腦科學研究的方法市公開課金獎市賽課一等獎課件

多學科綜合第一章腦科學研究方法和伎倆第1頁多層次研究第2頁研究水平整體行為水平：行為學，軀體感覺，視聽覺，痛覺等

細胞水平：神經(jīng)細胞培養(yǎng)、生物電活動檢測、通路示蹤、細胞染色、免疫化學、凋亡檢測分子水平試驗：離子通道、受體、酶、遺傳物質(zhì)等第3頁一、形態(tài)學方法二、生理學方法三、電生理學方法四、生物化學方法五、分子生物學方法六、腦成像（Brainimaging）技術第4頁一、形態(tài)學方法常規(guī)染色和特殊染色束（通）路追蹤法

熒光組織化學法原位雜交法受體定位法神經(jīng)系功效活動形態(tài)定位法

第5頁1.慣用普通染色方法TTC染色HE鋨酸染色氯化金浸染Cajal銀浸染色尼氏染色第6頁HE（蘇木素－伊紅）第7頁鋨酸染色是神經(jīng)科學研究一個慣用而普遍方法，它原來是用來固定脂質(zhì)，因為髓鞘主要成份是脂質(zhì)，所以用于有髓神經(jīng)纖維染色

鋨酸染色第8頁氯化金浸染運動終板Ach熒光染色氯化金浸染第9頁Cajal銀浸染色第10頁尼氏染色各種方法，HE、甲苯胺藍，焦油紫，硫堇，天青，派洛寧，中性紅以及棓花青等堿性苯胺染料均能夠使尼氏體著色第11頁2、束（通）路追蹤法：研究神經(jīng)元之間聯(lián)絡

第12頁束路追蹤原理：軸漿運輸示蹤物質(zhì)：HRP，熒光染料，各種標識物標識葡萄糖，放射性核素標識氨基酸等。觀察：依據(jù)示蹤物質(zhì)不一樣，采取組織顯色、熒光顯微鏡或放射自顯影等方法。第13頁軸漿運輸法—利用神經(jīng)元軸漿運輸現(xiàn)象追蹤法.

追蹤劑：辣根過氧化物酶(horseradishperoxoidase,HRP)、熒光染料包含核黃(nuclearyellow)、固藍(fastblue)及熒光金(fluorogold)、植物凝集素如麥芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)、細菌毒素如霍亂毒素、病毒如活神經(jīng)病毒

(胞疹病毒和彈狀病毒）

第14頁l

變性法：利用神經(jīng)元包體受損或神經(jīng)軸突離斷后遠側軸突變性，或軸突切斷后細胞反應，來研究纖維聯(lián)絡。*物理性方法：刀切割、電凝、電離破壞、超聲破壞等。*化學性破壞：興奮性氨基酸（海人酸和鵝高蕈氨酸）、單胺類神經(jīng)毒（６－羥多巴胺、６－羥多巴、雙羥色胺）

第15頁神經(jīng)元質(zhì)膜熒光染料法：

用羰花青（carbocynine）熒光染料，能夠染出神經(jīng)細胞質(zhì)膜，并能夠在活體或固定標本上追蹤纖維聯(lián)絡。

第16頁最新研究進展：

華人學者繪制小鼠大腦神經(jīng)網(wǎng)絡圖不一樣大腦區(qū)域必須相互溝通才能控制復雜思想和行為，但當前對于這些區(qū)域組織成為遼闊神經(jīng)元網(wǎng)絡機制卻相對知之甚少。2月27日《細胞》（Cell）雜志上一項新研究中，南加州大學董宏偉等研究人員采取神經(jīng)元示蹤技術繪制出了一張小鼠全腦圖譜，揭示了大腦皮質(zhì)中數(shù)百條神經(jīng)元通路。在顯微鏡下將可見熒光分子注入到整個小鼠大腦皮質(zhì)不一樣區(qū)域，這些小分子沿著“細胞高速公路”運輸，標識了大約600個神經(jīng)元通路。研究人員采取高分辨率顯微鏡掃描了這些大腦區(qū)域，構建出了皮質(zhì)連接圖像數(shù)據(jù)庫。第17頁當研究人員分析這些連接時，他們發(fā)覺大腦皮質(zhì)是一個高度組織化網(wǎng)絡，由八個子網(wǎng)絡組成，它們協(xié)調(diào)活動反應動物情感和感覺。而且，子網(wǎng)絡之間以一個非常特殊方式來共享這一信息?！斑@些研究發(fā)覺挑戰(zhàn)了流行假說：大腦皮質(zhì)是一個單一網(wǎng)絡，在這一網(wǎng)絡中全部一切都密集連接在一起?！苯酉聛恚芯咳藛T可未來自這一主要哺乳動物模型系統(tǒng)解剖數(shù)據(jù)與大量現(xiàn)有分子遺傳數(shù)據(jù)合并來判別神經(jīng)細胞基本類型。“確定全腦結構組織將是朝著揭示腦功效以及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中功效障礙結構基礎邁出基本且令人興奮一步，”董宏偉說。第18頁我們真會永遠不老嗎？——從“科學狂人”抗衰老研究說起JohnCraigVenter身上從不缺乏話題。從單槍匹馬與人類基因組計劃展開競爭、時代雜志將他與人類基因組計劃代表FrancisCollins同時選為封面人物，到宣告制造出首個能夠自我復制活細胞“Synthia”，轟動了整個學術界，Venter每一個舉動，在學術界都會引發(fā)波瀾。前陣子，他又宣稱將組建新企業(yè)HLI，組建史上最大基因組數(shù)據(jù)庫，結合基因組學、生物信息學及干細胞療法，致力于抗衰老研究，并延長人類壽命。第19頁【為何我們會追求不老和長壽】對于不老和長壽探索，恐怕是除了“我們是誰”“我們從哪兒來”之外，人們思索第三個問題了——“我們能否一直存在下去”?！緦λダ虾烷L壽基因研究】有一個規(guī)律，很多問題，假如解釋不了，就說它是因為基因決定，多半錯不到哪里去。也所以，生物學家、醫(yī)學家們紛紛開始將遺傳學和分子生物學結合，從基因角度開始對長壽和衰老問題探索。第20頁當前基因方面研究主要有兩個方向，長壽基因和衰老基因。這里說并不是單一基因，而是與長壽和衰老相關各種基因，它們之間相互作用帶來了不老和長壽結果。衰老表現(xiàn)為染色體端粒長度改變、DNA損傷、甲基化等，衰老終點就是死亡，這些原因也是影響長壽原因。有科學家認為，端粒（細胞核兩端特殊DNA片段）長度決定生物壽命，端?？s短會造成細胞分裂停頓和死亡降臨。發(fā)覺端粒三位科學家取得了諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。當前“長壽基因”和“衰老基因”還不能完全確定，但有學者認為，消除自由基一些酶類基因、與細胞生長調(diào)控相關一些基因與長壽和衰老相關。對于長壽和衰老基因，科學上還需要繼續(xù)發(fā)覺更多相關基因，理清那些造成衰老、影響長壽基因群及其之間聯(lián)絡，才能在了解基因組基礎上，處理衰老、長壽問題。第21頁【其它長壽和抗衰老方法】除了基因研究外，還有抗衰老制劑研究。褪黑素與微量元素是被認為有抗衰老作用物質(zhì)。褪黑素自由基去除能力在眾多自由基去除劑中表現(xiàn)尤其突出，而微量元素攝入不協(xié)調(diào)，將造成衰老。還有一個說法，節(jié)食能夠延長壽命。這背后生物學原理是：生長激素和胰島素信號路徑在起作用。科學家經(jīng)過對猴子、酵母菌、果蠅等動物研究中驗證了降低卡路里攝入能夠延長壽命理論。另一些科學家提出引發(fā)機體衰老和疾病是自由基增多，這也是現(xiàn)實生活中那些宣稱“去除自由基，恢復年輕態(tài)”保健品所依賴理論基礎。這些保健品療效有限，請不要輕易嘗試。除了遺傳原因之外，人生活環(huán)境、人心理情況等多方面原因都會影響到壽命。保持愉悅心情，健康生活方式，良好飲食習慣，這么即使軀體不可防止老化，但還是有年輕心態(tài)，總好過長壽但不高興，年輕外表下，卻住著一個老靈魂。第22頁對于長壽基因及衰老基因發(fā)掘，也有不贊同聲音。他們認為這違反了倫理道德，假使我們不老不死，那么進化要領“生存和繁殖”，也會越來越少被考慮，我們將剝奪后代生存機會。技術進步帶來潛在社會問題，還有待深入去處理。就當前研究情況來看，長壽不意味著不會永生，科學幫助下，人們有機會將有限生命拉長，將有限生命過得更有質(zhì)量，實現(xiàn)不老不病愿望。此時又想到了Venter先生，據(jù)悉，Venter曾作為美國海軍醫(yī)療隊醫(yī)院參加越戰(zhàn)，戰(zhàn)場殘酷使他認識到生命和時間寶貴，他認為人生每一分鐘都應該有所創(chuàng)新。撇開進化需要不談，試想有一天，我們不再見變老，沒有疾病，壽命很長，我們是否還會像出生即知將死時候那樣，珍惜生命中每一天，而努力奮斗呢。第23頁3、熒光組織化學法

用特異性抗體顯示神經(jīng)組織化學成份方法。第24頁基本過程有：固定、制片、反應等三步。

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免疫組織化學反應：有直接法和間接法

l雙重免疫組織化學染色：主要是為了研究兩種物質(zhì)在同一細胞或突起內(nèi)共存現(xiàn)象，或含兩種不一樣化學物質(zhì)相互關系。第25頁免疫組化依據(jù)二抗標識不一樣（熒光素、酶、鐵蛋白、膠體金或銀標識），免疫組化包含免疫熒光、免疫酶組織化學、免疫金銀及鐵標識技術第26頁核酸分子雜交技術，檢測細胞內(nèi)mRNA和DNA序列片段，原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)基因表示?；驹硎且罁?jù)兩條單鏈核苷酸互補堿基序列專一配正確特點，應用已知堿基序列并含有標識物RNA或DNA片段即核酸探針（probe），與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸（RNA或DNA片段）進行雜交，經(jīng)過標識物顯示，在光鏡或電鏡下觀察目標mRNA或DNA存在與定位。4、原位雜交法

第27頁此項技術需首先制備某種核酸探針，其種類主要有三種：①利用大肝桿菌重組帶有目標基因質(zhì)粒DNA，制成互補DNA探針(cDNA)；②應用限制性核酸內(nèi)切酶消化制成線性DNA模板，在體外轉(zhuǎn)錄取得反義RNA探針(cDNA)；③依照待測核酸核苷酸序列，應用DNA合成儀合成寡聚核苷酸探針。cRNA和cDNA慣用標識物有32S、32P、3H等放射性核素和熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)。第28頁組織學應用原位雜交術主要是染色體原位雜交和細胞原位雜交。前者是研究遺傳基因、抗原基因、受體基因、癌基因等在染色體上定位與表示；后者是研究細胞某種蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄物mRNA在胞質(zhì)內(nèi)定位與表示。核酸分子雜交術有很高敏感性和特異性，它是免疫細胞化學基礎上，深入從分子水平探討細胞功效表示及其調(diào)整機制，已成為當前神經(jīng)生物學研究主要伎倆。第29頁5、受體定位法：研究受體在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)定位

配體法：主要在組織切片上進行，利用標識配體和受體結合以示蹤其部位

免疫組織化學法：用針對受體抗體第30頁6、神經(jīng)系功效活動形態(tài)定位法

脫氧葡萄糖法：原理是：神經(jīng)元活動時其能量代謝增加，而其能量代謝主要依賴葡萄糖。在腦內(nèi)存在脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)時，神經(jīng)元可不加區(qū)分地將2DG與葡萄糖一起攝入細胞內(nèi)，二者都是己糖激酶底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷酸己糖異構酶深入轉(zhuǎn)化為果糖-6-PO4，不能繼續(xù)在糖酵解循環(huán)中代謝。如在2DG上標以同位素。神經(jīng)元內(nèi)同位素堆積程度反應了神經(jīng)元活動程度。

第31頁c-fos(Fos)法：

c-fos是一個原癌基因，屬于即刻－早期基因類(immediate-earlygene).很多刺激條件可經(jīng)過第二信使引發(fā)神經(jīng)元c-fos表示增加，形成fosmRNA。由fosmRNA翻譯成Fos蛋白，馬上轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，與另一即刻早基因c-jun所產(chǎn)生蛋白Jun組成二聚體（第三信使），調(diào)整其靶基因表示，引發(fā)一系列細胞反應。

第32頁細胞色素氧化酶法：

神經(jīng)元線粒體內(nèi)細胞色素氧化酶是提供神經(jīng)元能量主要酶，細胞色素氧化酶水平與神經(jīng)元能量需求親密相關，普通反應慢性刺激結果。

第33頁二、生理學方法

損毀法

刺激法周身給藥法腦室注射法腦組織培養(yǎng)亞細胞分析神經(jīng)遞質(zhì)釋放量測定

神經(jīng)遞質(zhì)功效測定

行為學方法

最慣用有兩種：神經(jīng)行為學、電生理學第34頁1、神經(jīng)遞質(zhì)釋放量測定（在體invivo和離體invitro)推挽灌流法：

在體研究中樞核團遞質(zhì)釋放有用方法。經(jīng)過推挽灌流套管，使灌流液直接灌流腦組織，從流出液中分析神經(jīng)遞質(zhì)改變。

第35頁第36頁腦透析術(braindialysis)：在特定腦區(qū)內(nèi)，植入透析探頭，用生理溶液灌流時，細胞外液中神經(jīng)遞質(zhì)可順濃度遞度從透析管擴散至灌流液中，搜集和測定灌流液中神經(jīng)遞質(zhì)含量，就能監(jiān)測該遞質(zhì)改變過程。腦透析術裝置包含探頭、導管、微量灌流泵、樣品搜集器和定量分析儀。

第37頁第38頁第39頁

抗體微探針法：是在玻璃微電極上涂上一層神經(jīng)肽抗體，用于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)定位神經(jīng)肽釋放。硼硅玻璃與r－氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反應后在玻璃表面形成一層帶有游離氨基硅氧烷(siloxane)多聚體微粒。該玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)處理，使戊二醛與蛋白質(zhì)A以共價鍵方式偶聯(lián)，蛋白質(zhì)A再與神經(jīng)肽抗體結合，制成抗體微探針第40頁腦片灌流法

突觸體灌流法第41頁2、神經(jīng)遞質(zhì)功效測定

微電泳：能將微量神經(jīng)遞質(zhì)導入神經(jīng)元附近，觀察其作用?？贵w微量注射：特異性抗體注射在一些部位，可中和神經(jīng)末梢釋放出而進入突觸間隙神經(jīng)肽，預防其與受體結合。所以，抗體微量注射所引發(fā)功效改變可解釋為消除該神經(jīng)肽生理效應結果。生物檢測（Bioassay）:經(jīng)典方法.如用水蛭背最長肌測定ACh作用，靈敏度達10-10g.第42頁3、行為學方法

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經(jīng)典條件反射：代表了刺激與強化關系。l操作式條件反射：是經(jīng)過動物本身某個特定操作動作而取得食物或回避有害刺激反應活動。

第43頁Behavioralneuroscienceisthestudyoftheneuralmechanismsmediatingnormalandabnormalbehaviors.自主活動動物焦慮檢測：實施焦慮原因，如飲食或飲水剝奪，檢測反應，能夠用于藥品篩選。性和生殖行為：進化，神經(jīng)內(nèi)分泌作用機制學習記憶攝食行為驚慌反射社會行為

……..第44頁自主活動箱試驗動物自主活動標志著動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)，當中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮時，自主活動加強，抑制時則自主活動降低。觀察動物自主活動是評價中樞神經(jīng)興奮狀態(tài)一項主要指標。各種作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥品都可影響動物自主活動，因而自主活動統(tǒng)計是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥品主要方法，而且在新藥研究中，觀察藥品對動物自主活動影響也是評價藥品是否影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要方法．第45頁自主活動箱試驗主要技術指標：運動次數(shù)第46頁洞板試驗檢測小鼠自動活動，可用于新藥，普通藥理，神經(jīng)系統(tǒng)研究和中樞興奮性，抑制性研究。主要技術指標：小鼠探洞次數(shù)。第47頁學習記憶行為學檢測

學習記憶功效包含空間學習記憶功效和非空間學習記憶功效。伴隨對大腦學習記憶機制研究不停深入以及尋找有效防治認知障礙類疾病方法需要，使得動物行為學試驗成為研究腦高級功效及其它神經(jīng)科學不可缺乏主要伎倆，客觀準確地評價試驗動物學習記憶水平已成為神經(jīng)生物學和神經(jīng)藥理學中非常主要研究內(nèi)容。第48頁學習記憶功效檢測慣用試驗程序空間學習記憶任務非空間學習記憶任務Morris水迷宮T迷宮6或8臂放射狀水迷宮LashleyⅢ

迷宮放射狀迷宮（8臂、12臂）H-W迷宮Y迷宮新奇物體認知環(huán)形平臺嗅覺區(qū)分T迷宮穿梭箱試驗跳臺試驗第49頁Morris迷宮1981年，英國心理學家Morris首次設計應用了這種水迷宮及其程序。目標是幫助大腦學習記憶機制研究。起初試驗動物主要為大鼠，今后該迷宮系統(tǒng)成為評定嚙齒類動物空間學習和記憶能力經(jīng)典程序，廣泛利用于神經(jīng)生物學、藥學等領域基礎和應用研究中。第50頁Morris水迷宮應用:判斷動物空間學習記憶能力組成:觀察指標:潛伏期，路徑，不一樣象限停留時間和長度，搜索策略等第51頁Morris水迷宮第52頁第53頁Morris水迷宮原理水是嚙齒類動物非常厭惡刺激或環(huán)境。鼠在水池中就會急于尋找逃路。它們習性為在水池四面尋找出口逃避，但深而光滑垂直池壁妨礙了這種企圖。試驗中設置水下平臺（用于小鼠常為水面下1cm）可提供鼠棲身場所。但在巨大水面上，強迫游泳動物不能看見平臺。它們?nèi)粢焖僬业狡脚_而防止淹沒就必須利用環(huán)境中線索進行定位。從而檢測了鼠記住環(huán)境中線索及其與平臺位置關系而對平臺進行定位能力（學習記憶能力）。第54頁Morris水迷宮優(yōu)點因為對年紀相關性空間記憶損害有可靠敏感性，Morris水迷宮是判斷老年小鼠空間學習記憶能力尤其有用工具。驅(qū)動動物逃避是水刺激，而不需要食物和水剝奪。所以，防止了剝奪食物和水后給試驗動物帶來新陳代謝方面問題。動物無須接收電休克，這在那些食欲促進任務（appetitivetasks）如輻射狀迷宮和T迷宮中是常規(guī)要求。能提供較多試驗參數(shù)，系統(tǒng)全方面地考查試驗動物空間認知加工過程，客觀地反應其認知水平。將試驗動物學習記憶障礙和感覺、運動缺點等分離開來，降低它們對學習記憶過程檢測干擾。既能夠檢測空間參考記憶又能夠檢測空間工作記憶。在用固定平臺測試小鼠空間參考記憶后再將平臺位置改為不固定，就可檢測它們工作記憶能力。顯然，尋找不固定平臺認知過程要復雜一些，需要動物對時間和空間上分離信息加以整合和判斷。操作簡便，數(shù)據(jù)誤差較小。第55頁Morris水迷宮不足之處因為需要監(jiān)視系統(tǒng)及分析軟件，只有少數(shù)裝備很好試驗室能夠?qū)嵤?。試驗程序設計需要考慮原因較多，同時需要試驗者具備一定神經(jīng)生理學、認知生理學和數(shù)理統(tǒng)計方面知識，給試驗開展和結果解釋帶來困難，同時也限制了該迷宮深入廣泛應用。因為體力消耗太大，體溫也喪失過多，年老體弱鼠完成任務較困難。并非全部鼠株都適合于Morris迷宮測試，如BALB/c不能學會該任務（成績并不隨天數(shù)增加而進步），129/SvJ學習成績也偏差。個體間成績差異巨大。一些株，如129/SvJ株小鼠因為有年紀相關性視路病變(visualpathology)，在衰老時完成以視覺為基礎學習記憶任務時就會出現(xiàn)困難。在C57BL/6株，因為嚴重禿頭癥（alopecia）存在，可能使一些小鼠產(chǎn)生抑郁，加上潰瘍性皮炎，最終可能影響小鼠游泳能力而影響試驗成績。對輕微學習記憶能力減退，該迷宮程序可能不敏感。所占試驗場地過大。第56頁LashleyIII水迷宮第57頁LashleyIII水迷宮

是一個相對復雜迷宮。它含有動物必須學會防止盲端（culs-de-sac）和動物必須做出正確左或右拐彎T選擇。試驗進行5天，天天進行2次測試（上下午各1次）。天天2次測試被平均。指標包含：學習指數(shù)（正確進入數(shù)/進入總數(shù)）、游向目標時盲端進入數(shù)及T選擇錯誤數(shù)、向后進入總數(shù)、逃生所用時間等。第58頁八臂放射狀旱迷宮八臂放射狀旱迷宮，是Olten和Samnelson在1976年設計，做為一個評定大鼠空間學習記憶方法。它能夠同時評定試驗動物工作記憶和參考記憶。原理利用食物作為激勵辦法而抵達目標地，饑餓動物需要實施尤其搜索次序或利用最短時間或最小錯誤來尋求獎賞。第59頁八臂放射狀旱迷宮裝置八臂放射狀旱迷宮是由從中央平臺伸出8個相等臂呈放射狀排列組成，8臂中有4臂末端放有食物，在同一天整個試驗過程中哪些臂中含有食物保持固定不變，但天天之間都有改變。迷宮周圍有若干空間線索。試驗前大鼠需被剝奪食物和水，試驗開始時，大鼠被放在中央平臺處后去尋找食物。在試驗中大鼠需記住哪些臂已被探索過，食物已被攝取，以防止再次進入，從而在最短時間內(nèi)取得最大量食物。同時，在天天試驗結束后，大鼠還必須放棄當日記憶信息，以準備適應第二天試驗。第60頁八臂放射狀旱迷宮應用評定動物工作記憶和參考記憶

工作記憶是指利用一個僅僅在短時間內(nèi)保留信息，或稱為試驗特定信息（trial-specificinformation）而取得記憶，它是對試驗中可變事物記憶能力。

參考記憶是對連續(xù)存在信息，或稱為任務特定信息（task-specificinformation）記憶，它是對試驗中不變事物記憶能力。第61頁八臂放射狀旱迷宮觀察指標時間測定和錯誤積分存在問題優(yōu)點：同時評定試驗動物工作記憶和參考記憶不足：氣味影響。包含食物氣味、其它動物氣味以及動物本身氣味。試驗動物被限制食物和水，由此會帶來影響。而且不一樣食物獎賞也可產(chǎn)生顯著影響；另外，動物種屬不一樣使其在食物需求上也可造成不一樣結論。第62頁穿梭箱試驗試驗裝置試驗箱大小為50cm×16cm×18cm。箱底部格柵為能夠通電不銹鋼棒，箱底中央部有一高1.2cm擋板，將箱底部分隔成左右兩列。試驗箱頂部有光源，蜂鳴音控制器。訓練時，將大白鼠放入箱內(nèi)任何一側，20s后開始展現(xiàn)燈光和（或）蜂鳴音，連續(xù)15s，后10s內(nèi)同時給以電刺激(100V，O.2mA，50Hz，AC)。最初，動物只對電擊有反應，即逃至對側以回避電擊。20s后再次出現(xiàn)條件刺激并繼之在動物所在側施以電刺激，迫使動物跳至另一側……如此來往穿梭。當蜂鳴音或／燈光信號展現(xiàn)時，大白鼠馬上逃至對側安全區(qū)以躲避電擊，即認為出現(xiàn)了條件反應(或稱主動回避反應)。每閑天訓練一回，每回100次。約訓練4—5回后．動物主動回避反應率可達80％～90％。此法可同時觀察被動和主動回避性反應.另外．從動物反應次數(shù)也能夠了解動物系處于興奮或抑制狀態(tài)。第63頁穿梭箱試驗自動統(tǒng)計系統(tǒng)能夠輸出以下內(nèi)容：(1)動物序號；(2)遭受刺激次數(shù)；(3)遭受刺激時間；(4)主動回避反應時間。以上各值均為在設定穿梭次數(shù)內(nèi)反應總和。遭受電激次數(shù)是被動回避次數(shù)，該值與設定循環(huán)次數(shù)之差即為主動回避次數(shù)；刺激時間是指動物在被動回避過程受到電刺激時間和，該值愈小，說明動物被動反應愈靈敏，主動回避時間是指動物在接收條件刺激時間長短，該值越短，說明動物主動回避反應越快速．第64頁跳臺試驗

跳臺試驗屬一次性刺激回避反應試驗（ONETRAILAVOIDANCETEST）。裝置：試驗裝置為一長方形反射箱，大小為10cm×10cm×60cm，用黑色塑板分割成5間。地面鋪以柵欄，間距0.5cm，能夠通電，每間角落置一高和直徑均為4.5cm平臺。第65頁跳臺試驗原理

在一個開闊空間，動物大部分時間都在邊緣及角落里活動。在一個方形中心設置一個高平臺，當把動物放在平臺時，它幾乎馬上跳下平臺并向四面探索靠近邊緣指標潛伏期：統(tǒng)計動物從上平臺到第一次下平臺時間操作步驟一個經(jīng)典例子包含三個過程：熟悉過程

學習過程

記憶檢測熟悉過程：將動物放在平臺上，開始計時，至動物跳下。此時間段為潛伏期。動物探索10s以后，放回籠中學習過程：動物一旦從平臺上跳下后，馬上受到電刺激，然后放回籠中記憶檢測：學習試驗24h后，將試驗動物重新放回平臺上，統(tǒng)計跳下平臺潛伏期。動物跳下平臺或連續(xù)停留在平臺上標志著驗結束（終止時間為60s）。將動物放入反應箱內(nèi)適應環(huán)境3min，然后馬上通以36V交流電。動物受到電擊，其正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激。多數(shù)動物可能再次或?qū)掖翁翓艡谏?，受到電擊后又快速跳回平臺。如此訓練5min，并統(tǒng)計每鼠受到電擊次數(shù)或叫錯誤次數(shù)（numberoferrors），以此作為學習成績。24h后重做測試，此即叫記憶保持測試。統(tǒng)計受電擊死亡動物數(shù)、第一次跳下平臺潛伏期和3min內(nèi)錯誤次數(shù)。第66頁三、電生理學方法

電生理學方法包含胞外統(tǒng)計、胞內(nèi)統(tǒng)計、腦內(nèi)電刺激、電壓鉗、膜片鉗、腦電圖等技術。1、電生理慣用儀器

陰極射線示波器:高靈敏度，掃描速度慢

生物電放大器

電子刺激器

貯存和分析電生理試驗結果儀器：如示波器攝影機和計算機。第67頁2、電生理學慣用方法

細胞外統(tǒng)計(Extracellularrecording)：把引導電極安放在神經(jīng)組織表面或附近引導神經(jīng)組織電活動。胞內(nèi)統(tǒng)計(Intracellularrecording)：研究神經(jīng)元基本生物物理特征有力伎倆。EPSP,IPSP,AP(動作電位)腦內(nèi)電刺激：是研究中樞功效定位方法之一。

第68頁順行沖動統(tǒng)計法(Orthodromicimpulserecording)：就是電刺激某一突觸前細胞體、樹突或軸突，在此突觸后神經(jīng)元細胞體上統(tǒng)計此刺激引發(fā)電活動改變。逆行沖動統(tǒng)計法(Antidromicimpulserecording)：逆行沖動統(tǒng)計法即電刺激神經(jīng)元軸突主干或末梢，在同一神經(jīng)元胞體統(tǒng)計反相傳導動作電位。

第69頁電壓鉗技術(VoltageClamp)：經(jīng)過插入細胞內(nèi)一根微電極向細胞內(nèi)補充電流，補充電流量恰好等于跨膜流出反向離子流，這么即使膜通透性發(fā)生改變時，也能控制膜電位數(shù)值不變。經(jīng)過離子通道離子流與經(jīng)微電極施加電流方向相反，數(shù)量相等。

第70頁SG:信號發(fā)生器，F(xiàn)BA:反饋放大器，V監(jiān)測膜電位第71頁膜(斑)片鉗技術（PatchClamp）：能夠從分子水平研究細胞膜離子通道功效，是用玻璃微電極吸管和只含１～３個離子通道，面積為幾個平方微米細胞膜經(jīng)過負壓吸引封接起來，因為電極尖端與細胞膜高阻封接，此片膜內(nèi)開放所產(chǎn)生電流流進玻璃吸管，用一極敏感電流監(jiān)視器（斑片鉗放大器）測量此電流強度，就代表單一離子通道電流。第72頁膜片鉗（patchclamp）

內(nèi)爾(Neher)薩克曼(Sakmann)

（1944-）（1942-）（德國細胞生理學家）（德國細胞生理學家）

合作創(chuàng)造了膜片箝技術，并應用這一技術首次證實了細胞膜上存在離子通道。這一結果對于研究細胞功效調(diào)控至關主要，可揭示神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及糖尿病等各種疾病發(fā)病機理，并提供治療新路徑。二人共獲1991年諾貝爾獎。第73頁膜片鉗第74頁經(jīng)典統(tǒng)計模式：貼附式（Cell-attached或oncell)

內(nèi)膜向外式(Inside-out)

外膜向外式(Outside-out)

全細胞統(tǒng)計方式(Whole-cellrecording)第75頁第76頁

第77頁第78頁腦電波測定:

用雙極或單極引導法，將引導電極放在腦活動區(qū)顱骨表面之上，能夠統(tǒng)計出能變換方向微弱電流。經(jīng)過強力放大統(tǒng)計出來電位稱腦電圖（ＥＥＧ）。

第79頁誘發(fā)電位:

中樞神經(jīng)任何部位對于有意刺激感受器官，感受神經(jīng)、感覺通路上任何一點，或與感覺器官相關任何結構上一點，所產(chǎn)生電改變，叫做誘發(fā)電位（evokedpotential)。

第80頁經(jīng)典生物化學方法包含：離心電泳層析質(zhì)譜等因為生物化學方法與藥理學、免疫學等其它學科相結合，又發(fā)展了：放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)放射受體免疫印跡等方面四、生物化學方法

第81頁1、用離心法分離制備突觸小體及突出小體膜突觸小體:是指腦組織在等滲溶液中勻漿時，神經(jīng)末梢細胞膜從軸突上自發(fā)斷裂、封閉而形成神經(jīng)末梢單位。它包含突觸前膜、突觸后膜及致密斑和包圍在突觸前膜突觸小泡(vesicle內(nèi)含神經(jīng)遞質(zhì))，線粒體及胞漿蛋白質(zhì)。因為突觸小體是神經(jīng)介質(zhì)及受體主要聚集部位，突觸小體制備便成了神經(jīng)介質(zhì)及受體基本制備伎倆。

第82頁離心（centrifuge）離心技術主要用于各種生物樣品分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，因為巨大離心力作用，使懸浮微小顆粒（細胞器、生物大分子沉淀等）以一定速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒質(zhì)量、大小和密度。第83頁離心離心機種類制備型離心機

普通：（6000rpm以下）高速冷凍（25000rpm以下）超速（可達50000～80000rpm）分析型離心機第84頁離心制備型離心方法差速沉降離心法

密度梯度區(qū)帶離心法（簡稱區(qū)帶離心法）

第85頁2、層析法:

特點：分離生物活性物質(zhì)時不使其失活，可大量制備。基本原理：被分離物質(zhì)與支持物相互作用緊密程度不一樣，流洗時被洗脫難易程度不一樣。

第86頁慣用層析方法離子交換層析凝膠過濾層析親和層析疏水層析高效液相第87頁第88頁離子交換層析第89頁凝膠過濾層析第90頁親和層析第91頁3、放射免疫(radioimmunoassay,RIA)測定神經(jīng)介質(zhì)：利用抗體(Ab)特異地識別其抗原（Ag）原理，將抗原標識放射性同位素（*Ag），用來測定與*Ag抗原性相同物質(zhì)。

第92頁4、放射受體測定受體法：

利用標識能作用于不一樣靶組織內(nèi)各種受體遞質(zhì)和激素，從而到達直接測定配體與其受體形成絡合物過程和理化特征。第93頁5、免疫印跡法（immunoblotting或westernblotting）判定生物分子：是將電泳凝膠分離出來電泳帶移到特殊濾膜上，再利用標識抗體與濾膜上某一蛋白質(zhì)或肽特異結合，使其顯色。優(yōu)點：一是將傳統(tǒng)電泳凝膠染色法敏感度提升了100~1000倍，二是RIA與相同，能從各種蛋白質(zhì)中選擇判定出一個特異蛋白質(zhì)，其敏感性可達1ng，同時又能知道這一蛋白質(zhì)分子量，這又是RIA無法到達。第94頁6.電泳電泳是指帶電顆粒在電場作用下發(fā)生遷移過程。電泳技術就是利用在電場作用下，因為待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)差異，使帶電分子產(chǎn)生不一樣遷移速度，從而對樣品進行分離、判定或提純技術。電泳技術有很各種方法，介紹最慣用兩種：第95頁水平板式電泳槽垂直板式電泳槽穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀第96頁蛋白質(zhì)SDS電泳第97頁第98頁染色結果第99頁瓊脂糖凝膠電泳天然瓊脂（agar）是一個多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物組成中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一個含硫酸根和羧基強酸性多糖，因為這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強電滲現(xiàn)象。所以，當前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。

瓊脂糖凝膠電泳慣用于分離、判定核酸:如重組質(zhì)粒判定，DNA酶譜制作等。第100頁瓊脂糖濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度/%線狀DNA大小/kb0.5

0.7

1.0

1.2

1.5

2.030-1

12-0.8

10-0.57-0.4

3-0.2

2-0.05第101頁凝膠制備與電泳第102頁樣品配制與加樣第103頁染色和拍照第104頁第105頁五、分子生物學方法

１、神經(jīng)生物學研究中慣用分子生物學方法基因分子克隆克隆后基因在人工體外表示系統(tǒng)或細胞中表示克隆后基因作為探針研究基因表示組織特異性和發(fā)育階段特異性研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)結構特征有利于了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制

第106頁2、聚合酶鏈式反應（PCR）：在神經(jīng)生物學研究中有廣泛用途，如可應用它發(fā)覺和分析新基因，測定mRNA

第107頁３、反向遺傳學利用制造體內(nèi)基因突變方法研究基因及其產(chǎn)物功效：經(jīng)過制造定向突變改變生物表型方法與傳統(tǒng)遺傳學所采取經(jīng)過生物表型確定其基因型方法相反，故稱反向遺傳學。

第108頁４、遺傳連鎖分析法分離遺傳病基因：人類基因組由23條染色體組成，基因組內(nèi)大約包含5~10萬個基因，其中40%在腦內(nèi)表示。約有1000各種遺傳病含有顯著中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，占已知遺傳病總數(shù)三分之一。

第109頁六、腦成像（Brainimaging）技術

利用各種方法和技術來攝取人及