雙向電泳原理與流程課件

雙向電泳技術(shù)雙向電泳技術(shù)Proteomics“...theanalysisofcompletecomplementofproteins.

Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction."StanleyFields,UniversityofWashington,Seattle,inScience[291,1221(2001)]Proteomics“...theanalysisofProteomics一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome)僅僅從基因組學(xué)水平上無(wú)法徹底的了解各種生命現(xiàn)象,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)才是生命活動(dòng)的真正執(zhí)行者

從基因組學(xué)上我們無(wú)法檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯調(diào)節(jié)、選擇性剪切、以及蛋白復(fù)合物形成、蛋白質(zhì)相互作用等生命現(xiàn)象;此外并不是細(xì)胞內(nèi)的所有的DNA都翻譯轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)Proteomics一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有ProteomeAnalysisandProteomics"TheanalysisoftheentirePROTEincomplementexpressedbyagenOME,orbyacellortissuetype."WasingerVCetal,Electrophoresis16(1995)“Proteomicsisthestudyofquantitativechangesofexpressionlevelsandtheirapplicationtodrugdiscovery,diagnosticsandtherapy.”Twobasictechnologies:2-DelectrophoresisofcomplexproteinmixturesIdentificationandstructureanalysisofproteinswithmassspectrometrymethodsProteomeAnalysisandProteomWhy2DE?Only“Proteomics”isthelarge-scalescreeningoftheproteinsofacell,organismorbiologicalfluid,aprocesswhichrequiresstringentlycontrolledstepsofsamplepreparation,2-Delectrophoresis,imagedetectionandanalysis,spotidentification,anddatabasesearches.Thecoretechnologyofproteomicsis2-DE.Atpresent,thereisnoothertechniquethatiscapableofsimultaneouslyresolvingthousandsofproteinsinoneseparationprocedure.Why2DE?Only“Proteomics”理論

pIandMr

圖

酵母細(xì)胞表達(dá)6,216種蛋白pI(理論值)Mr[kDa]2DE工作范圍注:圖片中沒(méi)有特別強(qiáng)調(diào)蛋白豐度和疏水性至今1,484個(gè)蛋白被鑒定

(Nat.Biotechnol.17,676and19,242)From:Wildgruberetal.Electrophoresis21(2000)2610-2616.理論pIandMr圖

酵母細(xì)胞表達(dá)6,216種蛋白2D電泳優(yōu)越性對(duì)未處理樣本耐受性好不需要預(yù)純化(如：色譜層析)分辨率非常高2D可以有效的組分收集器蛋白在凝膠介質(zhì)中受到保護(hù)在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中應(yīng)用范圍最廣（front-end）與其他技術(shù)相比，在一次試驗(yàn)中可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)更多

與后續(xù)分析技術(shù)兼容性好(如.MDLC)2D電泳優(yōu)越性對(duì)未處理樣本耐受性好蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用舉例研究細(xì)胞結(jié)果功能和分子組成發(fā)現(xiàn)新的藥物靶位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)新型生物學(xué)活性的分子和藥物差異蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、病毒感染和疾病監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)志物修飾蛋白質(zhì)組學(xué)遺傳或藥理學(xué)擾動(dòng)的分子解剖病理生理學(xué)研究中藥機(jī)理相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)研究藥物作用方式和毒性機(jī)理植物抗蟲(chóng)抗旱抗逆遺傳育種和分子育種資源環(huán)境海洋生物蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用舉例研究細(xì)胞結(jié)果功能和分子組成發(fā)現(xiàn)新的尋找差異蛋白質(zhì)環(huán)孢素A處理前環(huán)孢素A處理后正常組織腫瘤組織細(xì)胞組織尋找差異蛋白質(zhì)環(huán)孢素A處理前環(huán)孢素A處理后正常組織腫瘤組織LifeSciences的歷史LKB ——電泳發(fā)明者Pharmacia——層析技術(shù)開(kāi)創(chuàng)者AmershamBiosciences——提供基因組、蛋白組學(xué)研究整體解決方案GEHealthcareLifeSciences——實(shí)現(xiàn)從發(fā)現(xiàn)到功能研究，從體外到體內(nèi)的突破 LifeSciences的歷史LKB GEHealthcaremilestonesin2-DelectrophoresisLKBintroducedAmpholine?,thefirstcommercialcarrierampholyteThefirstmultipleseparationsystem,ISO-DALT,wasdevelopedPharmaciaFineChemicalsintroducedPharmalyte?LKBintroducedImmobiline?PharmaciaBiotechintroducedImmobilineDryStripPharmaciaBiotechintroducedImageMaster?suitePharmaciaBiotechintroducedIPGphor?PharmaciaBiotechlaunchedDALTIIsystemAmershamPharmaciaBiotechlaunchedTyphoon?AmershamBioscienceslaunchedEttan?DIGE

TheMultiphor?flatbedelectrophoresisunitislaunched.Inproductionfor30yearsin2003!19671978197919821991199319982000200020021973GEHealthcaremilestonesin2-雙向電泳原理與流程課件ImageanalysisImageacquisitionAutomatedspotpickingSpotdigestionMALDItargetspottingLWSLaboratoryworkflowsystemMALDI-ToFProteinSeparationProteomics2DEWorkflowSamplePrepSamplelabelingImageanalysisImageacquisitio

小鼠肝臟蛋白提取物2D凝膠電泳2-DelectrophoresisgelfromProf.Dr.A.G?rg,TechnicalUniversityMunich,Germany小鼠肝臟蛋白提取物2D凝膠電泳2-Delectropho2D/MS經(jīng)典工作流程細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量差異分析雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光蛋白標(biāo)記樣品制備分離染色圖譜分析挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞2D/MS經(jīng)典工作流程細(xì)胞裂解差異分析雙向電泳圖像獲取銀染樣品制備細(xì)胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除

核酸

脂類

鹽，緩沖液，離子性小分子

不溶性物質(zhì)樣品制備細(xì)胞破碎2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光蛋白標(biāo)記染色圖譜分析挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞Separation雙向電泳第一向第二向細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取銀染蛋白標(biāo)記染色圖Principleof2-DElectrophoresis1.Firstdimension:

denaturingisoelectricfocusing

separationaccordingtothe

isoelectricpoint2.Seconddimension:

SDSelectrophoresis

separationaccordingtothe

molecularweight

2-Delectrophoresisresolvesafewthousandproteinspots.Principleof2-DElectrophores等電聚焦電泳原理蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。等電聚焦電泳原理蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷

等電聚焦（IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場(chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測(cè)出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。等電聚焦電泳原理等電聚焦（IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電雙向電泳：傳統(tǒng)方法sample膠在SDS緩沖液中平衡PrincipleaccordingtoP.H.O’FarrellandJ.Klose(1975)pH10pH10pH3pH3垂直膠管中進(jìn)行等電聚焦urea,NP-40一向:二向:SDS丙烯酰胺凝膠電泳非連續(xù)梯度膠按等電點(diǎn)分離（電荷）按分子量分離（質(zhì)量）雙向電泳：傳統(tǒng)方法sample膠在SDS緩Principl使用載體兩性電解質(zhì)IEF時(shí)存在的問(wèn)題不同批次載體兩性電解質(zhì)的重現(xiàn)性載體兩性電解質(zhì)梯度不穩(wěn)定蛋白載量有限重現(xiàn)性差導(dǎo)致梯度漂移梯度漂移導(dǎo)致酸性和堿性蛋白質(zhì)丟失管膠柔軟，尺寸不定操作者個(gè)人技術(shù)影響結(jié)果使用載體兩性電解質(zhì)IEF時(shí)存在的問(wèn)題不同批次載體兩性電解質(zhì)的固相凝膠(支持膜上0.5mm厚凝膠)丙烯酰胺緩沖液:Immobiline?

CH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基固相pH梯度(IPG)固相凝膠丙烯酰胺緩沖液:Immobiline?固相pHImmobiline?干膠條的特性可重復(fù)性無(wú)梯度漂移,真正的平衡方法可分離酸性和堿性蛋白

容納蛋白樣本量更多水平和垂直SDS凝膠中都能使用允許樣本水化上樣機(jī)械強(qiáng)度和尺寸穩(wěn)定易操作易于對(duì)樣本跟蹤標(biāo)記Immobiline?干膠條的特性可重復(fù)性新pH范圍的Immobiline干膠條高分辨率的IPG膠條，聯(lián)合使用DeStreak試劑,能改善極堿性區(qū)域蛋白點(diǎn)結(jié)果 。歸功于獨(dú)特的試劑。 使用pH范圍相互重疊的干膠條，可提高2-D圖譜分析效率!新pH范圍:

Immobiline?DryStrippH3–5.6NLImmobilineDryStrippH5.3–6.5ImmobilineDryStrippH6.2–7.5ImmobilineDryStrippH7–11NLImmobilineDryStrippH3–11NL新pH范圍的Immobiline干膠條高分辨率的IPG不同pH范圍膠條不同長(zhǎng)度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1個(gè)pH范圍pH7-11NL堿性膠條不同pH范圍膠條不同長(zhǎng)度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1寬pH、窄pH范圍膠條寬pH梯度膠條應(yīng)用:

整個(gè)蛋白圖譜窄

pH梯度膠條應(yīng)用:

提高分辨率

增加樣品上樣量

檢測(cè)分析更多蛋白pH345678910456789寬pH、窄pH范圍膠條寬pH梯度膠條應(yīng)用:pH345提高分辨率:斑點(diǎn)顯現(xiàn)IPG4-7IPG5-6IPG4-7IPG5.5-6.7MouseliverproteinsFromA.G?rgetal.(1999)提高分辨率:斑點(diǎn)顯現(xiàn)IPG4-7IPG5-6IPG4不同長(zhǎng)度的膠條7cm11cm13cm18cm24cm不同長(zhǎng)度的膠條7cm11cm線形與非線形膠條formostsamples

Celllysates Tissueextracts linear(L)nonlinear(NL)forsampleswithabundantproteinsintherangebetweenpH5and7Serumproteins線形與非線形膠條formostsamples linpH3-10LandNLfromProf.AngelikaG?rg,TechnicalUniversityMunichTissueProteinsfromMouseLiverlinear(L)nonlinear(NL)pH3-10LandNLfromProf.AngTheIPGphor?PlatformTheIPGphor?PlatformIPG膠條水化IPG膠條水化IPGstriprehydration如果水化時(shí)加入樣品，此體積是加入樣品后的終體積IPGstriprehydration如果水化時(shí)加入樣品加樣品到膠條槽加樣品到膠條槽泡漲盤VS聚焦盤泡漲盤VS聚焦盤干膠條的水化主動(dòng)水化：膠條槽內(nèi)進(jìn)行，大分子蛋白更容易進(jìn)入膠條；30－120V，10－24Hrs被動(dòng)水化：專用水化盒中進(jìn)行NEW！無(wú)需覆蓋油！避免灰塵污染，空氣作用不透明蓋子，適用于CyDyeDIGE標(biāo)記同時(shí)適用于市場(chǎng)上所有7－24cm干膠條的水化干膠條的水化主動(dòng)水化：膠條槽內(nèi)進(jìn)行，大分子蛋白更容易進(jìn)入膠條在樣品杯中加入少量不含樣品的水化液檢查是否漏液。上樣前吸走水化液。上樣前將樣品離心去掉不溶物，每個(gè)樣品杯最多可加樣150μl。蓋上膠條槽的蓋子，再蓋IPGphor儀器的蓋子。分別將兩個(gè)IEF電極片放在IPG膠條膠的兩端，分別將電極壓在兩個(gè)電極片的外緣。樣品杯可放在兩個(gè)電極間除膠條槽內(nèi)側(cè)凸起外任何位置，對(duì)于堿性分離范圍的IPG膠條，盡量將樣品杯靠近陽(yáng)極放置.杯上樣&紙橋上樣在樣品杯中加入少量不含樣品的水化液檢查是否漏液。上樣前吸走水IEF電泳IPGphor包括半導(dǎo)體溫控系統(tǒng)(20°C)和程序化電源(10000V)可同時(shí)進(jìn)行12根膠條的等電聚焦聚焦效果以“Vh”數(shù)控制，可提高重復(fù)性IEF電泳IPGphor包括半導(dǎo)體溫控系統(tǒng)(20°C)和程IPG膠條的平衡——兩步平衡SDS電泳前,平衡母液: 2%SDS,50mMTris-HClpH8.8,

6Murea,30%glycerol+

蛋白與SDS結(jié)合甘油和尿素降低電內(nèi)滲作用第一步DTT平衡：(1x15min)1%DTT

第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的DTT，防止拖尾(1x15min)2.5%iodoacetamideIPG膠條的平衡——兩步平衡SDS電泳前,平衡母液:第二向垂直電泳系統(tǒng)

瓊脂糖覆蓋密封

放置IPGstrip低熔點(diǎn)瓊脂糖第二向垂直電泳系統(tǒng)瓊脂糖覆蓋密封放置低熔點(diǎn)瓊脂糖PushtheIPGStripDownontotheGelSurfacePushtheIPGStripDownontotSealtheCassetteandFixtheIPGStripwithAgaroseSealtheCassetteandFixtheInsertingtheCassetteInsertingtheCassetteSDS參數(shù)SDS參數(shù)SE600rubySE600rubyEttanDALTsixEttanDALTsixEttanDALTtwelvesystemEttanDALTtwelvesystem第二向系統(tǒng)

strip gel number running length(cm) size(cm) ofgels time(hr)EttanDalt12 18,24 25x20 12 4.5EttanDalt6

18,24 25x20 6 4.5SE600 2x7,13 14x16(24) 4 4MiniVE 7 8x7,8x10 2 1.5MultiphorII 7,11 24x11* 1 1.5 18 24x18 1 3.3PhastSystem (4)** 4x4 2 0.5

*2or3stripsside-by-side **cutorhome-madestrip第二向系統(tǒng) strip gel number runn2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析蛋白標(biāo)記圖譜分析挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞分離細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向銀染

考染熒光染色2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取蛋白標(biāo)記圖譜分析挖點(diǎn)ProteinDetectionMethods

ProteinDetectionMethodsCoomassie?Blue-考馬斯亮藍(lán)染色+靈敏度，低至0.01mg(“膠體”考染)+非特異性染色+染料與蛋白成比例結(jié)合+線性化好擴(kuò)散速度受限，膠的厚度影響跑膠速度純度不夠有限的動(dòng)力學(xué)范圍Coomassie?Blue-考馬斯亮藍(lán)染色+靈敏度，膠體考馬斯亮藍(lán)染色1mgE.colistrainBIPGphor

24cmpH4-7ColloidalCBB

G250staining膠體考馬斯亮藍(lán)染色1mgE.colistr銀染+靈敏度，低至0.2ng+在凝膠基質(zhì)中與蛋白交聯(lián)+自動(dòng)催化反應(yīng)染凝膠表面蛋白

線性化程度比考染低一些大分子物質(zhì)也被染色

步驟多，某些步驟時(shí)間控制嚴(yán)格銀染+靈敏度，低至0.2ngSilverstainedgelofE.coliLysate

IPG4-7SilverstainedwithPlusOne?KitwithoutglutaraldehydeandformaldehydeintheAgsol.SilverstainedgelofE.coli2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析蛋白標(biāo)記挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞分離細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光染色圖譜分析2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析蛋白標(biāo)記挖點(diǎn)蛋白鑒定體液植物ImageScannerIII圖像掃描系統(tǒng)灰度校正功能平臺(tái)具有防水功能，可直接掃描SDS濕膠。3.7OD高動(dòng)態(tài)范圍，保證高、低豐度蛋白的準(zhǔn)確定量。掃描平臺(tái)大，A3掃描面積，一次可掃描2塊24cm凝膠。Gray256scaleTransmissive300dpiImageScannerIII圖像掃描系統(tǒng)灰度校正功能Gr由SIB,GeneBio和GEHealthcare合作開(kāi)發(fā)，為SwissProt推薦分析軟件。高效能參數(shù)自動(dòng)找點(diǎn)，全自動(dòng)蛋白定量計(jì)算方法，不受背景影響。在原始數(shù)據(jù)上進(jìn)行分析，結(jié)果可靠。界面窗口可隨意設(shè)計(jì)，界面極其友好。全自動(dòng)凝膠匹配，采用先進(jìn)的算法。根據(jù)點(diǎn)的相關(guān)因素、形狀、位置、周圍情況， 膠間匹配效率高。多種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析工具，快速找到膠間蛋白表達(dá)差異?？芍苯渔溄拥紼xPASy?和SwissProt?數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行網(wǎng)上檢索。全部操作過(guò)程都可以撤銷/重作操作，每一步驟都附有說(shuō)明，使用方便。全面支持DIGE技術(shù)，源自DeCyder2D軟件。ImageMaster2D雙向電泳分析軟件ImageMaster2D雙向電泳分析軟件ImageMasterPlatinum7.0軟件分析流程

ImageMasterPlatinum7.0軟件分析流2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析蛋白標(biāo)記蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞分離細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光染色挖膠圖譜分析2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析蛋白標(biāo)記蛋白鑒定體液植物微生雙向電泳原理與流程課件自動(dòng)斑點(diǎn)切取——Spotpicker切點(diǎn)針頭膠盤自動(dòng)斑點(diǎn)切取——Spotpicker切點(diǎn)針頭膠盤MALDI-ToF質(zhì)譜分析標(biāo)記熒光全自動(dòng)軟件分析自動(dòng)切點(diǎn)圖像采集雙向電泳分離自動(dòng)酶解蛋白質(zhì)組學(xué)完整平臺(tái)樣品制備蛋白純化蛋白質(zhì)組學(xué)完整平臺(tái)MALDI-ToF標(biāo)記熒光全自動(dòng)自動(dòng)切點(diǎn)圖像采集雙向電泳分離經(jīng)典2D工作流:產(chǎn)品范圍Grindingkit2-DClean-UpkitMinidialysiskits2-DQuantkit2-DFractionationkitAlbumin&IgGremovalkitEttanIPGphor?Immobiline?DryStripEttan?DALTtwelveEttanDALTsixDALTgel12.5ImageMaster?DeCyder?2D蛋白標(biāo)記樣品制備分離染色圖譜分析挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶體液植物微生物組織細(xì)胞EttanSpotPickerEttanDigesterEttanSpotterEttanSpot

HandlingWorkstationDeepPurple?TotalProteinStainPlusOne?SilverStainingKit,proteinCyDye?DIGEFluors經(jīng)典2D工作流:產(chǎn)品范圍GrindingkitEtThankyou!AnyQuestions….Thankyou!AnyQuestions….

雙向電泳技術(shù)雙向電泳技術(shù)Proteomics“...theanalysisofcompletecomplementofproteins.

Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction."StanleyFields,UniversityofWashington,Seattle,inScience[291,1221(2001)]Proteomics“...theanalysisofProteomics一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome)僅僅從基因組學(xué)水平上無(wú)法徹底的了解各種生命現(xiàn)象,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)才是生命活動(dòng)的真正執(zhí)行者

從基因組學(xué)上我們無(wú)法檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯調(diào)節(jié)、選擇性剪切、以及蛋白復(fù)合物形成、蛋白質(zhì)相互作用等生命現(xiàn)象;此外并不是細(xì)胞內(nèi)的所有的DNA都翻譯轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)Proteomics一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有ProteomeAnalysisandProteomics"TheanalysisoftheentirePROTEincomplementexpressedbyagenOME,orbyacellortissuetype."WasingerVCetal,Electrophoresis16(1995)“Proteomicsisthestudyofquantitativechangesofexpressionlevelsandtheirapplicationtodrugdiscovery,diagnosticsandtherapy.”Twobasictechnologies:2-DelectrophoresisofcomplexproteinmixturesIdentificationandstructureanalysisofproteinswithmassspectrometrymethodsProteomeAnalysisandProteomWhy2DE?Only“Proteomics”isthelarge-scalescreeningoftheproteinsofacell,organismorbiologicalfluid,aprocesswhichrequiresstringentlycontrolledstepsofsamplepreparation,2-Delectrophoresis,imagedetectionandanalysis,spotidentification,anddatabasesearches.Thecoretechnologyofproteomicsis2-DE.Atpresent,thereisnoothertechniquethatiscapableofsimultaneouslyresolvingthousandsofproteinsinoneseparationprocedure.Why2DE?Only“Proteomics”理論

pIandMr

圖

酵母細(xì)胞表達(dá)6,216種蛋白pI(理論值)Mr[kDa]2DE工作范圍注:圖片中沒(méi)有特別強(qiáng)調(diào)蛋白豐度和疏水性至今1,484個(gè)蛋白被鑒定

(Nat.Biotechnol.17,676and19,242)From:Wildgruberetal.Electrophoresis21(2000)2610-2616.理論pIandMr圖

酵母細(xì)胞表達(dá)6,216種蛋白2D電泳優(yōu)越性對(duì)未處理樣本耐受性好不需要預(yù)純化(如：色譜層析)分辨率非常高2D可以有效的組分收集器蛋白在凝膠介質(zhì)中受到保護(hù)在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中應(yīng)用范圍最廣（front-end）與其他技術(shù)相比，在一次試驗(yàn)中可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)更多

與后續(xù)分析技術(shù)兼容性好(如.MDLC)2D電泳優(yōu)越性對(duì)未處理樣本耐受性好蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用舉例研究細(xì)胞結(jié)果功能和分子組成發(fā)現(xiàn)新的藥物靶位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)新型生物學(xué)活性的分子和藥物差異蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、病毒感染和疾病監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)志物修飾蛋白質(zhì)組學(xué)遺傳或藥理學(xué)擾動(dòng)的分子解剖病理生理學(xué)研究中藥機(jī)理相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)研究藥物作用方式和毒性機(jī)理植物抗蟲(chóng)抗旱抗逆遺傳育種和分子育種資源環(huán)境海洋生物蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用舉例研究細(xì)胞結(jié)果功能和分子組成發(fā)現(xiàn)新的尋找差異蛋白質(zhì)環(huán)孢素A處理前環(huán)孢素A處理后正常組織腫瘤組織細(xì)胞組織尋找差異蛋白質(zhì)環(huán)孢素A處理前環(huán)孢素A處理后正常組織腫瘤組織LifeSciences的歷史LKB ——電泳發(fā)明者Pharmacia——層析技術(shù)開(kāi)創(chuàng)者AmershamBiosciences——提供基因組、蛋白組學(xué)研究整體解決方案GEHealthcareLifeSciences——實(shí)現(xiàn)從發(fā)現(xiàn)到功能研究，從體外到體內(nèi)的突破 LifeSciences的歷史LKB GEHealthcaremilestonesin2-DelectrophoresisLKBintroducedAmpholine?,thefirstcommercialcarrierampholyteThefirstmultipleseparationsystem,ISO-DALT,wasdevelopedPharmaciaFineChemicalsintroducedPharmalyte?LKBintroducedImmobiline?PharmaciaBiotechintroducedImmobilineDryStripPharmaciaBiotechintroducedImageMaster?suitePharmaciaBiotechintroducedIPGphor?PharmaciaBiotechlaunchedDALTIIsystemAmershamPharmaciaBiotechlaunchedTyphoon?AmershamBioscienceslaunchedEttan?DIGE

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小鼠肝臟蛋白提取物2D凝膠電泳2-DelectrophoresisgelfromProf.Dr.A.G?rg,TechnicalUniversityMunich,Germany小鼠肝臟蛋白提取物2D凝膠電泳2-Delectropho2D/MS經(jīng)典工作流程細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量差異分析雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光蛋白標(biāo)記樣品制備分離染色圖譜分析挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞2D/MS經(jīng)典工作流程細(xì)胞裂解差異分析雙向電泳圖像獲取銀染樣品制備細(xì)胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除

核酸

脂類

鹽，緩沖液，離子性小分子

不溶性物質(zhì)樣品制備細(xì)胞破碎2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光蛋白標(biāo)記染色圖譜分析挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞Separation雙向電泳第一向第二向細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取銀染蛋白標(biāo)記染色圖Principleof2-DElectrophoresis1.Firstdimension:

denaturingisoelectricfocusing

separationaccordingtothe

isoelectricpoint2.Seconddimension:

SDSelectrophoresis

separationaccordingtothe

molecularweight

2-Delectrophoresisresolvesafewthousandproteinspots.Principleof2-DElectrophores等電聚焦電泳原理蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。等電聚焦電泳原理蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷

等電聚焦（IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場(chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測(cè)出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。等電聚焦電泳原理等電聚焦（IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電雙向電泳：傳統(tǒng)方法sample膠在SDS緩沖液中平衡PrincipleaccordingtoP.H.O’FarrellandJ.Klose(1975)pH10pH10pH3pH3垂直膠管中進(jìn)行等電聚焦urea,NP-40一向:二向:SDS丙烯酰胺凝膠電泳非連續(xù)梯度膠按等電點(diǎn)分離（電荷）按分子量分離（質(zhì)量）雙向電泳：傳統(tǒng)方法sample膠在SDS緩Principl使用載體兩性電解質(zhì)IEF時(shí)存在的問(wèn)題不同批次載體兩性電解質(zhì)的重現(xiàn)性載體兩性電解質(zhì)梯度不穩(wěn)定蛋白載量有限重現(xiàn)性差導(dǎo)致梯度漂移梯度漂移導(dǎo)致酸性和堿性蛋白質(zhì)丟失管膠柔軟，尺寸不定操作者個(gè)人技術(shù)影響結(jié)果使用載體兩性電解質(zhì)IEF時(shí)存在的問(wèn)題不同批次載體兩性電解質(zhì)的固相凝膠(支持膜上0.5mm厚凝膠)丙烯酰胺緩沖液:Immobiline?

CH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基固相pH梯度(IPG)固相凝膠丙烯酰胺緩沖液:Immobiline?固相pHImmobiline?干膠條的特性可重復(fù)性無(wú)梯度漂移,真正的平衡方法可分離酸性和堿性蛋白

容納蛋白樣本量更多水平和垂直SDS凝膠中都能使用允許樣本水化上樣機(jī)械強(qiáng)度和尺寸穩(wěn)定易操作易于對(duì)樣本跟蹤標(biāo)記Immobiline?干膠條的特性可重復(fù)性新pH范圍的Immobiline干膠條高分辨率的IPG膠條，聯(lián)合使用DeStreak試劑,能改善極堿性區(qū)域蛋白點(diǎn)結(jié)果 。歸功于獨(dú)特的試劑。 使用pH范圍相互重疊的干膠條，可提高2-D圖譜分析效率!新pH范圍:

Immobiline?DryStrippH3–5.6NLImmobilineDryStrippH5.3–6.5ImmobilineDryStrippH6.2–7.5ImmobilineDryStrippH7–11NLImmobilineDryStrippH3–11NL新pH范圍的Immobiline干膠條高分辨率的IPG不同pH范圍膠條不同長(zhǎng)度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1個(gè)pH范圍pH7-11NL堿性膠條不同pH范圍膠條不同長(zhǎng)度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1寬pH、窄pH范圍膠條寬pH梯度膠條應(yīng)用:

整個(gè)蛋白圖譜窄

pH梯度膠條應(yīng)用:

提高分辨率

增加樣品上樣量

檢測(cè)分析更多蛋白pH345678910456789寬pH、窄pH范圍膠條寬pH梯度膠條應(yīng)用:pH345提高分辨率:斑點(diǎn)顯現(xiàn)IPG4-7IPG5-6IPG4-7IPG5.5-6.7MouseliverproteinsFromA.G?rgetal.(1999)提高分辨率:斑點(diǎn)顯現(xiàn)IPG4-7IPG5-6IPG4不同長(zhǎng)度的膠條7cm11cm13cm18cm24cm不同長(zhǎng)度的膠條7cm11cm線形與非線形膠條formostsamples

Celllysates Tissueextracts linear(L)nonlinear(NL)forsampleswithabundantproteinsintherangebetweenpH5and7Serumproteins線形與非線形膠條formostsamples linpH3-10LandNLfromProf.AngelikaG?rg,TechnicalUniversityMunichTissueProteinsfromMouseLiverlinear(L)nonlinear(NL)pH3-10LandNLfromProf.AngTheIPGphor?PlatformTheIPGphor?PlatformIPG膠條水化IPG膠條水化IPGstriprehydration如果水化時(shí)加入樣品，此體積是加入樣品后的終體積IPGstriprehydration如果水化時(shí)加入樣品加樣品到膠條槽加樣品到膠條槽泡漲盤VS聚焦盤泡漲盤VS聚焦盤干膠條的水化主動(dòng)水化：膠條槽內(nèi)進(jìn)行，大分子蛋白更容易進(jìn)入膠條；30－120V，10－24Hrs被動(dòng)水化：專用水化盒中進(jìn)行NEW！無(wú)需覆蓋油！避免灰塵污染，空氣作用不透明蓋子，適用于CyDyeDIGE標(biāo)記同時(shí)適用于市場(chǎng)上所有7－24cm干膠條的水化干膠條的水化主動(dòng)水化：膠條槽內(nèi)進(jìn)行，大分子蛋白更容易進(jìn)入膠條在樣品杯中加入少量不含樣品的水化液檢查是否漏液。上樣前吸走水化液。上樣前將樣品離心去掉不溶物，每個(gè)樣品杯最多可加樣150μl。蓋上膠條槽的蓋子，再蓋IPGphor儀器的蓋子。分別將兩個(gè)IEF電極片放在IPG膠條膠的兩端，分別將電極壓在兩個(gè)電極片的外緣。樣品杯可放在兩個(gè)電極間除膠條槽內(nèi)側(cè)凸起外任何位置，對(duì)于堿性分離范圍的IPG膠條，盡量將樣品杯靠近陽(yáng)極放置.杯上樣&紙橋上樣在樣品杯中加入少量不含樣品的水化液檢查是否漏液。上樣前吸走水IEF電泳IPGphor包括半導(dǎo)體溫控系統(tǒng)(20°C)和程序化電源(10000V)可同時(shí)進(jìn)行12根膠條的等電聚焦聚焦效果以“Vh”數(shù)控制，可提高重復(fù)性IEF電泳IPGphor包括半導(dǎo)體溫控系統(tǒng)(20°C)和程IPG膠條的平衡——兩步平衡SDS電泳前,平衡母液: 2%SDS,50mMTris-HClpH8.8,

6Murea,30%glycerol+

蛋白與SDS結(jié)合甘油和尿素降低電內(nèi)滲作用第一步DTT平衡：(1x15min)1%DTT

第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的DTT，防止拖尾(1x15min)2.5%iodoacetamideIPG膠條的平衡——兩步平衡SDS電泳前,平衡母液:第二向垂直電泳系統(tǒng)

瓊脂糖覆蓋密封

放置IPGstrip低熔點(diǎn)瓊脂糖第二向垂直電泳系統(tǒng)瓊脂糖覆蓋密封放置低熔點(diǎn)瓊脂糖PushtheIPGStripDownontotheGelSurfacePushtheIPGStripDownontotSealtheCassetteandFixtheIPGStripwithAgaroseSealtheCassetteandFixtheInsertingtheCassetteInsertingtheCassetteSDS參數(shù)SDS參數(shù)SE600rubySE600rubyEttanDALTsixEttanDALTsixEttanDALTtwelvesystemEttanDALTtwelvesystem第二向系統(tǒng)

strip gel number running length(cm) size(cm) ofgels time(hr)EttanDalt12 18,24 25x20 12 4.5EttanDalt6

18,24 25x20 6 4.5SE600 2x7,13 14x16(24) 4 4MiniVE 7 8x7,8x10 2 1.5MultiphorII 7,11 24x11* 1 1.5 18 24x18 1 3.3PhastSystem (4)** 4x4 2 0.5

*2or3stripsside-by-side **cutorhome-madestrip第二向系統(tǒng) strip gel number runn2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析蛋白標(biāo)記圖譜分析挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞分離細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向銀染

考染熒光染色2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取蛋白標(biāo)記圖譜分析挖點(diǎn)ProteinDetectionMethods

ProteinDetectionMethodsCoomassie?Blue-考馬斯亮藍(lán)染色+靈敏度，低至0.01mg(“膠體”考染