農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)xxx公司農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解低溫離心機(jī)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)等儀器的使用。2學(xué)習(xí)真核生物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化原理；掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的實(shí)驗(yàn)方法，了解轉(zhuǎn)基因技術(shù)的操作流程。二、實(shí)驗(yàn)原理農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤。農(nóng)桿菌通過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過(guò)改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基配制一、儀器和試劑1、儀器：高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)2、藥品：Beefextract(牛肉浸膏)5g/L，Yeastextract(酵母提取物)1g/L，Peptone(蛋白胨)5g/L，Sucrose(蔗糖)5g/L，100ml，Agar(瓊脂)100ml，MS粉，有機(jī)溶液，肌醇，F(xiàn)e鹽，NAA（萘乙酸），6-BA（6-芐氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），鏈霉素（str）。二、實(shí)驗(yàn)方法第一組配制YEB固體培養(yǎng)基1、配制250mlYEB固體培養(yǎng)基：先稱取Beefextract(牛肉浸膏)；Peptone(蛋白胨)；Yeastextract(酵母提取物)；Sucrose(蔗糖)；1g；瓊脂粉；將上述藥品置于250ml三角瓶中，用量筒稱取200ml蒸餾水將其溶解混勻，然后再定容至250ml，用NaOH調(diào)pH=。2、滅菌：將盛有250ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、抗生素的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到50-60℃時(shí)（手可觸摸）加入已經(jīng)過(guò)濾好的抗生素（100μg/mlkan+50μg/mlStr+50μg/mlrif），以免溫度過(guò)高導(dǎo)致抗生素失效。

4、倒板：將抗生素與培養(yǎng)基混勻，每個(gè)平皿倒15ml培養(yǎng)基，可以倒16個(gè)平皿，倒完后打開平皿蓋，在紫外燈下照10min，等待培養(yǎng)基凝固，蓋上平皿蓋，封口備用。

第二組配制YEB液體培養(yǎng)基1、配制500mlYEB液體培養(yǎng)基：先稱取Beefextract(牛肉浸膏)；Peptone(蛋白胨)；Yeastextract(酵母提取物)；Sucrose(蔗糖)；2g；將上述藥品置于500ml三角瓶中，用量筒稱取450ml蒸餾水將其溶解混勻，然后再定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=。2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、抗生素的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到50-60℃時(shí)（手可觸摸）加入已經(jīng)過(guò)濾好的抗生素（100μg/mlkan+50μg/mlStr+50μg/mlrif），以免溫度過(guò)高導(dǎo)致抗生素失效。

4、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到試管和三角瓶中，每個(gè)試管中分裝5ml，分裝12個(gè)試管。每個(gè)三角瓶中倒入35ml，共12個(gè)三角瓶。5、分裝好后，封口備用。第三組配制MS液體培養(yǎng)基1、配制500mlMS液體培養(yǎng)基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸餾水，稱取粉置于蒸餾水中，攪拌均勻；再向其中加入5ml100倍Fe鹽濃縮液；5ml100倍肌醇濃縮液；5ml有機(jī)溶液的混合液，然后混勻定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=。2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、乙酰丁香酮的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到50-60℃時(shí)（手可觸摸）加入已經(jīng)過(guò)濾好的乙酰丁香酮。

4、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到三角瓶中，每個(gè)三角瓶中倒入40ml，共12個(gè)三角瓶。5、分裝好后，封口備用。第四組配制MS共培養(yǎng)基1、配制500mlMS固體共培養(yǎng)基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸餾水，稱取粉置于蒸餾水中，攪拌均勻；再向其中加入5ml100倍Fe鹽濃縮液；5ml100倍肌醇濃縮液；5ml有機(jī)溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（按照實(shí)際需要，根據(jù)母液濃度計(jì)算用量），混勻定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=，然后再加入7%的瓊脂粉。2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到平皿中，每個(gè)平皿中倒入25ml，共20個(gè)平皿。4、分裝好后，封口備用。第五組配制MS分化篩選培養(yǎng)基1、配制1000mlMS固體共培養(yǎng)基：用2個(gè)500ml三角瓶進(jìn)行盛取，先在500ml三角瓶中加入400ml蒸餾水，稱取粉置于蒸餾水中，攪拌均勻；再向其中加入5ml100倍Fe鹽濃縮液；5ml100倍肌醇濃縮液；5ml有機(jī)溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（按照實(shí)際需要，根據(jù)母液濃度計(jì)算用量），混勻定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=，然后再加入7%的瓊脂粉。2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到平皿中，每個(gè)平皿中倒入25ml，共40個(gè)平皿。4、分裝好后，封口備用。第六組配制MS生根培養(yǎng)基1、配制500mlMS固體共培養(yǎng)基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸餾水，稱取粉置于蒸餾水中，攪拌均勻；再向其中加入5ml100倍Fe鹽濃縮液；5ml100倍肌醇濃縮液；5ml有機(jī)溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（根據(jù)母液濃度計(jì)算用量），混勻定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=，然后再加入7%的瓊脂粉。2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱，用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到100ml三角瓶中，每個(gè)三角瓶中倒入35ml，共14個(gè)三角瓶。4、分裝好后，封口備用。實(shí)驗(yàn)二植物轉(zhuǎn)化工程菌的制備一、儀器和試劑1儀器：低溫離心機(jī)（德國(guó)EPPENDORF公司）；恒溫培養(yǎng)箱（哈東聯(lián)）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），恒溫?fù)u床。2試劑：根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens.)菌種EHA105，YEB培養(yǎng)基，接種環(huán)，牙簽。二、實(shí)驗(yàn)方法1、將農(nóng)桿菌接種于附加50mg/L卡那霉素、50mg/L鏈霉素、50mg/L利福平的YEB固體培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48h，至長(zhǎng)出單菌落。2、用接菌環(huán)挑取單菌落，接種在含相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，于28℃，180rpm，培養(yǎng)過(guò)夜。3、待菌液長(zhǎng)至OD600為~時(shí)，將其按1∶10的比例接種到新鮮的上述培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行二次活化。實(shí)驗(yàn)三農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化一、儀器和試劑1儀器：超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），植物組織培養(yǎng)箱。2試劑：根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens.)菌種EHA105，紅花無(wú)菌苗，MS液體培養(yǎng)基，共培養(yǎng)基（MS+6-BA+NAA），手術(shù)刀，鑷子，剪刀，濾紙，培養(yǎng)皿。二、實(shí)驗(yàn)方法1、當(dāng)農(nóng)桿菌OD600為~時(shí)，吸取菌液于無(wú)菌50ml離心管中，2000rpm，離心10min，棄上清，收集菌體，用等體積的MS液體培養(yǎng)基將菌體重懸，備用。2、侵染

取紅花無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)中將子葉上下邊緣切掉，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量重懸好的菌液，侵染8~25min（第一組侵染8min，第二組侵染10min，第三組侵染12min，第四組侵染15min，第五組侵染20min，第六組侵染25min），此間要不時(shí)的搖動(dòng)。3、除菌侵染完成后，棄去菌液，用無(wú)菌濾紙吸干多余的菌液。4、共培養(yǎng)

侵染過(guò)的紅花子葉接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)3d，觀察是否有農(nóng)桿菌過(guò)量生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化一、儀器和試劑1儀器：超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），植物組織培養(yǎng)箱。2試劑：根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens.)菌種EHA105，紅花無(wú)菌苗，無(wú)菌水，分化培養(yǎng)基（MS+6-BA），濾紙，鑷子，培養(yǎng)皿。二、實(shí)驗(yàn)方法1、除菌

取共培養(yǎng)后染菌的植物材料，放于無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，先用無(wú)菌水（可以添加抗生素）沖洗至溶液澄清為止。（如果沒(méi)有農(nóng)桿菌滋生的，此步