園藝學(xué)實驗技術(shù)思考題及答案

園藝學(xué)實驗技術(shù)思考題及答案園藝學(xué)實驗技術(shù)思考題及答案園藝學(xué)實驗技術(shù)思考題及答案xxx公司園藝學(xué)實驗技術(shù)思考題及答案文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計，管理制度1、請闡明PCR的原理和引物設(shè)計的注意事項原理：PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍注意事項：①引物長度：15-30bp，常用20bp左右；②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增至10kb的片段；③引物堿基：G+C含量為40-60%為宜，ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列；④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端互補(bǔ)；⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對；⑥引物中最好有合適的酶切位點；⑦引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他序列無明顯同源性；⑧序列Tm為55-60℃2、試述Southern技術(shù)的原理，操作和注意事項原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。操作：①基因組酶切；②用瓊脂糖凝膠電泳隊DNA片段按分子量大小分離；③將DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳變性成單鏈后，再轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)墓枢l(xiāng)支持物上并與之結(jié)合（即轉(zhuǎn)膜）；④探針與膜上DNA雜交；⑤檢測注意事項：①將凝膠中和至中性時，要測定pH，防止凝膠的堿性破壞硝酸纖維膜；②要注意趕走凝膠和濾紙及硝酸纖維膜之間的氣泡3、試述Northern技術(shù)的原理操作和注意事項原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。操作：①RNA的提??；②RNA變性電泳；③RNA轉(zhuǎn)移和固定（即轉(zhuǎn)膜）；④探針與膜上的RNA雜交；⑤檢測注意事項：①用于RNA電泳、轉(zhuǎn)膜的所有器材均須預(yù)處理以除去RNAse，以免樣品的降解；②轉(zhuǎn)膜時，注意趕走氣泡4、試述質(zhì)粒提取的原理和注意事項原理：堿裂解法提取質(zhì)粒利用的是共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線狀的染色體DNA片段在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于這個狹窄的范圍內(nèi)，線狀的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開變性，在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖然斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此依然相互盤繞而緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入的醋酸鉀高鹽緩沖液使pH降低后，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈迅速而準(zhǔn)確地復(fù)性，而線狀的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，不能迅速而準(zhǔn)確地復(fù)性，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，線狀的染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來，而閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻留在上清液中。注意事項：（堿裂解法）①加入溶液2后不要劇烈振蕩，只需輕輕顛倒幾次離心管；②加入溶液2后，復(fù)性時間不宜過長，一般是5分鐘，否則會使染色體復(fù)性；③在用苯酚、氯仿抽提時應(yīng)用TE緩沖液將原溶液的體積擴(kuò)大，一般是200～300微升，以減少DNA的損失；④在加入酚氯仿的步驟中，最好用未高溫滅菌的離心管，因為高溫過程中可能使管口變形，使得振蕩混勻過程中酚氯仿容易溢出；⑤溶液2不可冷凍,現(xiàn)用現(xiàn)配；⑥提取過程應(yīng)盡量在低溫環(huán)境進(jìn)行；⑦反應(yīng)中加入的研濃度要控制好5、試述載體構(gòu)建的流程和注意事項流程：①克隆目的基因片段：設(shè)計引物，進(jìn)行目的基因片段的pcr，連T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提質(zhì)粒，通過pcr或酶切鑒定；②酶切：用相同的酶酶切插入目的片段的T載體及表達(dá)載體，回收目的片段與表達(dá)載體的大片段；③連接：連接回收的目的片段與表達(dá)載體的大片段，重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，酶切鑒定注意事項：①設(shè)計引物時酶切位點前加上適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)堿基，否則將不能有效酶切；②PCR產(chǎn)物最好純化后再進(jìn)行酶切，酶切時注意內(nèi)切酶最后加入，每次取樣更換槍頭，用完后立即放入-20度冰箱；酶量不超過反映總體系的10%；多種酶消化時若緩沖液條件相同，可同時加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或高鹽的酶消化連接時注意DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3~10倍;平端的連接效率比粘性末端要低得多，T4DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度要適當(dāng)加大。6、試述細(xì)胞全能性的概念，以及其對分子育種的意義概念：多細(xì)胞生物中的每個體細(xì)胞都含有該生物的整套遺傳物質(zhì)，在適宜條件下具有發(fā)育成完整個體的潛力。意義：①體細(xì)胞克隆變異是指植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的變異。體細(xì)胞克隆變異可以應(yīng)用在抗病、抗除草劑育種上。在耐鹽、耐低溫、抗重金屬等突變體方面也開展了工作。②單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種利用：花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以單個花藥粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。優(yōu)點：花粉已是單倍體細(xì)胞，發(fā)育成的小植株都是單倍體植株或雙單倍體，不含有因干擾而形成的體細(xì)胞植株；缺點：培養(yǎng)難度大③幼胚培養(yǎng)與遠(yuǎn)緣雜交育種：植物胚胎培養(yǎng)是指使胚及具有胚器官（如子房、胚珠）在離體無菌培養(yǎng)條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)，是植物遠(yuǎn)緣雜交育種的重要輔助手段，克服了遠(yuǎn)緣雜交種胚的早期敗育現(xiàn)象，提高遠(yuǎn)緣雜交種的成苗率，使種子無生活力的植株獲得后代，使胚發(fā)育不全的植物獲得后代，克服種子休眠，提早結(jié)實，縮短育種周期，克服柑橘類合子胚不能生長現(xiàn)象。7、試述瓊脂糖凝膠電泳的原理原理：許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動，即電泳過程。瓊脂糖主要在電泳中作為一種固體支持基質(zhì)。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使瓊脂糖凝膠有較好的抗對流性質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。8、石蠟包埋過程應(yīng)注意的問題①包埋前應(yīng)該將鑷子和溶化的石蠟放在恒溫箱中，溫度65-70℃為宜；②材料應(yīng)盡量放在石蠟底部，使石蠟完全淹沒材料；③材料放好后，輕輕吹一口氣，是石蠟的表面形成一層膜，再放入冷水中，使石蠟迅速冷卻；④控制溫度，溫度過高石蠟中容易出現(xiàn)氣泡，溫度過低使石蠟在操作過程中凝固；⑤石蠟使用前要過濾，除去雜質(zhì)，用濾紙過濾比紗布效果好9、投射電鏡主要由哪三大系統(tǒng)組成其中每個系統(tǒng)主要包括哪些部分電子光學(xué)系統(tǒng)：電子槍、磁電子透鏡、樣品室、觀察記錄儀；真空系統(tǒng)：真空泵、閥門、真空管道、檢測儀；成像系統(tǒng)：物鏡、中間鏡、攝像鏡10、簡述投射電鏡的成像原理電子束在真空條件下經(jīng)高壓加速后形成快速電子束流，這時不帶樣品信息的入射電子射線與樣品發(fā)生作用。由于樣品的厚度和質(zhì)量有差異，使信號產(chǎn)生差異。電子束信號經(jīng)過磁透鏡構(gòu)成的物鏡，獲得被檢物的正確放大像。最后再經(jīng)投影鏡再次放大，形成觀察和拍攝的最終差異。11、簡述普通超薄切片下樣品制備的基本過程①取材：選擇有代表性、新鮮健康的材料，并且要求小而精、保持完整，要求動作快，1min內(nèi)進(jìn)入固定相；②殺死、固定和保存：一般選擇殺死、固定和保存劑兼作的化學(xué)藥品，常用甲醛。殺死過程應(yīng)迅速，盡量使材料保持其自然狀態(tài)；③漂洗與脫水：用固定液相應(yīng)的緩沖液清洗。用脫水劑置換出材料中的水分，使材料變硬，形狀更固定，常用脫水劑有酒精和丙酮。脫水過程應(yīng)從低濃度開始，逐漸更換到高濃度；④透明：使用一種既能與脫水劑又能與包埋劑相混合的溶劑，常用透明劑有二甲苯和氯仿；⑤浸透和包埋：經(jīng)透明后，用石蠟浸透，除去材料中的二甲苯，而代之以石蠟。常用的包埋劑有環(huán)氧樹脂、乙二醇甲基丙烯酸酯；⑥切片：先用石蠟修剪成六面體，再同切片機(jī)切片；⑦粘片：用粘貼劑將石蠟切片粘貼于載玻片上；⑧染色：染色前，將石蠟溶去，用二甲苯去蠟，在逐步移入酒精或者水中，染色劑一般用番紅-固綠二重燃料；⑨固封：固封劑有加拿大樹膠、甘油膠和糖漿等12、制備掃描電鏡的樣品有哪些干燥方法①空氣干燥法：又稱自然干燥法，將經(jīng)過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥；②臨界點干燥法：利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時，其表面張力等于零的特性，使樣品的液體完全汽化，并以氣體方式排掉，來達(dá)到完全干燥的目的；③冷凍干燥法：將經(jīng)過冷凍的樣品置于高真空中，通過升華除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冷凍干燥法有兩種，即含水樣品直接冷凍干燥和樣品脫水后冷凍干燥；13、制備免疫電鏡的樣品時，為什么要進(jìn)行對照實驗樣品的制備過程比較復(fù)雜，會受到多種因素的影響，如抗原的活性、微環(huán)境的成分、抗體的特異性、抗體稀釋的比例、各種溶液（固定祥和緩沖液）成分、pH、投射壓、溫度、作用時間和電子染色的效應(yīng)等。為了排除干擾因素的影響，增加實驗的可靠性，就需要根據(jù)具體情況進(jìn)行對照實驗。14、簡述鹽析和透析的基本原理和技術(shù)要點鹽析的基本原理：高濃度鹽的水合作用破壞了蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。不同蛋白質(zhì)帶電荷水化程度不同，鹽濃度不同，可將不同蛋白質(zhì)加以分離。鹽析的技術(shù)要點：大多數(shù)蛋白質(zhì)用55%硫酸銨沉淀，80%、85%硫酸銨是最大沉淀，將蛋白質(zhì)溶液燒杯放入有冰塊的大燒杯中，用磁力攪拌器攪拌，加入硫酸銨至飽和，5-10min完成。攪拌10-30min，10000xg離心10min，棄上清，沉淀懸浮于1-2倍緩沖液中，透析、超濾、脫鹽柱除去硫酸銨。透析的基本原理：利用蛋白質(zhì)分子不透過半透膜的性質(zhì)，通過不斷更換透析袋外側(cè)的溶液將蛋白與其他小分子物質(zhì)分離。透析的技術(shù)要點：新購買的透析袋含甘油等雜質(zhì)，先用水煮10min，后用70%酒精冰箱保存。將預(yù)處理過的透析袋一端扎緊，用移液管或漏斗將待透析液移入透析袋中，不能裝滿，留一半左右空間，扎緊口，浸入裝有大量純凈溶劑的量筒或玻璃缸中。透析液與純凈溶液在攪拌時體積比為1：10，靜態(tài)體積比1：20。15、什么叫電泳簡述電泳的基本原理電泳：在外電場作用下，帶電顆粒向與其電性相反的電極移動?；驹恚喝芤褐械牡鞍踪|(zhì)具有許多可接力的酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)，在一定pH值條件下，就會解離帶電。帶電性質(zhì)和電荷多少決定于蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)、溶液pH及離子強(qiáng)度。帶電的蛋白質(zhì)分子在電場中會朝著自己所帶電荷相反的電極方向移動，根據(jù)帶電性質(zhì)不同有不同的遷移率，因此可用于分離不同的蛋白質(zhì)。16、原子吸收分光光度法與火焰光度法有何異同點主要應(yīng)用于哪些方面共同點：都是發(fā)射出特定波長的光，通過單色器分出該元素的特征譜線，并用光電檢測器測定其發(fā)射強(qiáng)度。不同點：前者測定范圍廣，靈敏度高，選擇性強(qiáng)，操作簡便、快速，重復(fù)性好。后者只能測定無機(jī)元素，精確性受到很多因素干擾。應(yīng)用：前者用于植物分析、肥料分析、土壤分析、食品飼料分析和生物化學(xué)分析；后者用于無機(jī)元素特別是鈣、鎂、錳等，土壤和植物的元素分析，生物大分子、細(xì)胞和組織中金屬元素的分析。17、在采用凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，為何向電泳體系中加入SDSSDS是一種陰離子表面活性劑，帶有大量負(fù)電荷。當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，使蛋白質(zhì)失去原有帶電狀態(tài)而只帶負(fù)電荷，消除了蛋白質(zhì)間天然的電荷差異；同時引起蛋白質(zhì)構(gòu)想的改變，均形成長橢圓棒狀，消除了蛋白質(zhì)間的形態(tài)差異。這樣的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率只與橢圓棒的長度即蛋白質(zhì)的相對分子量的函數(shù)有關(guān)，有利于蛋白質(zhì)的分離。18、相對離心力為30000xg，轉(zhuǎn)頭平均半徑為10cm，求轉(zhuǎn)速rRCF=×10-5×R×rpm2rpm2=30000×105/×10)rpm=19、簡述測定過氧化物酶活性的生理意義過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關(guān)系。在植物生長發(fā)育股過程中他的活性不斷發(fā)生變化。因此測量這種酶的活性，可以反映特定時期植物體內(nèi)代謝的變化。20、免疫印跡雜交技術(shù)（WesternBlot）的工作原理應(yīng)用在哪些方面工作原理：與Southern或Northern雜交方法類似，但Western雜交采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，探針是抗體，顯色用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多態(tài)類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體其免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射性自顯影以檢測電泳分離的特異目的基因表達(dá)的蛋白成分。應(yīng)用：抗原的純化和濃縮，檢測靶蛋白的有無，目的基因是否表達(dá)的鑒定，該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。21、TTC法快速測定種子生命力的理論依據(jù)是什么在實驗操作中應(yīng)注意些什么理論依據(jù)：TTC的氧化態(tài)是無色的，可被氫還原成紅色不溶性的TTF?；畹姆N子有呼吸作用，而呼吸作用中脫氫酶的活動可使無色的TTC還原成紅色的TTF。應(yīng)用TTC的水溶液浸泡活的種子，可使種胚顯紅色。種子生命力越強(qiáng)，代謝活動越旺盛，種胚被染成紅色的程度越深；而種胚生命力衰退或部分喪失生活力則染色較淺或只有部分被染色。因此，可以根據(jù)TTC快速測定種子的生命力。注意事項：①TTC溶液濃度一般為%，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，貯藏要保存在棕色瓶中，陰涼黑暗處；若溶液變色則不可再用；②染色溫度一般為25-35℃；③有生活力的種子應(yīng)具有的特征：種胚完整，發(fā)育良好，能整個染成鮮紅色，允許子葉有小部分的壞死，但不能在胚中軸和子葉連接處，胚根尖也可以有小部分的壞死，但其它的部位完好；④無生活力的種子應(yīng)具有的特征：種胚全部或大部分不染色，胚根不染色的部位不僅在根尖，子葉不染色或喪失機(jī)能的組織超過1/2，子葉與胚中軸的連接處或在胚根上有壞死的部分；胚根受傷以及發(fā)育不良、未成熟的種子；⑤測定不同作物種子的生活力，要選擇適當(dāng)?shù)娜旧噭⒃噭舛?、染色時間等22、層析法按照層析過程的機(jī)理分哪幾類各有何特點①吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異達(dá)到分離鑒定目的；②分配層析：利用不同組分在流動相合固定相之間的分配系數(shù)（或溶解度）不同而使之分離；③離子交換層析：利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被分離的各種離子間的親和力不同，經(jīng)過交換平衡達(dá)到分離目的；④凝膠層析：某些凝膠對于分子大小不同的組分，阻滯作用有所差異，從而進(jìn)行分離；⑤親和層析：利用生物分子的生物學(xué)特性不同來分離蛋白質(zhì)；⑥疏水相互作用層析：利用不同蛋白疏水區(qū)的不同性質(zhì)分離蛋白；⑦共價層析：利用親和支持物和靶分子之間形成的牢固但