堿性磷酸酶的分離純化鑒定

關(guān)于堿性磷酸酶的分離純化鑒定第1頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五分離純化的一般程序選擇材料破碎細(xì)胞提取分離純化分析及鑒定第2頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中），AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），原理：第3頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五操作一、取材及勻漿取兔肝2g，剪碎，加入6ml0.01mol/L醋酸鎂和醋酸鈉混合液，充分勻漿。

記錄體積（取0.1ml至一新EP管留作A液，測(cè)定時(shí)稀釋25倍）二、提取加入2ml正丁醇，攪拌2min，室溫放置30min。過(guò)濾，留上清。計(jì)體積。第4頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五三、分離純化1、50％丙酮沉淀AKP

加入等體積丙酮，3000rpm×5min，留沉淀，加4ml0.5mol/L醋酸鎂溶解沉淀，記錄體積。（取0.1ml留作B液，稀釋10倍）2、30％乙醇溶解AKP

每ml溶液中加入95％乙醇0.46ml2000rpm×5min，留上清（記錄體積）3、60％乙醇沉淀AKP

每ml溶液中加入95％乙醇0.86ml3000rpm×5min，留沉淀，加3ml0.5mol/L醋酸鎂溶解沉淀，記錄體積。（取0.1ml留作C液，使用時(shí)稀釋5倍）第5頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五4、33％丙酮溶解AKP

每ml溶液中加入0.33ml丙酮

2000rpm×5min，留上清（記錄體積）5、50％丙酮沉淀AKP

每ml溶液中加入0.36ml丙酮

3000rpm×15min，留沉淀，

5mlPh8.8的Tris-醋酸鎂溶解沉淀（D液，不稀釋）第6頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五四、分析及鑒定1、堿性磷酸酶的活性測(cè)定（磷酸苯二鈉法）2、堿性磷酸酶蛋白含量測(cè)定（BCA法）3、比活性及純化倍數(shù)計(jì)算第7頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五分光光度法

（Spectrophotometry）根據(jù)物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光線具有選擇性吸收（即可產(chǎn)生吸收光譜）的特性而建立起來(lái)的一種定量、定性分析的技術(shù)。也稱為吸收光譜法（Absorptionspectrometry）。不需要把欲分析的樣品從混合物中分離開(kāi)來(lái)第8頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五（一）基本原理

光具有波粒二相性。波長(zhǎng)和頻率是光的波動(dòng)性的特征。1、光的基本知識(shí)紫外分光光度計(jì)（200－400nm）可見(jiàn)光分光光度計(jì)（400－760nm）紅外分光光度計(jì)（760－1000nm）第9頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五2、定量分析的理論基礎(chǔ)－－Lambert—Beer定律A＝K·L·C吸光度(Aabsorbance,A)消光度(degreeofextinction,E)光密度(opticaldensity,D)K--吸光系數(shù),是物質(zhì)的特征性常數(shù)。第10頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五對(duì)比法進(jìn)行定量分析A樣

=K·L·C樣A標(biāo)

=K·L·C標(biāo)A樣A標(biāo)K·L·C樣K·L·C標(biāo)C樣C標(biāo)C樣

=A樣·C標(biāo)/A標(biāo)第11頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五單色光、平行光（λmax）溶液均勻、清澈、無(wú)散射溶液性質(zhì)穩(wěn)定，比色皿中無(wú)化學(xué)反應(yīng)適用于稀溶液（A0.2-0.7）Lambert—Beer定律的適用范圍：第12頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五溶劑空白：當(dāng)顯色劑及所用其它試劑在測(cè)定波長(zhǎng)都沒(méi)有吸收峰時(shí)，可用純?nèi)軇?如蒸餾水)作參比溶液。試劑空白：當(dāng)顯色前的樣品在測(cè)定波長(zhǎng)沒(méi)有吸收峰，而顯色劑或其它試劑在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收時(shí)，可用不加入樣品的“試劑空白”作參比溶液，這種方式最為常用。參比溶液的選擇第13頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五基本組件及常見(jiàn)分光光度計(jì)第14頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五分光光度計(jì)的使用1.打開(kāi)電源預(yù)熱15分鐘2.選擇波長(zhǎng)（λmax

）3.光標(biāo)指向Trans4.打開(kāi)光門，調(diào)節(jié)0％；關(guān)上光門調(diào)節(jié)100％5.重復(fù)4一次6.將光標(biāo)指向ABS7.讀數(shù)第15頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五磷酸苯二鈉堿性磷酸酶苯酚

+磷酸鹽堿性苯酚

+4-氨基安替吡啉+鐵氰化鉀紅色醌式化合物AKP活性測(cè)定基本原理－－磷酸苯二鈉法第16頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五單位（ml）空白管標(biāo)準(zhǔn)管ABCD各階段稀釋液酚標(biāo)準(zhǔn)液（0.1mg/ml）Tris-醋酸鎂復(fù)合底物液//0.10.10.10.1/0.1////0.1/////333333酶活性單位（U/ml）=A樣A標(biāo)×0.1×稀釋倍數(shù)37保溫15分鐘各管加入鐵氰化鉀液2ml，靜置15min510nm比色酚標(biāo)準(zhǔn)液濃度稀釋倍數(shù)(PH8.8tris醋酸鎂溶液）//251051第17頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五蛋白含量測(cè)定基本原理－－BCA法蛋白質(zhì)+Cu2＋

堿性BCA試劑紫色化合物Cu＋二喹啉甲酸，BCA第18頁(yè)，共20頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)6分，星期五單位（ml）空白管標(biāo)準(zhǔn)管ABCD各階段稀釋液蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（0.2mg/ml）

蒸餾水BCA試劑

//0.10.10.10.1/0.1////0.1/////1.51.51.51.51.51.5蛋白含量（mg/ml）=A樣A標(biāo)×0.2×稀釋倍數(shù)37保溫30分鐘562nm