用于牛肉摻雜肉成分檢測(cè)的熒光PCR方法研究

本文格式為Word版，下載可任意編輯——用于牛肉摻雜肉成分檢測(cè)的熒光PCR方法研究湛寶萍

本文采用熒光PCR法對(duì)牛肉摻雜肉成分進(jìn)行檢驗(yàn)，以不同比例混合的牛肉、豬肉與鴨肉為樣品，分別采集樣品DNA，根據(jù)不同源性設(shè)定特異性引物和探針。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，該方法可有效檢測(cè)出同等質(zhì)量下三種肉質(zhì)的DNA濃度差異、質(zhì)量百分比，且誤差不超過(guò)5%，通過(guò)該檢測(cè)方式的應(yīng)用，可對(duì)牛肉中摻雜肉成分進(jìn)行確切有效檢測(cè)。

材料與方法

試劑與設(shè)備本試驗(yàn)主要試劑為動(dòng)物基因DNA提取試劑盒、TapDNA聚合酶、分析純、引物和探針合成、人工全基因合成、無(wú)水乙醇。儀器為熒光PCR儀、高速冷凍離心機(jī)、絞肉機(jī)、電泳系統(tǒng)、恒溫混勻儀、電子天平。

試驗(yàn)方法

（1）樣本制備。本試驗(yàn)采用牛肉、豬肉和鴨肉，依照不同比例制備樣品;

（2）DNA提取。選擇50g動(dòng)物肌肉樣本，用絞肉機(jī)攪碎后，先將樣本選取特定量放入2ml離心管內(nèi)，將3.8μL蛋白酶K溶液放入混均儀中，溫度設(shè)定66℃，時(shí)間為60min，間隔15min取出顛倒混勻后取出;提煉樣本中的上清液，將其提煉出后沉淀晾干，參與49μL超純水使其完全溶解，放入-18℃冰箱內(nèi)存儲(chǔ)存用。

（3）熒光PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為35μL，循環(huán)參數(shù)設(shè)置為95℃，變性4min，再運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃，變性30s;將各樣本熒光PCR檢測(cè)設(shè)定為平行樣本，擴(kuò)增Ct值選出兩個(gè)樣品的Ct值取均值;引物和探針階段，為檢測(cè)樣本內(nèi)牛肉、豬肉的質(zhì)量百分比，以牛源性、豬源性、鴨源性基由于靶基因，設(shè)置特異性引物與探針[1]。

試驗(yàn)結(jié)果

特異為檢驗(yàn)該試驗(yàn)中設(shè)計(jì)引物的特異性，以豬、鴨、牛的DNA為模板，利用引物和探針擴(kuò)增樣本。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，牛源性基因特異性引物和探針與其他物種的DNA沒(méi)有反應(yīng)，僅與牛DNA產(chǎn)生擴(kuò)散曲線;豬源性基因特異性與其他DNA無(wú)反應(yīng)，僅與豬DNA產(chǎn)生擴(kuò)散曲線;鴨源性基因特異性與其他DNA無(wú)反應(yīng)，僅與鴨DNA產(chǎn)生擴(kuò)散曲線。由此可見(jiàn)，該試驗(yàn)中引物與探針擁有良好的特異性。

不同樣品DNA濃度差異采用PCR技術(shù)進(jìn)行樣本檢測(cè)，對(duì)多種動(dòng)物源性質(zhì)量比值進(jìn)行分析，得出一致質(zhì)量下豬肉、鴨肉與牛肉中DNA濃度差值。選取0.02g的牛肉、鴨肉與豬肉、0.04g的牛肉、鴨肉和豬肉進(jìn)行測(cè)試，并采用以下公式對(duì)不同肉樣品質(zhì)量與樣品DNA質(zhì)量比值進(jìn)行計(jì)算。

式中，d為不同樣品質(zhì)量與DNA質(zhì)量比值。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，在質(zhì)量為0.02g狀況下，牛d為926.5，豬d為158，鴨d為42.7。在質(zhì)量為0.04g狀況下，牛d為925.7，豬d為583.5，鴨d為185.6。在質(zhì)量存在差異時(shí)，d值可能因操作與儀器等原因產(chǎn)生一定誤差，取兩次試驗(yàn)均值，即牛d為932.42，豬d為156.24，鴨d為11.53。

質(zhì)量百分比采用熒光PCR檢測(cè)五個(gè)樣本中不同動(dòng)物源性成分質(zhì)量比值含量，分別從樣本中選取0.04g樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得質(zhì)量百分比結(jié)果如下。樣品一：牛肉質(zhì)量0.36，豬肉0.004，實(shí)際檢測(cè)質(zhì)量比值為87.9%與12.1%;樣品二：牛肉質(zhì)量0.028，鴨肉0.012，實(shí)際檢測(cè)質(zhì)量比值為68.2%與31.8%;樣品三：牛肉質(zhì)量0.026，豬肉0.014，實(shí)際檢測(cè)質(zhì)量比值為63.5%與36.5%;可見(jiàn)，采用PCR檢測(cè)法可確切測(cè)出全部樣本中摻入的豬肉與鴨肉，且比值誤差不超過(guò)5%，與摻雜肉成分檢測(cè)需求相符合。

綜上所述，本試驗(yàn)采用熒光PCR技術(shù)對(duì)