株的數量增多.說明，在雙親接合法中，供受體菌接合培養(yǎng)時間越長，接觸越充分，Tn5轉座子插入突變的效率就越高.但隨著混合培養(yǎng)時間延長，混合菌不斷生長，突變株單菌落越來越密集，不利于后續(xù)單菌落挑取進行傳代培養(yǎng).因此，選擇混合培養(yǎng)時間3h進行后續(xù)實驗.3.4抗生素選擇壓力對Tn轉座突變效率的影響圖4混合培養(yǎng)時間對Tn5轉座突變效率的影響考慮到抗生素選擇壓力對沙雷氏Z4菌轉座突變的影響，本實驗分別檢測了大腸桿菌S17-1(pRL1063a)以及沙雷氏Z4菌株對Km和Tc的敏感性(圖5).結果表明，在分別含有100gg/mL、75gg/mL、50gg/mL和25gg/mLKmLB固體培養(yǎng)基上，沙雷氏Z4菌的生長都受到抑制，而大腸桿菌S17-l(pRL1063a)在含有不同濃度的Km固體培養(yǎng)基上都正常生長;在分別含有100gg/mL、75gg/mL、50gg/mL和25gg/mLTc的LB固體培養(yǎng)基上，大腸桿菌S17-1(pRL1063a)的生長都受到抑制，而沙雷氏Z4菌在含有濃度分別為25gg/mL、50gg/mL和75gg/mL的Tc固體培養(yǎng)基上生長正常，但在含有100圖4混合培養(yǎng)時間對Tn5轉座突變效率的影響設定抗生素選擇壓力，其中Km濃度分別為100gg/mL、75gg/mL、50gg/mL和25gg/mL，Tc固定不變?yōu)?5gg/mL.將50gL混合培養(yǎng)后的菌液涂布于對應不同抗生素選擇壓力的LB固體培養(yǎng)基上，30。培養(yǎng)24h，對長出來的突變株進行統(tǒng)計(圖6).結果表明，Km濃度越高，長出的沙雷氏Z4突變菌株就越少；在含25gg/mLKm和25gg/mLTc的篩選固體培養(yǎng)基上，突變株

數量眾多,菌落密集難以分開,并且隨機挑選突變株再次轉接于含Km和Tc的LB固體培養(yǎng)基上，所能長出的突變株很少，說明假陽性突變株多；而在含100gg/mLKm和25gg/mLTc的固體培養(yǎng)基上，突變株數量少.因此，后續(xù)實驗選擇在50gg/mLKm和25gg/mLTc的抗性LB固體培養(yǎng)基上進行篩選.圖6圖6不同抗生素選擇壓力對突變效率的影響圖7沙雷氏圖7沙雷氏Z4菌株生長曲線圖8不同沙雷氏Z4菌株生長狀態(tài)對突變效率的影響3.5沙雷氏菌Z4生長狀態(tài)對Tn轉座突變效率的影響對沙雷氏Z4菌株的生長情況進行監(jiān)測，每2h測一次OD6oo值，繪制沙雷氏Z4菌株的生長曲線（圖7）.結果表明，0—2h內Z4菌株位于遲緩期內（OD6oo范圍在0-0.278），3-12h內位于對數生長期（OD600范圍在0.400-3.500），13-14h位于平穩(wěn)期（0D600范圍在3.924-4.072）.分別選擇OD600為0.200、1.500、4.000時期的沙雷氏Z4菌株與大腸桿菌S17-1（pRL1063a）同比例混合，30。。培養(yǎng)3h，涂布于雙抗篩選培養(yǎng)基上，對長出的突變株進行統(tǒng)計（圖8）.結果表明，對處于遲緩期內的沙雷氏Z4菌株進行轉座突變，其突變效率低于對數生長期以及平穩(wěn)期的沙雷氏Z4菌株；而對處于對數生長期和平穩(wěn)期的沙雷氏Z4菌株進行轉座突變，均能獲得較多的突變株.平穩(wěn)期的沙雷氏Z4菌株的生長活力不如對數生長期"I,故選擇對數生長期的沙雷氏Z4菌株進行轉座突變.150-1:Lili0.200 1.500 4.000od60[!3.6群體淬滅差異突變株的篩選在上述優(yōu)化培養(yǎng)條件下，對沙雷氏Z4菌株進行Tn5轉座子插入突變，構建突變體庫.利用生物傳感器紫色桿菌CV026以及根癌農桿菌KYC55對信號分子C6