TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書

TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（通用）（BIOTIN標記POD法，適用于細胞、組織樣本）一TUNEL檢測原理凱基TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測細胞在凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素（biotin）標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂的DNA的3-OH末端，并可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結(jié)合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的存在下，產(chǎn)生很強的顏色反應（呈深棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在普通顯微鏡下即可觀察和計數(shù)凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）的凋亡原位檢測。二TUNEL試劑盒組分組份20assays50assays100assays儲存條件EquilibrationBuffer1.0mL2.5mL5.0mL-20°CBiotin-11-dUTP20pL50pL100pL-20°CTdTEnzyme80pL200pL400pL-20C50XProteinaseK40pL100pL200pL-20CStreptavidin-HRP10pL25pL50pL4°C避光DAB2mg5mg10mg-20C注意事項1使用前請認真閱讀本說明書，提前準備好相關試劑。2因本試劑盒中組分均為微量，使用前請離心集液。3為避免試驗誤差、降低試劑的損耗，建議使用精密度高的進口微量移液槍及槍頭。4TdT酶反應液最好在使用前根椐樣本數(shù)量集中配制，再分別滴加于各樣本片上，避免每個樣本單獨配制而產(chǎn)生的試劑損耗。5另因DAB為固體粉末，使用前加入適量PBS溶解，配制成20XDAB（10mg/ml）后，按下述方法顯色使用。

6用戶自備：二甲苯、多聚甲醛、PBS、H202、TritonX-100、檸檬酸鈉、復染染液：蘇木素或甲基綠等、蓋玻片、載玻片、染色缸。三操作流程概覽?高靈敏度：可以單一檢出初期的凋亡細胞。高特異性：能特異性染色凋亡細胞。快速操作：整體操作約需3小時。用途廣泛：可應用于組織切片、細胞樣本等。方便觀察：使用光學顯微鏡觀察實驗結(jié)果。高正確性：有陽性對照片的制備方法，可以確認試劑盒的有效性四檢測樣本的預處理

TUNEL檢測時樣本的預處理是試驗的關鍵所在，本說明書推薦的條件僅為普遍情況，用戶需根椐自已的樣本材料及首次試驗結(jié)果來調(diào)整各個條件（參照Page9），如處理時間、處理濃度等，來優(yōu)化出適合自身樣本的試驗條件，從而做出客觀的試驗結(jié)果。1細胞樣本的準備.為防止樣本脫落，請使用硅烷（Silane）處理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片。固定好的樣本可以在-20匸的70%乙醇中放置30分鐘?一晚，以改善細胞的滲透性。使用PBS清洗細胞樣本時，不要直接加在細胞樣本上，以防止細胞樣本的脫落。進行PBS清洗時，以5分鐘清洗3次為標準。固定液、PBS、封閉液、通透液、染色缸需用戶自備，請按上述方法配制。2石蠟組織切片的預處理*注意事項：蛋白酶K處理的使用濃度、處理時間及溫度，都因組織的類型不同而有所不同，需要自已摸索優(yōu)化上述條件，如有問題，請根椐本說明書Page9的《常見問題的原因及推薦解決方案》來調(diào)整條件。例如：如果凋亡細胞染色較弱時，可用高濃度的ProteinaseK（400“g/ml）處理5分鐘。（本試劑盒的50XProteinaseK濃度為lmg/ml）。其它替代方法：石蠟切片的預處理也可根椐實際情況可采用下述三種替代方法之一，即蛋白酶K處理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：替代方法丄「將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10min（通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配制）替代方法2：將脫蠟及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HClPH2,胰蛋白酶0.25%-0.5%溶于0.01NHCl）替代方法3:將脫蠟及水合好的切片浸入含200ml0.1M的檸檬酸緩沖液PH6的塑料盒中，置于微波爐中350W（低檔）處理5min。3冰凍切片的預處理4其它難于處理的組織切片的預處理5陽性對照及陰性對照的準備TUNEL檢測同時需要設陽性和陰性對照，以顯示試驗的客觀性及準確性。因此需要按下述方法準備兩個樣本來制備陽性及陰性片，其后續(xù)步聚與待測樣本同樣進行。A：陽性對照樣本的準備組織樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后，細胞樣本在TritonX-100通透液處理、PBS浸洗后，再加入100“LDNaseI反應液(10U-3000UDNaseI，40mMTris-HClPH7.9,10mMNaCl,6mMMgCl,10mMCaCl)(用戶自備)室溫一37°C22處理10一30min,其余步驟均相同。女口有問題詳見Page9.B：陰性對照樣本的準備在Page8標記反應制備TdT酶反應液時，不添加TdT酶，其余步驟均相同。五標記和顯色反應：

操作注意事項：進行PBS清洗時，以5分鐘清洗3次為標準。PBS清洗后，為了各種反應的有效進行，請盡量除去PBS溶液后再進行下一步反應在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液干燥造成實驗失敗。TdT酶反應液即用即配，短暫于冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導酶活性的失活。如果20XDAB溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。用甲基綠（MethylGreen）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M醋酸巴比妥PH4.0）染色后，請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學顯微鏡觀察操作。如果此時使用80?90%的乙醇洗凈時，甲基綠比較容易脫色，注意快速進行脫水操作。

六常見問題的原因及推薦解決方案.現(xiàn)象非特異性染色（例如：非凋亡細胞的強染色）現(xiàn)象可能原因非特異性染色Biotin-dUTP現(xiàn)象可能原因非特異性染色Biotin-dUTP的非特異性結(jié)合（例如：非凋亡細胞的強染色）TdT酶的濃度過高內(nèi)源過氧化物酶未被封閉光照紫外線導致包埋試劑的聚合（如建議勿使細胞干涸在TdT酶反應之后，再用含0.1%TritonX-100和1mg/mlBSA的PBS洗三次。用TdTdilutionbuffer*作1：2——1：10稀釋，封閉液室溫（15-25°C）封閉lOmin（封閉液：3%HO22溶于甲醇）甲基丙嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑烯酸會導致樣本DNA的斷裂）在固定組織時樣本DNA已斷裂（內(nèi)源核酸酶的確保樣品取樣后立即固定或通過肝靜脈灌注固定作用）固定后某些核酸酶活性依然較高導致DNA斷裂用含有dUTP和dAPT的溶液封閉染色背景較高福爾馬林固定導致某些含黑色素前體的細胞染嘗試以甲醇固定，但可能會降低檢測的敏感性。成黃色內(nèi)源過氧化物酶未被封閉封閉液室溫（15-25C）封閉lOmin（封閉液：3%HO22溶于甲醇）Biotin-dUTP的非特異性結(jié)合在TdT酶反應之后，再用含0.1%TritonX-100和lmg/mlBSA的PBS洗三次。樣本被支原體污染使用支原體檢測試劑盒檢測，如陽性則制備未被污染的新樣本標記反應試劑（TdT酶及dUTP）的濃度過高稀釋50%，以降胝的標記反應的濃度細胞處于高度增殖期在非高增殖期取樣檢測DAB孵育時間過長減少DAB染色時間標記率低、染色如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標記效率較低用溶于PBSPH7.4中的4%多聚甲醛固定淡至無 （因為在固定時染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而或福爾馬林或戊二醛固定。在操作中丟失）

過度的固定導致與蛋白過度交聯(lián) 縮短固定時間，或用溶于PBSPH7.4的2%多聚甲醛固定促滲條件不佳，以致于試劑不能到達靶分子或l增加通透劑促滲時間濃度過低l增加通透劑的作用溫度（15-25°C）l優(yōu)化蛋白酶K的作用濃度和作用時間（如：以400ug/ml作用5min）l0.1M的檸檬酸鈉70C作用30min。復染信號較弱選擇的染料不合適陽性對照沒有信號用溶于0.1M醋酸巴比妥的r3-5%甲基綠復染信號較弱選擇的染料不合適陽性對照沒有信號蘇木素復染l冷凍切片使用3U/mlR的DNaseIl石蠟切片使用1500U/m