獸用生物制品技術

獸用生物制品技術獸用生物制品技術獸用生物制品技術V:1.0精細整理，僅供參考獸用生物制品技術日期：20xx年X月獸用生物制品概述第一節(jié)獸用生物制品分類與命名原則獸用生物制品是根據(jù)免疫學原理，利用天然或人工培養(yǎng)的微生物、寄生蟲及其代謝產(chǎn)物或免疫應答產(chǎn)物制備的一類物質，專供相應的疫病診斷、治療或預防之用。一.獸用生物制品的分類獸用生物制品種類繁多，按不同的標準分類有不同的歸類。本書依據(jù)生物制品的性質、用途和制法等將其分為疫苗、類毒素、診斷制劑、免疫血清、免疫調節(jié)劑、微生態(tài)制劑。1.疫苗凡接種動物后能產(chǎn)生主動免疫和預防疾病的一類生物制劑均稱為疫苗。（1）活疫苗又稱弱毒疫苗，它是微生物自然強毒株通過物理、化學或生物處理，并經(jīng)連續(xù)傳代和篩選，培養(yǎng)而成的喪失或減弱對原宿主動物致病力，但仍保存良好免疫原性和遺傳特性的毒株，或從自然界篩選的具有良好免疫原性的自然弱毒株，經(jīng)培養(yǎng)增殖后制備的疫苗。其優(yōu)點是可以在免疫動物體內繁殖；能刺激機體產(chǎn)生全面的系統(tǒng)免疫反應和局部免疫反應；免疫力持久，有利于清除局部野毒；產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低。缺點：是疫苗殘毒在自然界動物群體內持續(xù)傳遞后有毒力增強和返祖危險；有不同抗原的干擾現(xiàn)象；要求在低溫、冷暗條件下運輸和儲存。（2）滅活疫苗又稱死疫苗，用標準強毒或免疫原性良好的弱毒株，經(jīng)人工大量培養(yǎng)后，用理化方法將其滅活后制成的疫苗。其優(yōu)點是微生物不能在免疫動物體內繁殖，安全性好；不存在毒力返祖現(xiàn)象；有利于制備多價或多聯(lián)等混合疫苗；制品穩(wěn)定，受外界環(huán)境影響小，有利于保存運輸。缺點是該類疫苗免疫劑量大，生產(chǎn)成本高，有時需多次免疫；有的疫苗存在過敏反應；一般只能誘導機體產(chǎn)生體液免疫和免疫記憶，故常需要用佐劑來增強其免疫效果。（3）單價疫苗利用同一種微生物菌（毒）株或同一種微生物中的單一血清型菌（毒）株的增殖培養(yǎng)物制備的疫苗。（4）多價疫苗指用同一種微生物中若干血清型菌（毒）的增殖培養(yǎng)物制備的疫苗。（5）多聯(lián)疫苗利用不同種類微生物增殖培養(yǎng)物，按免疫學原理和方法組合而成的疫苗。（6）同源疫苗指利用同種、同型或同源微生物株制備，又應用于同種類動物免疫預防的疫苗。如豬瘟兔化弱毒疫苗。（7）異源疫苗①用不同種微生物的菌（毒）株制備的疫苗，接種動物后能使其獲得對疫苗中并未含有的病原體產(chǎn)生抵抗力。如犬在接種麻疹疫苗后，能產(chǎn)生對犬瘟熱的抵抗力；兔接種兔纖維瘤病毒疫苗后能使其抵抗兔黏液瘤病。②用同一種微生物中的一種型的菌（毒）株制備的疫苗，接種動物后能使其獲得對異型病原的抵抗力。如接種豬型布魯氏菌弱毒菌苗后，能使牛獲得對牛型布魯氏菌病的免疫力。2.類毒素類毒素又稱脫毒素。它是指細菌生長繁殖過程中產(chǎn)生的外毒素，經(jīng)化學藥品（甲醛）處理后，成為無毒性而保留免疫原性的生物制劑。接種動物后能產(chǎn)生主動免疫，也可用于注射動物制備抗毒素血清。3.抗血清抗血清為含有高效價特異性抗體的動物血清（或卵黃），能用于治療或緊急預防相應病原體所致的疾病，所以又稱為被動免疫制品。通過給適當動物以反復多次注射同一種抗原物質，促使動物不斷產(chǎn)生免疫應答，在血清中或禽卵黃中含有大量對應的特異性抗體，通過提取血清或卵黃中含有大量對應的特異性抗體，通常提取血清或卵黃制成。4.診斷制品利用微生物、寄生蟲及其代謝產(chǎn)物，或動物血液、組織制備的，專供診斷動物疫病、監(jiān)測動物免疫狀態(tài)及鑒定病原微生物的制品稱為診斷制劑或診斷液。5.免疫調節(jié)劑該類制劑是通過刺激動物機體，提高特異性和非特異性免疫力的免疫制品，從而使動物機體對抗原物質的特異性免疫力更強更持久。6.微生態(tài)制劑微生態(tài)制劑又稱益生素、活菌制劑或生菌劑。是用非病原性微生物，如乳酸桿菌，醋樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或雙歧桿菌等活菌制劑。第1章生產(chǎn)用主要設備第1節(jié)滅菌設備一.干熱滅菌器干熱滅菌是用于干熱空氣進行滅菌的方法，均采用電加熱，可自動控溫，溫度調節(jié)范圍在室溫至400℃，溫差±1℃。干熱滅菌器主要分為箱式和層流隧道箱式，按GMP標準要求，必須使用雙扉型箱式嵌墻構造，在操作區(qū)將消毒物品裝箱，滅菌后從凈化區(qū)取出。使用方法：滅菌開始應把排氣孔敞開，以排除冷氣和潮氣。滅菌器升溫必須緩慢均勻，不能劇增，尤其是130~160℃之間不宜突擊加溫。要保持被滅菌物品均勻升溫。干熱滅菌法所用的溫度一般規(guī)定為160~170℃，時間為1~2h。滅菌結束，必須讓滅菌器內溫度下降到60℃以下，才能緩慢開門，否則可能引起棉花紙張起火、器皿炸裂。注意事項：適用于耐高溫的物品以及不能使用溫熱方法滅菌、潮濕后容易分解或變性的物品。生產(chǎn)所用的玻璃瓶、注射器、試管、吸管、培養(yǎng)皿和離心管等常用干熱法滅菌。玻璃瓶和各種玻璃器皿滅菌前必須完全干燥，以免破裂。裝滅菌物品時要留有空隙，不宜過緊過擠。各種滅菌物品必須包扎裝盒，包扎的紙張不能與干燥箱壁接觸，以免烤焦。二.高壓蒸汽滅菌器（1）使用方法準備→開飽和蒸汽→夾層預熱→夾層冷凝水排出→放置待滅菌物品（裝鍋）→鎖緊氣門→用抽空器排出器內空氣→蒸汽輸入器室→排放器室內空氣→開始滅菌→維持滅菌所需時間→滅菌完畢→關閉蒸汽總閥門→夾層蒸汽排出→器室送入空氣→壓力真空表指針降到0度→開啟器門→取出滅菌物品→清洗器室→器門小開，器室通風→結束滅菌工作。（2）滅菌時間和溫度不同滅菌物品的時間和溫度有不同要求。常用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)液一般116℃20~40min；玻璃器皿、用具等，一般121℃30min。（3）操作注意事項安全措施：蒸汽壓力滅菌器是受壓容器，務必保證設備完好，安全閥、壓力表、溫度計靈敏準確。用前檢查，定期檢修，校正儀表，技術鑒定。滅菌物品保存期：工具、用具、器皿、工作衣帽等滅菌后保存期不超過48h；培養(yǎng)基、溶液等最好72h內使用，最長保存期不能超過5d。三.電離輻射滅菌利用γ射線、倫琴射線或電子輻射穿透物品，殺死其中微生物的滅菌方法稱為電離輻射滅菌。該方法是在常溫下進行，特別適用于各種怕熱物品的滅菌，最適合于大規(guī)模滅菌。目前國內外大量一次性使用的醫(yī)用制品都采用輻射滅菌，各種SPF動物的飼料使用輻射滅菌后，不但其營養(yǎng)成分不被破壞，而且使用安全、保存期長。輻射滅菌的優(yōu)點是：①消毒均勻徹底。②價格便宜，節(jié)約能源。③可在常溫下滅菌，特別適用于熱敏材料。④不破壞包裝，消毒后用品可長期保存。⑤消毒的速度快，操作簡便。⑥穿透力強。本方法唯一的缺點是一次性投資大，并要培訓專門的技術人員管理。四.無菌室目前，根據(jù)獸藥GMP要求，開始應用凈化空氣進入無菌室。凈化空氣所用的潔凈技術，系將經(jīng)過調溫調濕和過濾的無菌空氣，通過排氣孔循環(huán)，使室內的空氣對外保持一定的壓差（正壓或負壓），同時室內可以保持恒溫恒濕和空氣潔凈。潔凈無菌室空調過濾系統(tǒng)的設備有空調機、過濾機、送回風管道等。五.凈化工作臺凈化工作臺應安裝在無菌室或潔凈室使用。第2節(jié)微生物培養(yǎng)設備一.溫室溫室是生物制品生產(chǎn)的必備設備。用于細菌或病毒繁育，一般為36~38℃，培養(yǎng)溫度有的也有特殊要求，如培養(yǎng)霉菌需20~25℃。二.細胞培養(yǎng)轉瓶機是用于大量培養(yǎng)細胞的一種設備。這種大型轉瓶機都安裝在自動控溫的溫室中，并設有高溫及低溫的報警裝置，轉瓶機通過變速箱使轉瓶的轉速控制在9~12r/h。實驗室及小規(guī)模生產(chǎn)的轉瓶可安放在溫箱中。細胞轉瓶機應符合國際GMP標準的各項要求，具有可靠性高、平穩(wěn)運轉、拆裝方便、耐酸、耐油耐腐蝕等特點。三.發(fā)酵培養(yǎng)罐可進行細菌和細胞的培養(yǎng)，目前各生物制品企業(yè)均采用培養(yǎng)罐培養(yǎng)細菌，生產(chǎn)規(guī)?？捎^。培養(yǎng)罐可自動調溫、調PH值，用無級調速電動機、磁攪拌、消泡、控制氧壓、自動補液、換液、自動高壓滅菌、自動計算呼吸商等精密儀表，而罐體結構均為不銹鋼質。這種深層培養(yǎng)法的優(yōu)點是可使細菌培養(yǎng)有比較一致的環(huán)境，抽樣時高度一致性，特別便于生物化學的分析、細胞動力學及對單位體積內細胞數(shù)目增長情況的研究，也是一個生產(chǎn)優(yōu)質疫苗的方法。四.生物反應器可用于培養(yǎng)懸浮生長或貼壁生長的動物細胞，可生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體、干擾素、激素等，用生物反應器培養(yǎng)動物細胞比目前用的靜止培養(yǎng)、轉瓶培養(yǎng)有更多的優(yōu)越性。五.微生物濃縮裝置為有效地連續(xù)對微生物、抗體及生物制劑進行濃縮、分離，必須使用超濾器。根據(jù)不同用途、不同容量、超濾器可組成內壓型、外壓型和實驗型。它們都是以中空纖維超濾膜組件為主體，中空纖維膜為不對稱半透膜，呈毛細管狀，膜的外表面和內表面存在致密層，可分別形成外壓和內壓。在壓力作用下，原液在膜內或膜外流動。體積大于微孔的溶質截留在原液內，小于微孔的溶質則隨溶劑透過膜，對微粒、膠體、細菌以及各種大分子有機物具有良好的分離作用，從而可達到物質分離、濃縮和提純的目的。內壓型以獲得純凈的超濾液為目的，主要用于提純、除菌。外壓型以濃縮為目的，原液循環(huán)直至達到需要的濃度為止，主要用于有用物質的回收。六.孵化器按GMP標準的要求，易消毒、易清洗。新型孵化器多是高分子材料制造的，耐熱、耐濕，抗酸堿及消毒藥，供SPF雞胚使用的孵化器，還具有空氣過濾系統(tǒng)，保證進入的空氣呈無菌狀態(tài)。第3節(jié)乳化設備一.膠體磨立式膠體磨是制造佐劑的工具之一，但由于其耐磨性較差及受電壓影響大的缺點，從而影響了滅活疫苗的質量。其乳化的液珠直徑在1~5μm之間。二.高壓勻漿泵這是一種制備超細液-液乳化物或液-固分散物的通用設備，其主要加工部件具有極高的耐腐蝕性和良好的耐磨性，對加工乳化的油佐劑、抗原均不會產(chǎn)生不良影響，替代原來應用的膠體磨。乳化液珠直徑僅0.25~2μm。三.乳化裝置用于規(guī)?；腿閯┮呙绲纳a(chǎn)，由貯油罐、油相制備罐、水相制備罐、剪切泵、乳化罐及貯苗罐組成。操作步驟:先打開油相制備罐通向乳化罐的閥門，并打開貯油罐壓縮空氣閥門，給貯油罐加壓，再打開乳化罐的無菌呼吸器的閥門，然后緩慢打開乳化罐上進油閥門。油相進入乳化罐后，啟動攪拌電機，使電機緩慢攪拌。關閉貯油罐上控制壓縮空氣的手動球閥。打開冷卻水循環(huán)的手動球閥。打開水相罐通往乳化罐的閥門，并打開水相罐壓縮空氣的閥門，給水相罐加壓，打開乳化罐上的無菌呼吸器的手動隔膜閥，慢慢開啟乳化罐上的水相進入的閥門，使流量計的指針緩慢上升。將水相輸入乳化罐內。從乳化罐加樣口按比例加入1%的硫柳汞溶液，硫柳汞的最終濃度為10-4.然后打開乳化罐的出料閥門同時開啟乳化機，開始乳化，乳化結束，打開貯苗罐的進料閥門將乳化好的乳劑苗輸入至貯苗罐中。四.分裝與包裝設備一.自動灌裝半加塞聯(lián)動機二.瓶裝液體制劑分裝包裝設備第5節(jié)冷凍真空干燥設備一.凍干機冷凍真空干燥設備簡稱凍干機，由制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)和控制系統(tǒng)四部分組成，包括凍干箱、冷凝器、真空泵組、制冷壓縮機組、加熱裝置、控制裝置等。凍干箱內設有若干層隔板，凍干的制品在隔板上，隔板內置冷凍管和加熱管，分別對制品進行冷凍和加熱。冷凝器又稱水汽凝集器或冷阱，內裝有螺旋狀冷凝蛇管數(shù)組，其操作溫度應低于干燥箱內制品的溫度，工作溫度可達-45~-60℃，其作用是捕獲制品升華的水蒸氣，以保證凍干過程的進行。真空泵組對系統(tǒng)抽真空，使凍干箱中絕對壓力應保持在0.13~13.3Pa。制冷壓縮機組對凍干箱中的隔板及冷凝器中的冷凍盤管降溫，凍干箱中的隔板可降至-30~-40℃。常用的冷凍劑有氨、氟利昂、二氧化碳等。加熱裝置供制品在升華階段時升溫用，應能保證干燥箱中隔板的溫度達到80~100℃，加熱系統(tǒng)可采用電加熱、輻射加熱或循環(huán)油間接加熱。控制裝置是利用計算機輸出程序控制整個工作系統(tǒng)正常運轉。新型凍干機凍干箱內的板層上有液壓裝置，箱內可通入高壓熱蒸汽，能夠實現(xiàn)箱內自動壓瓶塞和在線高壓消毒。二.凍干程序冷凍真空干燥又稱冷凍干燥，簡稱凍干。它是物質干燥的一種方法。是將物料或溶液在較低的溫度下凍結成固態(tài)，然后在真空下將其中水分不經(jīng)液態(tài)直接升華成氣態(tài)而脫水的干燥過程。真空冷凍干燥在生物制品方面的應用十分廣泛，干燥后的制品水分被排除了96%以上，易于長期保存。生物制品冷凍干燥的程序：凍干箱進行空箱降溫→液態(tài)制品裝箱→預凍→升華干燥→解析干燥→結束凍干→加塞封口。（1）預凍在干燥之前，先將溶液物質在低溫下凍結稱為預凍。預凍是將溶液中的自由化水固化，使干燥后產(chǎn)品與干燥前有相同的形態(tài)，防止真空干燥時起泡、濃縮、收縮和溶質移動等不可逆變化產(chǎn)生。預凍溫度必須低于產(chǎn)品的共熔點溫度，各種產(chǎn)品的共熔點溫度是不一樣的，必須認真測得。溶液達到全部凝固凍結的溫度稱為凝固點或共晶點，實質上物質的凝固點也是該物質的融化點，故又稱此溫度為共熔點。共熔點的測定是1對白金電極和1支溫度計侵入待測樣品溶液中，并將電極、溫度計、儀表與記錄儀連接，然后將溶液冷凍到-40℃以下，直至電極達到無窮大，然后緩慢升溫至電阻突然降低的溫度，即為該溶液的共熔點溫度。實際制定工藝曲線時，一般預凍溫度要比共熔點溫度低5~10℃。制品裝量通常為容器容量的1/4~1/5，厚度不宜大于15mm。生物制品一般預凍時間為2~4，即可開始升華。（2）升華干燥階段也稱第一階段干燥。將凍結后的產(chǎn)品置于密閉的真空容器中加熱，冰晶升華成水蒸氣逸出，使產(chǎn)品脫水干燥。干燥是從外表面開始逐步向內推移，冰晶升華后殘留下的空隙變成升華水蒸氣的逸出通道。當全部冰晶除去時，第一階段干燥完成。此時除去全部水分的90%左右，占總干燥時間的80%。此階段箱內的真空度一般為10~30pa。（3）解析干燥階段也稱第二階段干燥。在第一階段干燥結束后，必須對產(chǎn)品進一步干燥以除去殘余水分。該階段產(chǎn)品的溫度應上升到該制品最高容許溫度，并在該溫度一直維持到凍干結束。制品最高容許溫度視制品的品種而定：病毒性制品為25℃，細菌性制品為30℃，血清和抗生素等可高達40℃。箱內必須是高真空，真空度一般為15~30Pa以下，使解析出來的水蒸氣逸出產(chǎn)品。第二階段干燥后，產(chǎn)品內殘余水分的含量不超過4%。（4）加塞與壓蓋凍干程序結束，干燥制品進行加塞、壓蓋，入待檢庫。加塞可采用箱內加塞法和箱外加塞法兩種方式。目前，幾乎所有生物制品企業(yè)凍干制品都采用箱內加塞法。凍干箱配有液壓或氣壓壓塞的動力裝置，在真空下或放入惰性氣體下，將分裝時放置在瓶口上的四叉膠塞自動壓緊。該方法可從根本上防止干燥制品受空氣中水分和氧氣的影響。凍干的總時間是指預凍時間、升華時間和第二階段干燥時間總和。一般為18~24h，有些特殊的制品需要幾天時間。第6節(jié)冷藏設備一.冷庫冷庫可分為中、小型兩類。小型只設冷藏間或活動冷庫。中型冷庫房，一般由主體建筑和附屬建筑兩部分組成。主體建筑包括冷藏庫和空調間；附屬建筑包括包裝間、真空檢驗室、標準間、機房、泵房、配電房等。保溫性能應符合生物制品貯藏保管的最基本要求：①空調間，其最高庫溫不能超過15℃。最低在0℃以上，一般用冷風機作冷卻設備。②冷藏間，要求在-15℃以下，作制品保管。為保證庫溫恒定，在建筑結構上，必須在其外墻、地坪、平頂設置連續(xù)的隔熱層，要有足夠的厚度，以阻止冷氣從室內散逸；做好保溫層的防潮設施，低溫庫要采用電動冷庫門。使用注意事項：①新冷庫初次投產(chǎn)時，不應降溫過快，避免結構內部結冰膨脹。當庫溫在4℃以上時，每天降溫不得超過3℃，直至到達要求為止。②冷庫在使用以后，要保持溫度的穩(wěn)定性，即高溫庫（10±5）℃；低溫庫（—18±3）℃。③嚴格防水、汽滲入構造保溫層；低溫庫內不得做多水物品的作業(yè)。④合理使用庫容，合理安排貨位和堆放高度，保持庫內地坪受荷均勻。二.冷藏運輸設備為保證生物制品的使用效果，在運輸過程中必須使用具有隔熱車體及降溫裝置的冷藏車。這類車按性能來說可分為機器冷藏車與冰箱冷藏車。目前我國多使用后者，這種車造價低，使用維修方便。無論任何類型的冷藏車，都必須具有：①具有良好的隔熱車體，減少車內與外界的熱交換。②設有制冷降溫裝置，適應生物制品的保存條件。③設有空氣循環(huán)裝置，以保證車內溫度的均衡。④設有溫度指示，最好有自動控制儀表，以控制車內溫度。保溫箱無制冷系統(tǒng)，亦以軟木、玻璃纖維和聚氨酯泡沫塑料為保溫材料。內外層常用鍍鋅鋼板和鋁板為保護層。不能自動降溫至冰點以下，而是使用時將冷凍干燥的生物制品置于箱內，并加入一定的冰塊，嚴密加蓋。箱內可維持20多小時不解凍，能維持運輸途中的低溫保存。目前國內獸用冷凍干燥制品的運輸，多使用這種簡單的保溫箱。三.液氮罐液氮罐是專供貯存液氮用的容器，液氮的溫度可達-196℃，屬超低溫，因而是保存活細胞、活組織、生物制品、冷凍精液、微生物等理想容器。液氮罐的構造和玻璃熱水瓶一樣，能防止熱的傳導、輻射和對流。液氮罐都是雙壁的，雙壁之間有一夾層。夾層吧、空隙越大，真空度越高，蓄冷的時間也越長。新罐或使用后液氮揮發(fā)已凈和清洗后待用的容器，在使用前，先加入適量液氮預冷30min左右，然后加滿其余的液氮，充裝后的液面應低于頸管。液氮充滿后，液氮出現(xiàn)沸騰不止或罐的上半部結霜，證明此缸的性能已不正常。放入或提取罐內的貯存物時，要迅速浸入或離開液氮面，取出被保存物的動作要快、準、穩(wěn)。第7節(jié)污物處理設備由于生物制品都是使用病原體進行制造和檢驗的，如果排放到外界，會造成環(huán)境污染，引起動物疫病流行，甚至危害人類健康。一．污水處理生物制品企業(yè)生產(chǎn)的污水，須經(jīng)無害化處理，檢驗合格后才能排放。通常采用高壓熱蒸汽滅菌法。生產(chǎn)和檢驗的污水直接排放到污水儲罐中，當收集于污水儲罐中的污水達到一定量時，用泵向儲罐夾層中通入蒸汽，待罐內溫度達到100℃，煮沸60min，關閉蒸汽閥，降溫后經(jīng)檢測合格后排放。強毒舍生產(chǎn)的污水排入污水管網(wǎng)集中到污水池，進行高壓蒸汽滅菌，經(jīng)檢測合格后排放到污水處理站進行二次處理。污水排放標準：①生化需氧量（5d、20℃）達到60mg/L，生化需氧量越高，表示水中有機污染物越多；②化學需氧量重鉻酸鉀法達到100mg/L，氧化劑也可用高錳酸鉀；③動物檢測二、帶毒糞便及墊草的處理采用生物發(fā)酵法進行。原則是每池裝滿后能自然發(fā)酵2年以上。發(fā)酵池的內外墻用水泥沙漿粉刷外，還應涂瀝青防水層，防止池內污水滲漏，池外地表、地下水滲入影響發(fā)酵效果。為了便于清除，應一半設在強毒區(qū)，一半設在隔離區(qū)外，以便發(fā)酵徹底后，啟蓋清出糞便和殘渣、墊草的腐爛物。強毒區(qū)內產(chǎn)生的廢棄物要經(jīng)高壓無害化處理后移出工作區(qū)，對不宜高溫處理的應使用消毒液浸泡消毒處理后，進行生物發(fā)酵。三、動物尸體處理所有感染疫病死亡的動物以及檢驗耐過的動物，試驗結束后須宰殺，將尸體用高壓蒸汽消毒、焚尸爐焚燒或化制后，按糞便殘渣處理辦法進行生物發(fā)酵處理，安全可靠。第2章保護劑、滅活劑與免疫佐劑第1節(jié)保護劑保護劑又稱穩(wěn)定劑，是指一類能防止生物活性物質在冷凍真空干燥時受到破壞的物質。生物制品的冷凍真空干燥一般都加凍干保護劑，以使制品在凍干后仍保持有較高的生物學活性，而且能夠延長制品保存期并提高耐熱性。一.凍干保護劑的組成與作用凍干保護劑通常由營養(yǎng)液、賦形劑和抗氧劑三部分組成。（1）營養(yǎng)液可使因凍干而受損傷的細胞修復，對水分子起緩解作用，并能使凍干生物制品仍含有一定量水分；還可促進高分子物質形成骨架，使凍干制品呈多孔的海綿狀，增加溶解度，常為低分子有機物，如蔗糖、山梨醇、乳糖、氨基酸和糖類等。（2）賦形劑主要起骨架作用，防止低分子物質的碳化和氧化，保護活性物質不受加熱的影響，使凍干制品形成多孔性、疏松的海綿狀結構，從而使溶解度增加，常為高分子有機物，如脫脂乳、蛋白胨、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖、明膠等。（3）抗氧劑可抑制凍干制品中的酶作用，增加生物活性物質在凍干后貯存期間的穩(wěn)定性，如維生素C、維生素E和硫代硫酸鈉等。二.影響保護劑效能的因素保護劑的效能主要表現(xiàn)在保證生物活性物質在凍干和保存過程中的存活率。（1）保護劑種類用不同保護劑凍干的同一種微生物，在其保存過程中存活率不同。（2）保護劑組分濃度保護劑組分的濃度可直接影響凍干制品細菌或病毒的成活率，必須嚴格掌握。（3）保護劑配制方法配置方法不同會影響保護劑的效果，例如含糖保護劑滅菌溫度不宜過高，否則由于糖的炭化而影響凍干制品的物理性狀和保存效果，所以均采用116℃30min滅菌或間歇滅菌；又如血清保護劑就不能用熱滅菌法，必須以濾過法除菌。（4）保護劑酸堿度（pH）保護劑的pH應與微生物生存時的pH值相同或相近，過高或過低都能導致微生物的死亡。對于凍干活疫苗而言，一種良好的凍干保護劑不僅能夠在凍干過程中最大限度地提高疫苗微生物的存活率，而且需要提高其耐熱性，延長保存期。三.常用的凍干保護劑（1）5%蔗糖脫脂乳保護劑蔗糖5g，加脫脂乳至100ml，充分溶解后，100℃蒸汽間歇滅菌3次，每次30min；或110~116℃高壓滅菌30~40min。適用于雞新城疫、豬瘟、羊痘和狂犬病等病毒性活疫苗保護劑。（2）明膠蔗糖保護劑明膠1%~2%、蔗糖5%、硫脲1%~2%。先將12%~18%明膠液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加熱溶解，116℃高壓滅菌30~40min；或100℃3次滅菌，每次30min。適用于豬肺疫和豬丹毒等細菌性活疫苗保護劑。第2節(jié)滅活劑一.滅活概念與滅活方法獸用生物制品生產(chǎn)中的滅活，是指破壞微生物的生物學活性、繁殖能力、致病性和毒性，但盡可能不影響其免疫原性，被滅活的微生物主要用于生產(chǎn)滅活疫苗；或指破壞診斷血清或待檢血清中的補體活性，以避免補體對診斷試驗的干擾作用。滅活的主要方法有兩類，即物理學方法和化學方法。補體可以非特異性和抗原結合（1）物理學滅活包括加熱及射線照射等方法。加熱滅活方法除用于血清滅活（56℃30min）外，很少用于疫苗生產(chǎn)，加熱殺死微生物的方法比較粗糙，容易造成蛋白質變性，因而免疫原性受到明顯影響。（2）化學滅活該方法目前采用最多。用于滅活微生物的化學試劑或藥物稱為滅活劑。二.常用的滅活劑1.甲醛溶液甲醛溶液是甲醛氣體的水溶液，又稱福爾馬林。常用的甲醛溶液約含37%甲醛氣體，為無色透明液體，有辛辣窒息味，對眼、鼻粘膜有強烈刺激性，較冷溫度下久貯易變渾濁，形成三聚甲醛沉淀，雖加熱可變清，但會降低其滅活性能，故一般商品甲醛溶液加10%~15%甲醇，以防止其聚合。適當濃度的甲醛可使微生物喪失增殖力或毒性，保持抗原性和免疫原性，不同類型的微生物，使用甲醛滅活的濃度不同；一般需氧菌為0.1%~0.2%、厭氧菌0.4%~0.5%、病毒多數(shù)為0.1%~0.3%。不論是殺菌或脫毒，使用甲醛或其他滅活劑，其濃度及處理時間都要根據(jù)試驗結果來確定，通常以用低濃度、處理時間短而又能達到徹底滅活目的為原則，必要時在滅活后加入硫代硫酸鈉，以中斷其反應。滅活作用機理是甲醛的醛基作用于微生物蛋白質的氨基產(chǎn)生羥甲基胺，作用于羧基形成亞甲基二醇單酯，作用于羥基生成羥甲基甲酚，作用于巰基形成亞甲基二醇。上述反應生成的羥甲基等代替敏感的氫原子，破壞生命的基本結構，導致微生物死亡。甲醛還可與微生物核糖體中的氨基結合，使兩個亞單位間形成交聯(lián)聯(lián)，亦可抑制微生物的蛋白質合成。2.烷化劑這類滅活劑能破壞病毒的核酸芯髓，使病毒完全喪失感染力，而又不損害其蛋白衣殼，從而保留其保護性抗原。3.苯酚又名石炭酸。為無色結晶或白色熔塊，有特殊氣味，有毒及腐蝕性，暴露在空氣中和陽光下易變紅色，在堿性條件下更易促進這種變化。4.結晶紫是一種堿性染料，為綠色帶有金屬光澤結晶或深綠色結晶狀粉末，易溶于醇，能溶于氯仿。滅活機制主要是其陽離子與微生物蛋白質帶陰電荷的羥基形成弱電性化合物，妨礙微生物的正常代謝。5.β-丙酰內酯三.影響滅活作用的因素（1）滅活劑特異性在選擇滅活劑時，應考慮其特異性，即應考慮其對微生物的作用范圍。如酚類能抑制和殺滅大部分細菌的繁殖體，真菌和病毒對酚類不太敏感。（2）微生物種類與特性不同種類的微生物對各類滅活劑的敏感性并不完全相同；細菌的繁殖體及其芽孢對化學藥物的抵抗力不同；生長期和靜止期的細菌對滅活劑的敏感程度亦有差別。（3）滅活劑濃度滅活劑濃度越高，滅活脫毒越快，但抗原損失量亦較大。有時可以采用分次加入滅活劑進行滅活、脫毒比較緩和的方法。即將滅活溶液分數(shù)次加入，加量有小至大，ph由低而高，溫度逐步提高到允許的最高溫度，這樣利于保護抗原的免疫原性。（4）滅活溫度通常情況下，滅活作用隨滅活溫度上升而加速。但是溫度上升，細菌死亡率可成倍增加，如果溫度超過40℃或更高，對微生物的抗原性將有不利影響。（5）滅活時間與滅活劑濃度和作用溫度密切相關。一般隨著滅活劑濃度及作用溫度升高，滅活時間則縮短。在生物制品生產(chǎn)中，應以保證制品安全和效力，采用低滅活劑劑量、低作用溫度和短時間處理為最佳。（6）酸堿度（PH）pH對細菌的滅活作用有較大影響。在微酸性時滅活速度慢，抗原性保持較好，在堿性時滅活速度快，但抗原性易受破壞。同時，PH也影響滅活劑的電離度。未電離的分子一般較易通過細菌細胞膜，滅活效果較好。（7）有機物的存在被滅活的病毒或細菌液中，如果含有血清或其他有機物質，會影響滅活劑的滅活能力。因為有機物能吸附于滅活劑的表面或者與滅活劑的化學基團相結合。則明顯降低滅活劑的滅活作用。第3節(jié)免疫佐劑免疫佐劑是生物制品常用的物質，單獨使用時一般沒有免疫原性，與抗原物質混合或同時注射使用時，能非特異性增強抗原特異性免疫應答的作用。一.概念與作用佐劑：凡是可以增強抗原特異性免疫應答的物質均稱為佐劑。免疫佐劑作用：①抗原遞呈。是指抗原分子遞呈給T細胞的方法。佐劑與疫苗的聯(lián)合作用，有助于抗原性物質在胞內被加工，被MHC分子特異性的結合、保護、運輸并遞呈給效應細胞。②抗原尋的。是指抗原傳遞給免疫系統(tǒng)中適當效應細胞的效率。佐劑可延長抗原在組織內的貯存時間，使抗原緩慢降解和緩釋。③免疫調節(jié)。是指任何可以修飾的免疫效應細胞對抗原或表位進行加工的機制。通過這種機制，可以改變特異性免疫應答的本質或強度。同一抗原和不同佐劑一起使用能夠引起不同的免疫反應。二.常規(guī)免疫佐劑1.鋁鹽類佐劑（1）氫氧化鋁膠佐劑又稱鋁膠，質優(yōu)的鋁膠分子細膩，膠體性良好，穩(wěn)定，吸附力強，保存2年以上吸附力不變。（2）明礬佐劑（3）磷酸三鈣佐劑2.油乳佐劑油乳佐劑是指一類由油類物質和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。此類佐劑著名的有弗氏佐劑（FA），分為弗氏不完全佐劑（FIA）和弗氏完全佐劑（FCA）。弗氏佐劑可使在正常狀態(tài)下沒有免疫原性的物質成為免疫原，其作用機理是先作用于Th1細胞，后作用于Th2細胞，并能啟動細胞免疫而發(fā)揮作用。（1）乳劑的概念乳劑是將一種溶液或干粉分散成細小的微粒，混懸于另一不相溶的液體中所形成的分散體系。被分散的物質稱為分散相（內相），承受分散相的液體稱連續(xù)相（外相），兩相間的活性物質稱為乳化劑。（2）乳化劑商品乳化劑的種類很多，通?？筛鶕?jù)用途依據(jù)乳化劑的HLB值（親水親油平衡值）進行選擇。HLB值高，容易形成水包油型油乳劑；HLB值低，易形成油包水型油乳劑。（3）白油制乳劑苗用的白油，為無多環(huán)芳烴化合物、粘度低、無色、無味和無毒性。（4）乳劑配方與乳化方法乳化劑、油相和水相的配合比例及乳化方法，決定了制備乳劑的性狀和穩(wěn)定性。一種好的乳劑疫苗應是粘度低，顆粒均勻，穩(wěn)定性良好，呈乳白色。大量生產(chǎn)乳劑疫苗時，可將94%白油與6%司本-80混合后加1%~2%硬脂酸鋁，滅菌后即為油相；將抗原液加4%吐溫-80為水相。檢驗：取樣于10ml的離心管中裝滿乳劑，3000r/min離心15min，相當于保存一年以上不破乳，如不分層，即獲得穩(wěn)定的W/O型乳劑苗，如分層則繼續(xù)乳化直至合格為止。3.蜂膠佐劑三、新型免疫佐劑1.細胞因子類佐劑細胞因子是機體的各種細胞在其生命周期中所釋放的具有不同生物學效應的物質，是免疫細胞間相互作用的調節(jié)信號。細胞因子的作用特點表現(xiàn)為多效性、靶細胞的多樣性、多源性、高效性和快速反應性。幾種重要的細胞因子為白細胞介素-1、白細胞介素-2、白細胞介素-4、白細胞介素-12、γ-干擾素。2.CpGDNA含有非甲基化CpG（胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸）基序的脫氧核糖核酸DNA。它在誘導機體非特異性免疫應答、增強抗原特異性免疫應答及調控免疫應答類型等方面發(fā)揮著重要作用。3.毒素佐劑目前，已證明經(jīng)過基因突變體外表達的霍亂毒素（CT）、大腸桿菌不耐熱毒素（LT）和破傷風類毒素（TT）等沒有毒性，具有很好的佐劑作用。4.免疫刺激復合物（ISCOM）佐劑應用于多種細菌、病毒和寄生蟲病的疫苗，具有產(chǎn)生全面免疫應答的效力，可長期增強特異性抗體應答。5.脂質體（LIP）佐劑脂質體在宿主體內可以生物降解，本身無毒性，并且能降低抗原的毒性，無局部注射反應。脂質體與弗氏佐劑或氫氧化鋁膠混合使用，效果最佳。第3章細菌性疫苗生產(chǎn)技術第1節(jié)細菌性疫苗生產(chǎn)工藝流程1.培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基是人工制備的供細菌生長繁殖的一種營養(yǎng)物質，是維持與繁殖細菌的基礎。2.生產(chǎn)用種子制備（1）原種由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所或其委托的單位負責保管。（2）基礎種子由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所或其委托的單位負責制備、檢驗、保管和供應。（3）生產(chǎn)種子有生產(chǎn)企業(yè)自行制備、檢驗和保管。以上種子如果按菌（毒、蟲）種的毒力可以分為:①強毒菌（毒、蟲）種：是指具有強大致病力的菌（毒、蟲）種，一般免疫原性好，常用于制造某些滅活疫苗、免疫血清以及疫苗的效力檢驗等。②弱毒菌（毒、蟲）種：是指對動物無致病力而具有一定免疫原性的菌（毒、蟲）種，主要用于制造弱毒疫苗。生產(chǎn)用種子是由基礎種子擴繁制備而成，包括一級種子和二級種子。通常將基礎種子劃線接種于適宜瓊脂平板培養(yǎng)基中，選取經(jīng)分離培養(yǎng)后獲得的典型菌落5~10個，混合接種于適宜瓊脂斜面若干支，一般37℃培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查和鑒定實驗，合格后，作為一級種子。3.制苗用菌液制備將合格的種子液以1%~2%的量接種于適宜的培養(yǎng)基，然后依不同菌苗的要求進行培養(yǎng)。4.半成品檢驗上述培養(yǎng)獲得的菌液即為半成品。半成品檢驗包括純粹檢驗和活菌計數(shù)。如果制備滅活菌苗，菌液經(jīng)純粹檢驗和活菌計數(shù)檢驗合格后，還需用滅活劑進行滅活，滅活后需進行無菌檢驗。第2節(jié)培養(yǎng)基制備技術一、培養(yǎng)基的原料標準（1）水是制造培養(yǎng)基的重要原材料，是細菌生長所需營養(yǎng)成分的良好溶劑。（2）肉浸汁是生產(chǎn)培養(yǎng)基的基礎原料。（3）蛋白胨是蛋白質經(jīng)蛋白酶或酸水解后的水解產(chǎn)物。（4）明膠是由動物膠原組織加工處理制成，是一種蛋白質。（5）瓊脂是從石花菜等海藻類中提取的復雜多糖，為半乳糖膠。（6）酵母浸出液酵母浸出液含有某些維生素與生長因子，是促進細菌生產(chǎn)繁殖的重要材料之一。二、培養(yǎng)基分類1.按原料來源分類（1）天然培養(yǎng)基（2）人工合成培養(yǎng)基2.按物理性狀分類（1）液體培養(yǎng)基（2）半固體培養(yǎng)基（3）固體培養(yǎng)基3.按用途分類（1）基礎培養(yǎng)基（2）營養(yǎng)培養(yǎng)基（3）選擇培養(yǎng)基（4）鑒別培養(yǎng)基（5）增菌培養(yǎng)基（6）厭氣培養(yǎng)基（7）生化培養(yǎng)基（8）檢驗培養(yǎng)基三、培養(yǎng)基制造程序1.配制根據(jù)培養(yǎng)基配方準確稱取各種成分放于容器中，加少量水浸透原料后，補足水量，使原料溶解。也可用熱水或加熱進行溶解，并隨時攪拌，防止外溢。2.調整酸堿度由于細菌對酸堿度很敏感，培養(yǎng)基的酸堿度經(jīng)過調整后才能使用。3.過濾與澄清培養(yǎng)基配制成后一般有沉渣或混濁，須過濾澄清使其清晰透明才可使用?？捎眉啿?、脫脂棉或濾紙進行過濾。澄清是利用培養(yǎng)基中引起混濁的膠體混懸物在高溫下聚集沉淀的特性，將制好的培養(yǎng)基置于高壓鍋內110℃加熱30min后，放置數(shù)小時，使培養(yǎng)基自然冷卻凝固，然后取上層澄清部分進行分裝。4.滅菌一般培養(yǎng)基均用高壓蒸汽滅菌，通常為116℃滅菌30min5.無菌檢驗一般將制好的培養(yǎng)基于37℃保溫24~48h，證明無菌后方可應用。第3節(jié)細菌培養(yǎng)技術細菌培養(yǎng)是指細菌在動物體外的人工培養(yǎng)基以及人工控制的環(huán)境中生長繁殖的過程。制備細菌性疫苗首先應通過細菌分離培養(yǎng)，獲得單個細菌菌落，制備細菌菌種，然后，進行規(guī)?；毦囵B(yǎng)。一、細菌分離培養(yǎng)（1）劃線接種法此法最為常用，即在不同培養(yǎng)基平面上，以多種方法劃線接種細菌，使細菌生成單個菌落。根據(jù)菌落特性進行鑒別、挑選典型菌落進行純培養(yǎng)，制備種子培養(yǎng)物。（2）傾注培養(yǎng)法該法適用于深層條件下生長良好的細菌的分離培養(yǎng)。即先將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱溶解，冷至45~50℃，加入適量細菌培養(yǎng)液，混勻后傾入滅菌培養(yǎng)皿內，制成平板。置37℃培養(yǎng)24~36h后，挑取典型菌落移植培養(yǎng)。厭氧菌的分離培養(yǎng)多數(shù)在含二氧化碳條件下進行。二、細菌的規(guī)?；囵B(yǎng)1.菌種接種量細菌菌種是指有一定標準的菌體增殖培養(yǎng)物，簡稱菌種。如接種量過少，會引起生長繁殖緩慢，影響活菌數(shù)，有時甚至出現(xiàn)無菌生長；接種量過多，就會將過多的代謝物帶入培養(yǎng)基內，造成有害物質的抑制生長。通常菌種接種量為1%~2%。2.培養(yǎng)時間最佳培養(yǎng)時間通常依據(jù)細菌的生長曲線而定。多數(shù)在對數(shù)繁殖后期至穩(wěn)定前期間活菌數(shù)最高，生命力最強，宜于收獲。3.培養(yǎng)方法（1）固體表面培養(yǎng)法常用大扁瓶瓊脂平板，經(jīng)無菌檢驗后，無菌接入菌種液，使其均勻分布于瓊脂表面，平放靜置培養(yǎng)，收集菌苔，制成細菌懸浮液，用于制備診斷抗原或疫苗。（2）液體靜置培養(yǎng)法適于一般細菌性疫苗的生產(chǎn)。培養(yǎng)容器可用大玻璃瓶或培養(yǎng)罐，培養(yǎng)基裝量為容器體積的1/2~2/3，滅菌后，冷卻至37℃接入菌種，保持適宜溫度靜置培養(yǎng)。（3）液體深層通氣培養(yǎng)法適用于需氧菌的培養(yǎng)，可加速細菌分裂繁殖，縮短培養(yǎng)時間，提高細菌數(shù)量。（4）透析培養(yǎng)法透析培養(yǎng)是指培養(yǎng)室與培養(yǎng)基室之間隔1層半透膜的培養(yǎng)方法。該系統(tǒng)把培養(yǎng)基與培養(yǎng)物分開為各自的循環(huán)系統(tǒng)，中間經(jīng)透析器交換營養(yǎng)物。4.采用通氣培養(yǎng)需注意的問題（1）補充營養(yǎng)物質根據(jù)被培養(yǎng)的細菌對營養(yǎng)要求，在培養(yǎng)過程中注意補充營養(yǎng)物質。如適當?shù)丶悠咸烟茄a充碳源；適當加蛋白胨或必需氨基酸補充氮源，才能更好發(fā)揮通氣培養(yǎng)作用，增加菌數(shù)，提高制品的質量。（2）控制通氣量細菌對氧的需要，在不同生長發(fā)育階段又有所不同，各種細菌繁殖過程中需氧量亦不一樣。（3）控制最適PH值深層通氣培養(yǎng)PH值變化較快，保持培養(yǎng)過程的最適PH值很重要。（4）培養(yǎng)溫度在培養(yǎng)過程中要適當調節(jié)培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)罐夾層直接用蒸汽加熱往往不穩(wěn)定，最好用自控調節(jié)的溫水循環(huán)控制溫度，以使最適培養(yǎng)溫度上下不超過1℃。（5）控制污染主要是通入的空氣處理不當、攪拌軸密封不嚴或底盤與進出液閥門滅菌不徹底等，為此，培養(yǎng)罐的罐體與部件，應以不銹鋼制造，墊圈用聚四氟乙烯制品，使之密封良好，易于滅菌。此外空氣濾過裝置，首先是將壓縮出來的空氣通過油水分離。不能使有氣味的空氣進入培養(yǎng)罐內，經(jīng)過棉花與活性炭濾器，再經(jīng)過除菌過濾，以免通氣帶進雜菌，造成培養(yǎng)液污染。同時培養(yǎng)過程的排氣管口也應有消毒設備，以免污染環(huán)境。三、細菌計數(shù)計數(shù)1.活菌計數(shù)法活菌計數(shù)是將待測樣品精確地做一系列稀釋，然后再吸取一定量的某稀釋度的菌液樣品，用不同的方法進行培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)后，從長出的菌落數(shù)及其稀釋倍數(shù)就可換算出樣品的活菌數(shù)，通常用菌落形成單位（CFU）表示。（1）傾注平板培養(yǎng)法根據(jù)標本中菌數(shù)的多少，用普通肉湯將被檢標本進行10倍遞進稀釋。取某稀釋度的菌液樣品1ml加在滅菌平皿中，然后取預先加熱融化且冷至45~50℃的瓊脂培養(yǎng)基分別傾入上述平皿中，立即搖勻放平，待其充分凝固后，置37℃培養(yǎng)一定時間。統(tǒng)計平皿上長出的菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即為每毫升標本中含有的活菌數(shù)。（2）平板表面散布法按常規(guī)方法制作瓊脂培養(yǎng)基平板，分別取不同稀釋度細菌液0.1ml滴加于平板上，并使其均勻散開。（3）微量點板計數(shù)法本法中培養(yǎng)基的制備、處理及樣品的稀釋與平板表面散布法相同，只是每個稀釋度的接種量為0.02ml，使其自然擴散。2.比濁計數(shù)法其原理是菌液中含菌數(shù)多少與其混濁度成正比。取一定稀釋度的菌液與標準比濁管進行比濁，能概略計算出每毫升菌液中的菌數(shù)。3.顏色改變法其原理是在液體培養(yǎng)基中按0.1%量加入1%酚紅溶液，利用支原體生長過程中產(chǎn)酸，使得培養(yǎng)基的顏色由粉紅變成黃色，從而確定支原體含量，以每毫升顏色變化單位計數(shù)。主要用于支原體培養(yǎng)物的菌數(shù)測定。細菌自家苗1.細菌分離：取病料，分離致病菌。2.毒力鑒定：將單個細菌分別接種營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)20h，取1ml接種雞，選擇死亡最快菌株，檢驗合格作為菌種。3.菌液培養(yǎng)：將菌種2%比例加入營養(yǎng)肉湯，37℃18~20h。（時間長會產(chǎn)生內毒素）4.滅活：加入0.5%甲醛，37℃滅活20~24h5.滅活徹底檢驗6.鋁膠佐劑制備：將NaOH溶液緩慢加入Alcl3溶液中，當溶液由絮狀沉淀變?yōu)榫坏陌咨珪r，停止加熱。7.配苗：菌液：鋁膠=1:2充分混勻8.濃縮：棄去一定上清液，1/2上清液0.5%硫柳汞9.檢驗，安檢第4章病毒性組織疫苗生產(chǎn)技術第1節(jié)病毒性組織疫苗生產(chǎn)工藝流程1.健康動物或敏感禽胚選擇禽胚質量對于病毒和生物制品質量極為重要。目前理想的禽胚是無特定病原體（SPF）雞胚。據(jù)國家標準，SPF雞胚不應含有雞的特定的22種病原體，可適用于各種禽疫苗的生產(chǎn)。但由于SPF雞飼養(yǎng)條件嚴格，價格昂貴，商品化種蛋供不應求，故常用非免疫雞胚加以補充，這種蛋只用于滅活疫苗的生產(chǎn)，不能用于活疫苗生產(chǎn)。2.生產(chǎn)中毒制備生產(chǎn)毒種是由基礎種子擴繁制備而成。通常將基礎種子經(jīng)適當稀釋接種于動物或雞胚中，按規(guī)定時間和溫度培養(yǎng)，收獲含病毒組織或病毒液。經(jīng)毒種鑒定合格后，直接分裝或凍干，注明收獲日期、代次，作為生產(chǎn)用毒種。3.接種、病毒培養(yǎng)與收獲將合格的生產(chǎn)用毒種經(jīng)適當稀釋接種于動物或雞胚中，接種方法很多，可根據(jù)培養(yǎng)的病毒種類進行選擇。接種后的動物或雞胚，按各自規(guī)定時間和溫度進行培養(yǎng)，收獲含毒組織或病毒液，即為半成品。4.半成品檢驗半成品檢驗包括無菌檢驗和病毒含量測定。如果制備滅活疫苗，經(jīng)無菌檢驗和病毒含量測定合格后病毒液，還需用滅活劑進行滅活，滅活后需進行無菌檢驗。半成品必須無菌，才可以進行配苗。如不合格經(jīng)無害化處理。5.配苗與分裝將合格的半成品加入保護劑或佐劑，定量分裝，制成活疫苗或滅活疫苗，軋蓋、貼標、包裝后入待檢庫?；钜呙缤ǔ＜尤?%蔗糖牛奶保護劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成，低溫冷凍保存。滅活疫苗常用油乳佐劑，按比例與滅活毒液混勻乳化后直接分裝，低溫保存。第2節(jié)動物增殖病毒技術一、動物的選擇選擇動物的標準：對相應病毒有易感性高；健康，體重、年齡要基本一致，個體差別不宜過大；大動物應來源于非疫區(qū)，未接種過相應病毒疫苗的青壯年動物。二、接種方法（1）腦內接種法（2）皮內接種法（3）皮下接種法（4）靜脈接種法（5）腹腔接種法三、接種后動物觀察和收獲病毒動物接種后應每天觀察特征性變化，如體溫曲線、特征性臨床癥狀等。根據(jù)觀察選出接種后出現(xiàn)符合所要求的反應癥候的動物，按規(guī)定的時間，規(guī)定的方法剖殺，采取含毒組織或器官，各項檢驗合格后即可使用。第3節(jié)禽胚增殖病毒技術一、接種途徑（1）絨毛尿囊膜接種多用于嗜皮膚性病毒的增殖，如痘病毒、皰疹病毒等。選擇10~12日齡雞胚，劃出氣室，將卵氣室向上直立，經(jīng)消毒后于氣室中央打孔，用細針頭插入刺破殼膜，再退出氣室內接種0.2ml病毒液，將病毒滴在氣室的殼膜上，病毒即慢慢滲到氣室下面的絨尿膜上，封口后將雞胚直立培養(yǎng)。另一種方法需作人工氣室法，照檢后劃出氣室和胚位，將卵橫臥于蛋架上，胚胎位置向上，消毒后于氣室部位和胚位的卵殼上分別鉆一個小孔，用吸耳球緊貼氣室孔輕吸，雞胚面小孔處的絨毛膜下陷形成一個人工氣室，天然氣室消失。在人工氣室處接種0.1~0.2ml病毒液，封孔，人工氣室向上橫臥培養(yǎng)。（2）尿囊腔接種通常選9~11日齡雞胚，在氣室邊界上2~3mm處避開血管處，消毒后打孔，接種病毒0.1~0.2ml，封口后孵育。（3）卵黃囊接種法通常用5~8日齡雞胚，經(jīng)照檢后劃出氣室和胎位，在氣室中心殼上鉆一小孔，接種的針頭沿胚的縱軸插入約3cm，注入0.1~0.2ml（4）羊膜腔接種法二、病毒培養(yǎng)與病毒收獲技術（1）絨毛尿囊膜的收獲將整個蛋內容物倒掉，用滅菌鑷子撕下整個絨毛尿囊膜，放滅菌容器中備用。經(jīng)研磨制成病毒懸液。病毒在絨毛尿囊膜上可形成肉眼可見的痘斑。（2）尿囊液的收獲用鑷子壓住胚體，用滅菌吸管插入尿囊液腔，吸取尿囊液。（3）羊水的收獲收獲尿囊液后，用無菌鑷子夾起羊膜，用滅菌吸管或注射器刺入羊膜腔吸取羊水。（4）卵黃囊的收獲（5）胚胎的收獲用眼科鑷子撕破絨毛尿囊膜和羊膜，挑起雞胚，置滅菌容器中。三、病毒含量測定計術毒力或毒價單位基本上采用半數(shù)致死量（LD50）表示，而且LD50的計算應用了統(tǒng)計學方法，減少了個體差異的影響，因此結果比較正確。以感染發(fā)病作為指標的可用半數(shù)感染量（ID50）；以體溫反應作指標者，可用半數(shù)反應量（RD50）。用雞胚測定時，可用雞胚半數(shù)致死量（ELD50）或雞胚半數(shù)感染量（EID50）；在細胞培養(yǎng)上測定時，可用細胞半數(shù)感染量（TCID50）.LgEID50=高于50%死亡的稀釋倍數(shù)的對數(shù)×稀釋系數(shù)的對數(shù)+距離比距離比=（高于50%的死亡率—50%）/(高于50%的死亡率—低于50%的死亡率)四、影響禽胚增殖病毒的因素（1）種蛋質量種蛋質量直接與增殖病毒的質和量相關。最理想的禽胚是SPF種蛋，其次是非免疫種蛋。①病原微生物家禽有很多疫病及病原可垂直傳遞于雞胚，如白血病等。這些病原體既可污染制品本身，又可影響病毒在雞胚內的增殖。②母源抗體雞感染病原或使用抗原后會使其種蛋帶有母源抗體，從而影響病毒在雞胚內的增殖。③禽胚污染禽胚污染是危害病毒增殖最嚴重的因素之一，應嚴格防止。定期清掃消毒孵化間，保持室內空氣新鮮，無塵土飛揚。（2）孵化技術①溫度通常禽胚發(fā)育的適宜溫度為37~39.5℃，其適宜溫度應控制在37.8~38℃。鴨、鵝孵化溫度比雞胚高。此外，雞胚較能忍受低溫，短期降溫對雞胚發(fā)育還有促進作用，故禽胚孵化溫度應嚴格控制，寧低勿高。有些病毒對溫度比較敏感，如雞胚接種傳染性支氣管炎病毒后，應嚴格控制孵化溫度，不應超過37℃。②濕度濕度可控制孵化過程中蛋內水分的蒸發(fā)。雞胚孵化濕度標準為55%~65%③通風禽胚在發(fā)育過程中吸入氧氣，排出二氧化碳。因此需更換孵化機內空氣。④翻蛋在孵化過程中定期翻蛋，既可使胚胎受熱均勻，有利于發(fā)育；又可防止胚胎與蛋殼粘連。翻蛋還可改變蛋內部壓力，強制胚胎定期活動，促使胚胎發(fā)育。（3）接種技術不同病毒的增殖有不同的接種途徑，同一種病毒接種不同日齡禽胚獲得的病毒量也不同。如通常雞胚發(fā)育至13~15日齡，鴨胚發(fā)育至15~16日齡，尿囊液含量最高，平均6~8ml，羊水1~2ml。因此，由尿囊腔接種病毒時，應根據(jù)不同病毒培養(yǎng)所需要的時間選擇最恰當?shù)慕臃N胚齡，以獲得最高量病毒液。第5章病毒性細胞疫苗生產(chǎn)技術第1節(jié)病毒性細胞疫苗生產(chǎn)工藝流程1.細胞選擇與制備可根據(jù)培養(yǎng)的病毒種類選擇敏感細胞。選擇的依據(jù)是病毒的適應性強、毒價高；細胞來源方便、制備簡單、生命力強。2.生產(chǎn)毒種制備生產(chǎn)毒種是由基礎種子擴繁制備而成。通常將基礎種子按規(guī)定在易感動物、禽胚或敏感細胞繼代培養(yǎng)，經(jīng)檢驗合格后，作為生產(chǎn)用毒種。毒種繼代不超過3~5代。3.接毒、培養(yǎng)與收獲病毒將合格的生產(chǎn)用毒種接種于細胞單層，病毒接種一般按維持液的1%~10%量接入。科學接種量應以TCID50為依據(jù)。病毒接種細胞方法有異步接毒和同步接毒兩種。異步接毒是細胞長成單層后倒去生長液，將毒種37℃吸附1h后加入維持液。多數(shù)病毒采用該接毒方式。同步接毒是在制備細胞的同時或在制備細胞后4h內將病毒接入，主要用于病毒復制發(fā)生在細胞有絲分裂時期的病毒，如細小病毒等。接毒后選擇適宜溫度進行培養(yǎng)，大多數(shù)病毒增殖溫度為37℃。病毒在敏感細胞內增殖一般會產(chǎn)生細胞病變（CPE），當CPE達75%左右時收獲，反復凍融多次使病毒釋放，細胞培養(yǎng)物；或將細胞培養(yǎng)物離心除去細胞碎片，收集上清液，即為半成品，-20℃保存。4.半成品檢驗半成品檢驗包括無菌檢驗和病毒含量測定。5.配苗與分裝將合格的半成品加入保護劑或佐劑，制成活疫苗或滅活疫苗，入待檢庫。成品檢驗合格后，可以銷售使用。第2節(jié)細胞制備技術細胞體外培養(yǎng)已成為增殖病毒的主要方法。細胞增殖病毒技術的原理主要是為病毒易感的組織細胞提供良好的體外生長環(huán)境，使細胞適應并繁殖，從而為病毒增殖提供宿主進行復制。一、細胞類型（1）原代細胞是指由新鮮組織經(jīng)胰酶消化后，將細胞分散制備而成，如雞胚成纖維細胞（CEF）。原代細胞對病毒的檢測最為敏感，但制備和應用不方便。（2）次代細胞原代細胞長成單層后用胰酶從玻璃瓶壁上消化下來后，再作培養(yǎng)的細胞稱次代細胞，又稱繼代細胞。它保持原來細胞的理化特性不變，可在體外傳代幾代到幾十代，最后不可避免地衰老死亡。次代細胞形態(tài)和染色體與原代細胞基本相同。（3）傳代細胞是指從原代細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后得來的可以長期連續(xù)傳代的細胞。包括細胞株和細胞系。細胞系是指從原代細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后得來的一群不均一的細胞，可以長期連續(xù)傳代。細胞系又分為有限細胞系和無限細胞系，有限細胞系在體外傳代是有限的，無限細胞系能在體外無限傳代，其染色體數(shù)目及增殖特性均類似于惡性腫瘤細胞，且多來源于癌細胞。細胞株由細胞系克隆獲得的、具有特殊遺傳、生化性質或特異標記的細胞群，其生物學性質、生化性質呈均一性。細胞株又分有限細胞株和連續(xù)細胞株。有限細胞株的大多數(shù)染色體為二倍體，能連續(xù)傳很多代，但為有限生命；沒有腫瘤原。廣泛應用于病毒性生物制劑制備，安全可靠。連續(xù)細胞株可以連續(xù)傳代，如HeLa細胞株。二、細胞培養(yǎng)液的配制1.生理平衡鹽溶液（1）漢克氏液（2）歐氏液2.7.5%碳酸氫鈉溶液3.細胞分散液（1）0.25%胰蛋白酶溶液（2）EDTA-胰酶分散液4.指示劑（1）1%酚紅溶液（2）0.1%中性紅溶液5.營養(yǎng)液（1）0.5%乳漢液（2）0.5%乳歐液（3）合成培養(yǎng)液（4）3%谷氨酰胺溶液6.血清血清是細胞污染支原體、病毒等的重要來源。因此，對血清的質量控制尤為重要。血清必須無菌，不得有支原體污染，不得有牛黏膜病毒污染，血清中細菌內毒素含量應不高于10EU/ml7.抗生素溶液三、細胞制備方法1.原代細胞首先選取適當組織或器官，采用機械分散法如剪碎、擠壓等使之成為約1mm3小塊，然后用0.25%胰酶消化掉細胞間的組織蛋白，消化的時間長短與溫度、組織的來源及大小等有關，一般37℃消化10~50min，4℃消化需要12h左右。消化好的組織塊去掉胰酶經(jīng)吹打成分散的細胞，加上營養(yǎng)液進行培養(yǎng)。（1）雞胚成纖維細胞（CEF）制備（2）犢牛睪丸細胞（BTC）制備2.傳代細胞多采用EDTA-胰酶消化法，胰酶濃度為0.05%，其作用是消化細胞間的組織蛋白；EDTA濃度為0.01%，其作用是螯合維持細胞間的鈣鎂離子和細胞與細胞瓶間的鈣鎂離子，使細胞易脫落和分散。3.細胞凍存與復蘇細胞株與細胞系均需保存于液氮中（-196℃）。為保持細胞最大存活率，一般采用慢凍快融法。四、細胞培養(yǎng)法（1）靜置培養(yǎng)培養(yǎng)瓶和營養(yǎng)液都靜止不動，細胞沉降后貼附在培養(yǎng)瓶內面上生長分裂，3~5d形成細胞單層。靜置培養(yǎng)是最常用的細胞培養(yǎng)方法。（2）轉瓶培養(yǎng)將培養(yǎng)瓶放在轉瓶機上，使營養(yǎng)液和培養(yǎng)瓶作相對運動，轉瓶轉速一般為9~11r/h，使貼壁細胞不始終浸于培養(yǎng)液中，有利于細胞呼吸和物質交換。可在少量的培養(yǎng)液中培養(yǎng)大量的細胞來增殖病毒，多用于生物制品生產(chǎn)。（3）懸浮培養(yǎng)是通過振蕩或轉動裝置使細胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)瓶不動營養(yǎng)液運動。主要用于一些在振蕩或攪拌下能生長繁殖的細胞，如生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細胞。（4）微載體培養(yǎng)微載體是以細小的顆粒作為細胞載體，通過攪拌懸浮在培養(yǎng)液內，使細胞在載體表面繁殖成單層的一種細胞培養(yǎng)技術，兼有單層和懸浮細胞培養(yǎng)的優(yōu)點。五、細胞培養(yǎng)要素（1）培養(yǎng)液不同培養(yǎng)液適用于不同細胞，（2）血清血清中含有細胞生長的部分必需氨基酸，還有促進細胞生長和貼壁的成分。因此在細胞培養(yǎng)中必須加入一定量的血清方能獲得成功。目前國內多用犢牛血清，使用前56℃水浴滅活30min。細胞培養(yǎng)時血清含量為營養(yǎng)液的10%，接毒后含量不超過5%。（3）細胞接種量在適宜的培養(yǎng)條件下，需要有一定量活細胞才能生長繁殖，這是因為細胞在生長過程中分泌刺激細胞分裂的物質，若細胞量太少，這些物質分泌量少，細胞生長為單層的速度也慢，但細胞過多對細胞生長也不利。（4）PH細胞生長的PH值為6.6~7.8，但最適PH值為7.0~7.4。細胞代謝產(chǎn)生的各種酸性物質可使PH值下降，因此要使用緩沖能力強的培養(yǎng)液。（5）溫度細胞培養(yǎng)的最適溫度應與細胞來源的動物體溫一致，在此基礎上，如升高2~3℃，則對細胞產(chǎn)生不良影響，甚至在24h內死亡。六、細胞培養(yǎng)污染與控制細胞培養(yǎng)污染以微生物的污染最常見，化學物污染較少，而細胞交叉污染近幾年來隨細胞種類的增多也有發(fā)生。（1）細菌污染多見于消毒不徹底、操作不嚴格和環(huán)境污染所致，表現(xiàn)為營養(yǎng)液很快混濁和PH值下降，隨之細胞死亡脫落。（2）真菌污染也與消毒不徹底和操作不嚴格有關。在培養(yǎng)液中可見白色或黃色小點狀懸浮物，鏡檢時可見菌絲結構。（3）支原體污染支原體在細胞培養(yǎng)中最常見，不宜覺察，危害較大。目前細胞支原體污染率為50%~60%，主要來源于犢牛血清、實驗人員、細胞原材料及已污染的細胞。目前多用以下方法：①抗生素處理②41℃18h③加入特異性抗支原體高免血清等。這些方法在一定程度上能降低支原體在細胞培養(yǎng)中的滴度，但很難徹底清除。（4）病毒污染病毒污染是指細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)非目的病毒。其來源有組織帶毒和培養(yǎng)液帶毒。細胞一旦污染病毒，就很難排除。（5）膠原蟲污染在犢牛血清中，有時會發(fā)現(xiàn)一種新的對細胞培養(yǎng)有害的膠原蟲，一經(jīng)污染就難于消除。目前唯一的方法是將犢牛血清37℃培養(yǎng)1個月以上，然后高速離心取沉淀物鏡檢檢查膠原蟲。第3節(jié)細胞增殖病毒技術一、細胞的選擇病毒須在敏感的宿主細胞中增殖，宿主細胞一般選擇相應易感動物的組織細胞。通常病毒的細胞感染譜是通過試驗獲得的，同一病毒在不同敏感細胞增殖后其毒價不盡相同。二、病毒增殖指標與收獲細胞接種病毒后，在適宜溫度下培養(yǎng)，多數(shù)病毒在敏感細胞內增殖可引起細胞代謝等方面的變化，發(fā)生形態(tài)改變，即細胞病變，顯微鏡下主要表現(xiàn)為：①細胞圓縮②細胞聚合③細胞融合形成合胞體④輕微病變。有些病毒在細胞上增殖并不產(chǎn)生CPE，如豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒等。一般在CPE達75%左右時收獲細胞培養(yǎng)物，低溫冷凍保存。三、細胞培養(yǎng)病毒要素病毒在敏感細胞上增殖需要一定條件，只有在最佳條件下，病毒才能大量增殖，毒價才會最高。（1）血清細胞培養(yǎng)必須加一定量血清以維持細胞的生長。但是，血清中存在一些非特異性抑制因子，它們對某些病毒的生長和增殖有抑制作用，經(jīng)56℃30min不能被滅活。為了克服血清中非特異性抑制因子的作用，病毒維持液內血清含量一般不超過5%。目前已有無血清培養(yǎng)液可替代，以維持細胞活力并避免血清中某些物質對病毒增殖的抑制作用。（2）溫度病毒細胞培養(yǎng)的溫度多數(shù)為37℃，此溫度有利于病毒吸附和侵入細胞，如口蹄疫病毒于37℃可在3~5min內使90%的敏感細胞發(fā)生感染，而在25℃時需要20min，15℃以下則很少引起污染。但有些病毒的最適溫度或高于37℃或低于37℃。（3）PHPH值一般在7.2~7.4才能防止細胞過早老化，有利于病毒增殖。如果維持液PH下降過快或過低，也可用7.5%NaHCO3液調整。（4）接毒量接種量小，細胞不能完全發(fā)生感染，會影響毒價；接種量過大，會產(chǎn)生大量無感染性缺陷病毒，如水泡性口炎病毒。為獲得培養(yǎng)液中典型病毒和高度感染性，接種時必須用高稀釋度的病毒液，如應用高濃度的病毒液傳代，在第3~4代時會出現(xiàn)明顯的缺陷病毒，發(fā)生自我干擾現(xiàn)象，病毒滴度下降。（5）接毒方法應根據(jù)病毒特點選擇異步接毒和同步接毒，以獲得高效價病毒。（6）支原體污染問題支原體污染不僅消耗維持液的營養(yǎng)，從而影響細胞生長；同時，也可以影響病毒的增殖。第6章治療用生物制品生產(chǎn)技術第1節(jié)概述治療用生物制品是指用于治療動物傳染病的制品。一般是指利用微生物及其代謝產(chǎn)物等作為免疫原，經(jīng)反復多次注射同一動物體，所產(chǎn)生的一類高效價抗體，主要包括免疫血清、卵黃抗體和牛奶抗體等。免疫血清又稱高免血清或抗血清，根據(jù)免疫血清作用對象不同，可分為抗病血清和抗毒素兩類。1.作用機理治療用生物制品中都含有特異性的免疫球蛋白即抗體，輸入動物體后，動物即可被動地獲得抗體，從而形成免疫力，即所謂的人工被動免疫，因此可以在疫區(qū)對未發(fā)病動物進行緊急預防接種，一般不用于平時的預防接種。當動物已感染某種病原微生物發(fā)生傳染病時，注射大量抗病血清后，血清中的抗體可抑制動物體內的病原體繼續(xù)繁殖，并協(xié)助體內正常預防機能，消滅病原微生物，使病畜逐漸恢復健康。2.應用治療用生物制品用作緊急預防注射，通常是在已經(jīng)發(fā)生傳染病或受到傳染病威脅的情況下使用，其優(yōu)點是注射后立即產(chǎn)生免疫，疫苗是起不到這種作用的。第2節(jié)免疫血清生產(chǎn)工藝流程1.免疫動物的選擇制備免疫血清的動物有馬、牛、綿羊等。用同種動物生產(chǎn)的稱同源血清，用異種動物生產(chǎn)的稱異源血清。為了避免疫病的傳播，制備抗血清時，一般要求用異種動物，通常用馬和牛等大動物制備。生產(chǎn)中制備免疫血清用馬較多，因為血清滲出率較高，外觀顏色較好。由于動物存在個體免疫應答能力差異，所以選定動物應有一定的數(shù)量，一個批次應用多頭動物。2.免疫抗原的制備制造免疫血清的抗原，一般是用微生物或其毒素，或微生物的提取物等純化的完全抗原。（1）細菌免疫原制備基礎免疫用抗原多為疫苗或死菌，而加強免疫的抗原，一般選用毒力較強的菌株。多價抗病血清用的抗原，要求用多血清型菌株。菌種接種于最適生長的培養(yǎng)基，按常規(guī)方法進行培養(yǎng)。通?；罹乖栌眯迈r培養(yǎng)菌液，并按規(guī)定的濃度使用，培養(yǎng)時間較死菌抗原稍短為好，多用16~18h培養(yǎng)物，經(jīng)純粹檢查，證明無雜菌者，即可作為免疫抗原。為減少由培養(yǎng)基帶來的非特異性成分，可通過離心，棄上清，再將菌體制成一定濃度的細菌懸液，作為免疫原。（2）病毒免疫原制備以病毒為免疫原，須通過反復凍融或超聲裂解方法，將病毒從細胞中釋放出來，并盡可能地提高病毒滴度和免疫原性。如豬瘟血清，基礎免疫的抗原，可用豬瘟兔化弱毒疫苗；加強免疫抗原，則用豬瘟血毒或脾淋毒乳劑等強毒。豬接種豬瘟強毒發(fā)病后5~7d，當出現(xiàn)體溫升高及典型豬瘟癥狀時，由動脈放血，收集全部血清，經(jīng)無菌檢驗合格后即可作為抗原使用。接種豬瘟強毒的豬，除血中含有病毒外，脾臟和淋巴結也有大量的病毒，可采集并制成乳劑，作為抗原使用。（3）抗毒素血清免疫原制備免疫原可用類毒素、毒素或全培養(yǎng)物（活菌加毒素），但后兩者只有需要加強免疫刺激的情況下才應用，一般多用類毒素作免疫原。3.免疫程序免疫程序分為兩個階段，第一階段為基礎免疫，第二階段為加強免疫。從被免疫動物初次接受免疫原刺激，到產(chǎn)生少量抗體，這段時間在制造程序中稱為基礎免疫?；A免疫對第二階段的加強免疫有重要關系。（1）基礎免疫通常先用本病的疫苗按預防劑量作第1次免疫，經(jīng)1~3周再用較大劑量的滅活苗或活菌或特制的滅活抗原再免疫1~3次，即完成基礎免疫?；A免疫大多數(shù)1~3次即可，抗原無須過多過強，可為加強免疫產(chǎn)生有效地回憶應答打下基礎。（2）加強免疫亦稱高度免疫。一般在基礎免疫后2~4周開始進行。注射的抗原可采用滅活抗原，也可采用強毒微生物。微生物的毒力越強，一般免疫原性越好。免疫劑量逐漸增加，每次注射抗原間隔時間多為5~7d，加強的注射次數(shù)要視血清抗體效價而定。再用強毒微生物進行加強免疫時，必須在強毒動物舍或負壓隔離器中進行，并采取嚴格的控制措施，以防散毒。（3）免疫途徑免疫原注射途徑一般采用皮下或肌肉注射。如果免疫劑量大，應采用多部位注射法，尤其在應用油佐劑抗原時更應注意此點。4、血液采集與血清提取（1）采集次數(shù)和方法一般血清抗體的效價高峰在最后1次免疫后的7~10d。采血可以全放血或部分采血，即1次采集或多次采集，盡可能做到無菌操作。多次采血者，按體重每千克采血約10ml。全放血者，在最后1次高免之后的8~11d進行放血。放血前，動物應禁食24h，但需飲水以防止血脂過高。（2）血清的分離采血時一般不加抗凝劑，全血在室溫中自然凝固。待血液凝固后進行剝離或者將凝血切成若干小塊，并使其與容器剝離。先置于37℃1~2h，然后置于4℃冰箱過夜，次日離心收集血清。如果采集的血量較大時，可采用自然凝固加壓法。第3節(jié)卵黃抗體制備產(chǎn)蛋的禽類感染某些病原后，其血清和卵黃內均可產(chǎn)生相應的抗體，而且，卵黃中的抗體水平同樣也隨抗原的反復刺激而升高。因此，通過免疫注射產(chǎn)蛋雞，即可由其生產(chǎn)的蛋黃中提取相應的抗體，與高免血清一樣只限用于相應疫病的治療和緊急預防接種。該類制劑稱為卵黃抗體（IgY）。第7章診斷用生物制品生產(chǎn)技術利用微生物、寄生蟲及其代謝產(chǎn)物，或動物血液、組織制備的，專供診斷動物疫病、監(jiān)測動物免疫狀態(tài)及鑒定病原微生物的制品稱為診斷制劑或診斷液。第1節(jié)診斷抗原診斷抗原按性質分為顆粒性抗原、可溶性抗原兩種，顆粒性抗原主要用于凝集性反應，可溶性抗原可用于沉淀性反應極其他種類的診斷試驗。按照診斷試驗的種類可將診斷抗原分為凝集反應抗原、沉淀反應抗原、補體結合反應抗原、中和試驗抗原及變態(tài)反應抗原等。一、凝集反應抗原凝集反應抗原有直接凝集反應抗原和間接凝集反應抗原兩種。1.凝集反應抗原制備方法一般選擇符合要求的合格菌株，若型別不同，則根據(jù)需要選擇使用。接種于適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)。用含福爾馬林生理鹽水洗下培養(yǎng)基上的細菌，經(jīng)一定時間滅活，或用生理鹽水洗下后加熱滅活。將滅活的菌液過濾，除去大顆粒，離心棄上清，將沉淀用福爾馬林生理鹽水或石炭酸生理鹽水稀釋成每毫升含規(guī)定菌數(shù)。經(jīng)無菌檢驗、特異性檢驗和標化合格者即為濃菌液。間接凝集抗原制備使用的載體多為紅細胞。先取可溶性抗原，然后將抗原按量吸附于雙醛化的載體紅細胞上，使紅細胞致敏，即為間接凝集反應。2.常用的凝集反應抗原目前應用的有布氏桿菌凝集反應抗原、馬流產(chǎn)凝集反應抗原、豬萎縮性鼻炎凝集反應抗原、雞白痢傷寒多價平板凝集試驗抗原。二、沉淀反應抗原根據(jù)使用方法不同，沉淀反應抗原可分為環(huán)狀反應抗原、絮狀反應抗原、瓊脂擴散反應抗原和免疫電泳抗原等。1.沉淀抗原制備方法（1）細菌沉淀抗原制備選擇適宜菌種接種于合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)完畢后收集細菌培養(yǎng)物，滅菌、研磨成菌粉，按一定比例加入0.5%石炭酸生理鹽水浸泡，過濾后的濾液即為沉淀抗原。也可將收集的細菌培養(yǎng)物直接加入一定量的福爾馬林或酒精，靜置一定時間；或加入一定量醋酸，100℃水浴30min；或用裂解菌體等方法提取抗原，然后離心，收集上清，必要時濃縮即成為沉淀抗原。（2）病毒沉淀抗原制備選用適宜的動物組織或細胞培養(yǎng)病毒。收獲含毒高的動物組織制成勻漿，加入緩沖液或生理鹽水，裂解細胞，置于40℃浸毒。高速離心取上清，滅活后即成沉淀抗原。2.常用的沉淀反應抗原雞法氏囊病瓊脂擴散反應抗原、馬立克氏病瓊脂擴散反應抗原、標準炭疽抗原、小鵝瘟病沉淀抗原、山羊痘沉淀抗原等。三、補體結合反應抗原補體結合反應是一種廣泛應用的經(jīng)典性檢測抗原抗體的方法，補體結合反應抗原主要用于檢測相應抗體。1.補體結合反應抗原制備方法（1）細菌性抗原制備先將合格的菌株在培養(yǎng)基上大量培養(yǎng)，然后用0.5%石炭酸生理鹽水沖下，收集菌液，高壓滅菌或加溫水浴滅活，或加福爾馬林滅活，然后離心除去上清，將沉淀懸浮于0.5%石炭生理鹽水中，置冷暗處浸泡一段時間，收集上清即為抗原。（2）病毒性抗原制備病毒在細胞上大量增殖后，收獲病毒液，凍融3次，3000r/min離心30min，收集上清，經(jīng)適當處理即為抗原。2.常用的補體結合反應抗原鼻疽補體結合試驗抗原、布魯氏菌補體結合試驗抗原、馬傳染性貧血補體結合試驗抗原等。四、變態(tài)反應抗原制造細胞內寄生菌，如鼻祖桿菌、結核桿菌、布氏桿菌等，在感染過程中引起以細胞免疫為主的變態(tài)反應，即感染機體再次遇到同種病原菌或其代謝產(chǎn)物時出現(xiàn)一種具有高度特異性和敏感性的異常反應，據(jù)此，臨床上常用以診斷某些傳染病。引起變態(tài)反應的抗原物質又稱為變應原。1.變態(tài)反應抗原制備方法變態(tài)反應抗原的制備分為粗變態(tài)反應抗原和提純變態(tài)反應抗原兩種方法。（1）粗變態(tài)反應抗原制備選擇抗原性良好的病原菌，接種于甘油肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)2~4個月，收集培養(yǎng)物，然后高壓滅菌，過濾，濾液即為粗變態(tài)反應抗原。（2）提純變態(tài)反應抗原將菌種接種于合成培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2~4個月，高壓滅菌，過濾，在濾液中加入4%三氯醋酸，使蛋白質沉淀，去上清，把沉淀物懸浮于1%三氯醋酸中，離心洗滌3次，將沉淀物溶于PH值為4.0磷酸鹽緩沖液中，測定蛋白質含量，分裝備用或凍干保存。第2節(jié)診斷抗體又稱診斷血清，是一類是利用體外抗原抗體反應來診斷疫病或鑒別微生物的生物制劑。通常用抗原免疫動物制成，有些則需再經(jīng)吸收除去非特異性抗體成分后供診斷用。含有多型或多群抗體的稱為多價診斷血清，含有一種抗體的稱為單價診斷血清。單含有鞭毛抗體成分的稱為H血清。第3節(jié)標記抗體具有示蹤效應的化學物質與抗體結合后，仍保持其示蹤活性和與相應抗原特異結合能力，此種結合物稱為標記抗體。一、熒光素標記抗體將熒光素和抗體結合所制備的結合物稱為熒光素標記抗體。熒光素是一種染料，在紫外光、藍紫光等短光波照射下而被激活釋放出可見光，稱為熒光。二、酶標記抗體將酶和抗體結合所制備的結合物稱為酶標記抗體。酶標記抗體可與相應抗原形成酶標記的免疫復合物。結合在免疫復合物上的酶，在遇到相應的底物時，催化無色底物發(fā)生水解、氧化或還原，生成有色產(chǎn)物，從而出現(xiàn)顏色變化。三、放射性同位素標記抗體將某種放射性同位素與抗體標記起來，具有高靈敏度、精確性特異性。四、膠體金標記抗體將膠體金和抗體結合所制備的結合物稱為膠體金標記抗體。二檢驗篇第8章實驗動物與動物實驗技術第1節(jié)實驗動物概述1.實驗動物概念實驗動物是指由人工培育，來源清楚，遺傳背景明確，對其攜帶的微生物和寄生蟲實行監(jiān)控，用于生命科學研究、藥品與生物制品生產(chǎn)和檢定以及其他科學研究的動物。2.實驗動物分類實驗動物的分類方法很多，在獸用生物制品中通常根據(jù)微生物控制程度進行分類。（1）普通級動物（CV動物）是微生物和寄生蟲控制級別最低的實驗動物；要求不攜帶所規(guī)定的人畜共患病病原和動物烈性傳染病病原，以及人畜共患寄生蟲。（2）清潔級動物（CA動物）除普通級動物應排除的病原和寄生蟲外，不攜帶對動物危害大和對科學研究干擾大的病原和寄生蟲。清潔級動物原種群來自SPF動物或剖腹產(chǎn)動物，飼養(yǎng)在比較潔凈的環(huán)境中，使用的一切物品必須經(jīng)過滅菌處理。（3）無特定病原體動物（SPF動物）指體內外不存在特定的病原微生物和寄生蟲的動物。（4）無菌動物（GF動物）指體內外無任何微生物和寄生蟲的動物。（5）悉生動物（GA動物）又稱已知菌動物，指體內帶有已知微生物的動物。第2節(jié)實驗動物的飼養(yǎng)管理第3節(jié)動物實驗技術第9章活疫苗質量檢驗技術第1節(jié)活疫苗質量檢驗程序與方法細菌性活疫苗質量檢驗程序：1.物理性狀檢驗、真空度測定、剩余水分測定、純粹檢驗、安全檢驗、效力檢驗和活菌計數(shù)病毒性活疫苗質量檢驗程序：1.物理性狀檢驗、真空度測定、剩余水分測定、無菌檢驗、安全檢驗、效力檢驗、支原體檢驗、外原病毒檢驗和鑒別檢驗。1.檢驗用培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G），適用于厭氧性及需氧性細菌檢驗。酪胨瓊脂（G.A），固體培養(yǎng)基用于需氧性細菌檢驗。葡萄糖蛋白胨湯（G.P）培養(yǎng)基用于霉菌及腐生菌檢驗。第10章滅活疫苗質量檢驗技術第1節(jié)滅活疫苗質量檢驗程序與方法滅活疫苗質量檢驗程序：物理性狀檢驗、無菌檢驗、安全檢驗、效力檢驗、甲醛含量測定、硫柳汞含量測定和苯酚含量測定。第11章治療用生物制品質量檢驗技術第1節(jié)治療用生物制品質量檢驗程序與方法治療用生物制品質量檢驗程序：物理性狀檢驗、無菌檢驗、安全檢驗、效力檢驗、硫柳汞含量測定、苯酚含量測定支原體檢驗和外源病毒檢驗。治療用生物制品目前主要是免疫血清和卵黃抗體。免疫抗血清為淡黃色澄明液體，久置后，有少量沉淀；卵黃抗體為黃色膠體溶