核糖體與核酶

第一節(jié)核糖體的類型與結(jié)構(gòu)核糖體是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的細胞器，唯一功能是按mRNA指令由氨基酸合成多肽鏈。核糖體幾乎存在于所有細胞,從原核細胞到真核細胞均含有大量核糖體,線粒體和葉綠體中也含核糖體,僅紅細胞等少數(shù)特化細胞中沒有核糖體是一種顆粒狀結(jié)構(gòu),沒有被膜,主要是核糖體RNA(rRNA),占60%,核糖體蛋白(r蛋白),占40%還有其它功能的核糖核蛋白顆粒,常是小分子RNA(snRNA)與蛋白組成的顆粒,參與RNA的加工、RNA編輯、基因表達調(diào)控等.第一頁，共二十七頁。一、核糖體的基本類型與成分1、基本類型(1)70S的核糖體:由50S和30S兩個亞基組成；原核細胞的核糖體,葉綠體和線粒體核糖體也接近70S(2)80S的核糖體:由60S和40S兩個亞基組成大小兩個亞基常游離于細胞質(zhì)基質(zhì)中,只有在合成蛋白質(zhì)時才結(jié)合在一起，胎鏈合成完畢后，大小亞基解體，又游離于細胞質(zhì)中第二頁，共二十七頁。2、核糖體的化學(xué)組成核糖體大小亞基都是由rRNA和核糖體蛋白組成(1)原核細胞的70S核糖體中:50S大亞基含33種蛋白質(zhì)和兩種rRNA：23SrRNA和5SrRNA。30S小亞基含有21種蛋白質(zhì)和一個16SrRNA(2)真核細胞的80S核糖體中60S大亞基含49種蛋白質(zhì)及3種rRNA：28SrRNA、5.8SrRNA和5SrRNA。40S小亞基含33種蛋白和一種18SrRNA第三頁，共二十七頁。原核生物與真核生物核糖體成分的比較第四頁，共二十七頁。第五頁，共二十七頁。第六頁，共二十七頁。二、核糖體的結(jié)構(gòu)（一）核糖體結(jié)構(gòu)與功能的分析方法離子交換樹脂可分離純化各種r蛋白；純化的r蛋白與純化的rRNA進行核糖體的重組裝，顯示核糖體中r蛋白與rRNA的結(jié)構(gòu)關(guān)系雙向電泳技術(shù)可顯示出E.coli核糖體在裝配各階段中，與rRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的類型雙功能的交聯(lián)劑和雙向電泳分離可用于研究r蛋白在結(jié)構(gòu)上的相互關(guān)系

電鏡負染色與免疫標記技術(shù)結(jié)合，研究r蛋白在核糖體的亞單位上的定位。70S核糖體小亞基16SrRNA結(jié)構(gòu)及與全部r蛋白關(guān)系第七頁，共二十七頁。(二)原核細胞的核糖體結(jié)構(gòu)1、核糖體蛋白E.coli核糖體小亞基含21種蛋白質(zhì),分別命名為S1-S21;大亞基含33種蛋白質(zhì),分別命名為L1-L332、核糖體rRNAE.coli小亞基含16SrRNA，共有1542個核苷酸，不同來源的16SrRNA的序列組成具保守性。含四個結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域都有46%堿基配對，形成螺旋的柄狀結(jié)構(gòu)。每個柄狀結(jié)構(gòu)都很短，不到8bp，且并不都是完全配對。第八頁，共二十七頁。核糖體小亞單位rRNA的二級結(jié)構(gòu)(a)E.coli16SrRNA；（紅色為高度保守區(qū)）(b)酵母菌18SrRNA，它們都具有類似的40個臂環(huán)結(jié)構(gòu)，其長度和位置往往非常保守；P、E分別代表僅在原核或真核細胞中存在的rRNA的二級結(jié)構(gòu)。第九頁，共二十七頁。3、細菌核糖體模型在該模型中確定了一些重要的功能區(qū)。如在小亞基中確定了mRNA和tRNA結(jié)合位點，并確定了催化肽鍵形成的位點位于大亞基。確定了小亞基中部突出的平臺部分含有16SrRNA的3‘端，此部位有與mRNA結(jié)合的序列。與蛋白質(zhì)合成起始相關(guān)的tRNA、蛋白質(zhì)因子結(jié)合位點位于相鄰小葉中。大亞基還具有催化肽鍵形成和GTP水解的功能區(qū)。第十頁，共二十七頁。E.coli（a）核糖體小亞單位中的部分r蛋白與rRNA的結(jié)合位點）（b）及其在小亞單位上的部位第十一頁，共二十七頁。（三）核糖體的裝配1、rRNA的轉(zhuǎn)錄與加工(1)真核生物:18S、5.8S和28S基因是串聯(lián)在一起,每個基因被間隔區(qū)隔開。該基因在RNA聚合酶Ⅰ作用下，首先轉(zhuǎn)錄成一個45S的前rRNA，然后被加工成41S前rRNA，再被切割成20S前rRNA和32S前rRNA，20SrRNA加工為成熟的18SrRNA，32SrRNA加工為28S和5.8SrRNA5SrRNA基因位于不同染色體上,由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄,僅進行簡單加工或不加工第十二頁，共二十七頁。(2)原核生物:細菌中5SrRNA基因與16S和23S組成一個轉(zhuǎn)錄單位:16S-23S-5S在RNA聚合酶的作用下,轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄成一個rRNA前體,經(jīng)核酸酶Ⅲ的切割,生成16S、23S和5.8S的前體,經(jīng)其它酶進一步加工生成成熟的三種rRNA。第十三頁，共二十七頁。2、核糖體的裝配核糖體是自我裝配的細胞器，當r蛋白和rRNA合成加工完成后即開始裝配大小亞基。在原核生物小亞基裝配時，一些蛋白能獨立地與16SrRNA結(jié)合，裝配成的中間體為其它蛋白的結(jié)合提供位點。在真核生物，45SrRNA、5SrRNA與蛋白結(jié)合形成80S顆粒，隨后降解成兩種顆粒，大顆粒含32S和5SrRNA，小顆粒含20SrRNA。小顆粒中20SrRNA降解成18SrRNA，大顆粒中的32SrRNA被加工成28S和5.8SrRNA,并與5S裝配成大亞基第十四頁，共二十七頁。E.coli核糖體小亞單位中rRNA與r蛋白的相互關(guān)系示意圖線條表示相互作用及作用力的強（粗線）與弱（細線）

第十五頁，共二十七頁。三、核糖體的功能-蛋白質(zhì)的合成在核糖體上合成的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，即多肽鏈。合成是從多肽鏈的N端開始，到C端結(jié)束。對于mRNA，合成的方向是5’-3’，蛋白質(zhì)的合成涉及核糖體的一些功能位點和RNA作用第十六頁，共二十七頁。（一）核糖體的功能位點原核生物有4種與RNA結(jié)合的位點，一個是與mRNA，另3個是與tRNA結(jié)合位點A位點：氨酰基位點，是新?lián)饺氚滨RNA結(jié)合的位點，主要位于大亞基；B位點：肽酰tRNA位點，位于大亞基P位點：脫氨酰tRNA結(jié)合位點；mRNA結(jié)合位點：位于小亞基，原核生物位于16SrRNA的3’端，mRNA中與16SrRNA結(jié)合的序列稱SD序列，位于起始密碼AUG上游5-10個堿基。真核生物主要依賴5’端甲基化帽結(jié)構(gòu)第十七頁，共二十七頁。第十八頁，共二十七頁。（二）蛋白質(zhì)合成的基本過程1、鏈的起始：（1）30S亞基與mRNA的結(jié)合：在原核生物，mRNA依靠SD序列只和游離的30S小亞基結(jié)合；真核生物，小亞基識別mRNA5’端甲基化帽結(jié)構(gòu)，然后沿mRNA滑動，直到遇到識別序列，典型的識別序列為5’-CCACCAUGC-3’，含AUG小亞基與mRNA結(jié)合還需要起始因子(initiationfactor,IF)的幫助.原核生物命名為IF,有IF1,IF2和IF3,IF3幫助mRNA與核糖體結(jié)合;真核生物為eIF,至少有10個,eIF4幫助mRNA與核糖體結(jié)合.第十九頁，共二十七頁。(2)第一個氨酰tRNA進入核糖體:攜帶甲酰甲硫氨酸的tRNA同GTP、IF2結(jié)合,形成GTP-IF2-tRNAfMet復(fù)合物,然后通過反密碼子與mRNA中AUG識別進入核糖體.(3)完整起始復(fù)合物裝配:tRNA與AUG結(jié)合后,大亞基加入,形成完整的核糖體-mRNA起始復(fù)合物,該過程伴有GTP水解,IF1、IF2和IF3釋放，fMet占據(jù)P位點2、多肽鏈的延伸：復(fù)合物形成后蛋白質(zhì)合成開始。延伸涉及4個重復(fù)的步驟，這4個步驟的循環(huán)，使肽鏈不斷延長第二十頁，共二十七頁。①氨酰tRNA進入A位點：第二個氨酰tRNA與GTP及延伸因子EF-Tu結(jié)合，密碼子相配的tRNA進入A位點，GTP水解，EF-Tu-GDP釋放②肽鍵形成(延伸第二步)：當P位和A位點都被tRNA占據(jù)后，在肽酰轉(zhuǎn)移酶催化2個aa形成肽鍵，P位點tRNA卸去氨基酸，A位點tRNA形成二肽③轉(zhuǎn)位(延伸第二步)：第一個肽鍵形成后,核糖體沿著mRNA從5’→3’移動3個核苷酸,此時,A位點tRNA-二肽移到P位點,P位點tRNA進入E位點.移位需結(jié)合有GTP的移位酶EF-G參與④脫氨酰tRNA釋放:脫氨酰tRNA離開核糖體E位延伸反應(yīng),每次循環(huán)消耗2個GTP,耗時0.05s.第二十一頁，共二十七頁。3、蛋白質(zhì)合成的終止：核糖體沿mRNA移動，當進入A位點的是終止密碼子UAA、UAG、UGA，由于沒有與之配對的反密碼子，蛋白質(zhì)合成終止。該過程需要釋放因子（releasefactor，RF），細菌有3種RF，RF1識別UAA和UAG，RF2識別UAA和UGA，RF3能增加其它因子活性。RF與A位點的結(jié)合，活化了肽鏈轉(zhuǎn)移酶，水解P位的多肽與tRNA之間的連接，多肽鏈離開核糖體第二十二頁，共二十七頁。蛋白質(zhì)的合成第二十三頁，共二十七頁。（三）多聚核糖體（polyribosome）在蛋白質(zhì)合成時，同一條mRNA能同多個核糖體結(jié)合，同時合成多條肽鏈，結(jié)合在同一條mRNA上的核糖體稱多聚核糖體。在蛋白質(zhì)合成過程中，核糖體不斷向mRNA的3’端移動。當?shù)谝粋€核糖體離開起始密碼子后，空出的位置能與另一核糖體結(jié)合，并合成蛋白質(zhì)多聚核糖體中，每個核糖體相隔約80個核苷酸這種蛋白質(zhì)合成方式，大大提高了合成效率，也減輕了細胞核進行基因轉(zhuǎn)錄和加工的壓力第二十四頁，共二十七頁。多聚核糖體第二十五頁，共二十七頁。（四）蛋白質(zhì)合成抑制劑是研究蛋白質(zhì)合成機制有用的工具1、抗生素(antibiotic)：是主要的蛋白質(zhì)合成抑制劑，不同抗生素作用機制不同，如鏈霉素主要是抑制tRNA與核糖體的結(jié)合，導(dǎo)致肽鏈合成提前中止。鏈霉素還可引起密碼子錯讀。2、嘌呤毒素(puromycin)：它具有與tRNA分子末端類似的結(jié)構(gòu)，能同氨基酸結(jié)合，代替氨酰化的tRNA同A位點結(jié)合，并摻入到生長的肽鏈中。但不能參與隨后的反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的終止并釋放出C端含有嘌呤毒素的不成熟的多肽。通過嘌呤毒素抑制作用發(fā)現(xiàn)P和A位點是獨立第二十六頁，共二十七頁。四、核酶Cech1981在研究四膜蟲核糖體大亞基26S前rRNA加工去除內(nèi)含子時發(fā)現(xiàn):在沒有任何蛋白質(zhì)參與下,26S前rRNA進行自我加工切除了前體分子中的內(nèi)含子，產(chǎn)生成熟的rRNA。這種現(xiàn)象稱自剪接(self