免疫分型基礎(chǔ)介紹

近年來白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標準之一。早年曾用過的熒光顯微鏡或APAAP方法基本被廢棄。國際上公認的通用的方法是流式細胞術(shù)利用熒光素標記的單克隆抗體（McAb）作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的細胞膜和細胞漿或細胞核的免疫表型，由此了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。流式細胞儀診斷白血病的依據(jù)⑴FCM能快速，多參數(shù)，客觀的定性又定量測定細胞膜、漿、核的抗原表達⑵至今尚未發(fā)現(xiàn)白血病的特異抗原。⑶能用正常血細胞的單抗來進行免疫分型是基于白血病形成的分化阻斷學(xué)說。即白血病細胞基因異常，分化受阻于某階段形成不同?型的白血病。這群細胞充盈于骨髓。正常血細胞從多能干細胞分化、發(fā)育、成熟為功能細胞的過程中，細胞膜、細胞漿或胞核抗原的出現(xiàn)、表達增多與減少甚至消失與血細胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)，而且表現(xiàn)出與細胞系列及其分化程度相關(guān)的特異性。因此，這些抗原的表達與否可作為鑒別和分類血細胞的基礎(chǔ)。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，在形態(tài)上變化雖相當(dāng)大，但仍能表達正常血細胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達譜對白血病進行免疫分型。流式細胞儀診斷白血病的意義⑴骨髓血細胞是形態(tài)學(xué)分型的基礎(chǔ)，MIC形態(tài)學(xué)、細胞化學(xué)染色不能肯定細胞來源的白血病。②形態(tài)學(xué)為急性淋巴細胞白血?。ˋLL）或急性未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細胞系列抗原標記。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型對粒細胞和單核細胞白血病的鑒別尚有一定困難。⑤慢性淋巴細胞白血病。⑥微小殘留白血病。⑵臨床預(yù)測；可根據(jù)抗原的表達情況預(yù)測病情的預(yù)后：如白血病患者有CD7+與CD34+共表達，預(yù)后不好。⑶疾病監(jiān)測：可監(jiān)測病程的發(fā)展，療效，可進行微小殘留白血病的檢測。二、免疫分型常用的免疫標志及其意義1．白血病系列分化抗原T淋巴細胞白血?。篊D3、CD5、CD7。B淋巴細胞白血?。篊D10、CD19、CD22。NK淋巴細胞白血?。篊D16、CD56、CD57。髓系白血?。篊D13、CD14、CD33、MPO（髓過氧化物酶紅白血?。篏lyA（血型糖蛋白A。巨核細胞白血?。篊D41、CD42、CD61。2．白血病系列非特異性抗原CD34、HLA－DR為早期細胞抗原，無系列特異性，可與CD38聯(lián)合運用于免疫分型。一般而言，干/祖細胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始細胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚細胞（如早幼粒細胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。白血病分化階段抗原TCD4、CD8BCD10、Cyμ（胞漿μ（表面膜免疫球蛋白、CD38和CyIg（胞漿免疫球蛋白CD11C。白細胞共同抗原CD45為白細胞共同抗原，其表達量在淋巴細胞最高，單核細胞，成熟粒細胞，早期造血細胞次減弱。紅細胞（中，晚幼紅細胞，成熟紅細胞）不表達CD45。用SSC/CD45PerCP雙參數(shù)分析可十分McAbCD45進行三色免疫熒光染色，經(jīng)FSCSSCMcAbl-FITC、McAb2-PECD45PerCP五參數(shù)分析，可特異地分析原幼白血病細胞的免疫表型而不受成熟細胞的干擾。三、白血病及淋巴瘤免疫分型1．AMLMOSSCFSCCD45－SSCCD13CD116MPOCD13與CD33更靈敏。一般淋系標志陰性，但也可表達CD7或CD4－DR、CD34陽性，有些研究表明CD7與CD34共表達在AML且預(yù)后差。M1：流式上M1與M0相似不易區(qū)分，M1一般CD13＋、CD33＋、HLA－DR－，但CD34表達少于M0，可能表達部分CD15。M2：M0與M1的主要區(qū)別是成熟度增加，blasts減少，CD15較M1較顯著，CD34弱于M1，CD13CD33HLA－DR（。CD45－SSCblast連續(xù)細胞帶，CD45－SSCblasts比例。M3SSCCD45較成熟CHLA－DR或表達減少，CD34少M2CD13（＋CD2M4M5：兩型表型相似，但M4M5CD34（＋M0、M1，M4M5SSCCD45－SSC圖上，成熟CCD13、CD33、HLA－DRCD14CD15，CD33CD13，CD33（＋、CD13（－、CD34（－）M5M5CD56（＋。M6：M6較少見且特征不明顯，一般HLA－DR，CD34、CD13、CD33陽性，CD45－SSC圖顯示主要為紅系成份。M7AML1CD61（Gpa）和CD41（GpⅡb-Ⅲa）陽性，blastsEDTA存在下，測GpⅡb/ⅢaCD34以減少激活血小板的粘附。ALL：ALL25，ALL25ALLB，CD10CD10B，B，TB祖細胞型ALL：ALL65％～7055％～605090CD10＋，在幼兒只有少于50CD10＋，blastsFSCSSC很少，是FAB標準的L1或L2，2CD10CD24＋，CD34＋，CD20表達隨成熟度增加而增加，BBALLALL25CD19＋，，－DR＋，胞漿CD22＋，＋，CD20變化，CD34多為陰性，前BB祖型預(yù)后更差，這與E2A－PBX1融合蛋白，它的表型為CD19＋、CD10＋、CD9CD20表達，CD34－，確認此表型有助于診斷基因上不確定的病例。B細胞型ALL：BALLALL2％～5BALLBALLFSCSSCCD45－SSC圖上出現(xiàn)在淋巴和單核細胞區(qū)域，即FAB標準的L3，表型為CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（IGM）CD10sIgBALLBALLFAB－L3T－ALLFSCSSCCD45－SSC圖上可能出現(xiàn)在淋系未成熟細胞和髓系未成熟細胞CD2CD5CD7CD4/CD8CD3、TdTCD2、CD5、CD7、TdTCD2、CD5、CD7CD3＋CD4＋/CD3+CD8+,TdTTCD7胞漿CD3T，TT合。雜合型白血?。?2)或（11q23，現(xiàn)在雜合型的誤診率很高。最常導(dǎo)致誤診的原因是在分析中未能排除非白細胞，過度強BT。CML：CD45－SSC圖上除了髓系細胞占主導(dǎo)外，只顯示一個正常骨髓像，CML1急變期?型的診斷具有極高價值。直接影響到治療效果。急變期CML主要表現(xiàn)為髓系，偶為淋系，髓性急變可表現(xiàn)出多種形態(tài)包括未分化細胞。淋性急變具典型形態(tài)特征，為CD10＋B祖細胞ALL極少有T細胞型ALL。CLL：CLL細胞主要為較正常淋巴細胞稍大的小淋巴細胞。免疫分型主要為：SIgMSIgD弱表達，BCD20CD43CD79a與CD5共表達，表達使得CLLMU（CLL＋，MCL：CD23－，CD10－、CD23－、CD11cCD25、CD20CLLCLLtrisony1214q13q11qtrisony12SIg、CD20表達量高度相關(guān)，與CD23FMC7相關(guān)。B（B－DLLCLLB－DLLCLLBDLLCD5－，CD22。MU病人平均生存率不超過5CLLCLLCD5＋BSigCLLCD22－。CLLFCCSig、CD5－、CD10＋、CD23B系表型：對于診斷為CLL，CD5、FMC7、CD22與SIg，CD20DLLMCCCLL?型（trisomy12）因為它們危險性更大。四、流式細胞儀免疫分型實驗1脊液、皮膚、黏膜（內(nèi)窺鏡活檢物、細針穿刺物等等。⑵抗凝劑的選擇：外周血標本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標本做白細胞計數(shù)和流式分析，則應(yīng)用EDTA抗凝。骨髓穿刺可用肝素。其他體液用EDTA、ACD或肝素均可，但保存的樣本活性可能會降低，EDTA的優(yōu)點是成熟髓性細胞貼壁造成的損失及血小板聚集較小，但細胞散射光特征丟失較肝素標本快；由于相對大量的ACD會通過改變pH而影響骨髓細胞活性問題，通常不推薦用ACD做骨髓穿刺抗凝劑。⑶樣本的保存：樣本的完整性和細胞活性與抗凝劑的選擇、運輸、保存和溫度息息相關(guān)。①理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采集后立刻進行處理和染色。②短期保存（1小時或更短）應(yīng)在室溫(18-22℃);③長時間保存血或骨髓標本室溫即可，有些樣本可能4℃為佳。④標本保存的時間上限取決于標本類型及其保存條件。⑤肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小時；⑥EDTA12－24⑦ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小時，但?quot性和染色方式，采用之前一定要進行新鮮標本的對照和驗證實驗。樣本制備⑴單細胞懸液的制備①血和骨髓：天然單細胞懸液。當(dāng)有血凝塊時，應(yīng)用50um尼龍網(wǎng)過濾，同時進行細胞計數(shù)和血涂片以判斷靶細胞群體是否仍然存在。②組織塊：機械分離和酶分離兩種方法。分離不僅是要獲得最大產(chǎn)量的單細胞懸液，還要盡量保證細胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性。大多數(shù)淋巴樣組織可用輕柔的機械方法快速分離，并保持收獲細胞的相對完整。某些組織由于細胞間連接緊密，需在機械分離的基礎(chǔ)上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。骨髓標本亦可能因骨細胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要確認酶的使用沒有改變、減弱靶抗原的表達，細胞活性沒有顯著降低。⑵分離靶細胞群體樣本的任何處理方式都可能導(dǎo)致靶細胞群體的丟失。所以應(yīng)盡可能使用最接近原始標本狀態(tài)的處理過程。去除紅細胞是流式分析要求的至少步驟。兩種方法：性去除成熟紅細胞而最小程度的影響其他細胞的特點。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認：抗②度梯度離心：白血病細胞回收較好并可能得到富集，同時去除死細胞。但費時，白血病細胞的相對頻率較難分析，某些重要細胞群體可能選擇性丟失。根據(jù)密度梯度原理，若白血病細胞沒有與淋巴細胞相似的浮力密度即可能丟失。所以用此方法時應(yīng)檢查各層細胞特性以防止靶細胞的丟失。⑶估細胞懸液①樣本外觀：有嚴重溶血和血凝塊的標本可能會有白細胞的損壞以及細胞?群的丟失或改變，應(yīng)棄用。②細胞丟失和分布：確認細胞形態(tài)和原始標本相似。密度梯度離心之后更應(yīng)檢查細胞分布。可做血涂片判斷。③細胞計數(shù)和濃度調(diào)整：廠家推薦的抗體濃度通常是假定靶細胞數(shù)量在正常范圍內(nèi)(500,000-1,000,000／testAb)。白細胞數(shù)量上的顯著變化會帶來染色模式的變化。而白血病標本常常有異常的白細胞數(shù)量，骨髓標本也可能被外周血稀釋，這些標本的細胞性可能有極大的變異。因此有些標本沒有足夠的細胞做流式分析，有些則由于細胞量大，正常濃度下的抗體相對不足，不能飽和所有的結(jié)合位點，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。所以染色前的細胞計數(shù)非常必要。推薦方法：WBC<1000/uL: 用200uL全血并調(diào)整相應(yīng)溶血劑用量；WBC:1000-10000/uL, 用100uL全血并用溶血劑標準量；WBC:10000-20000/uL, 用50uL全血并調(diào)整相應(yīng)溶血劑用量；WBC>20000/uL ，用稀釋至(2)(3范圍內(nèi)。骨髓標本常常要在PBS1:10稀釋后計數(shù)。應(yīng)該指出由于不同的標本中不同系列的細胞比例不同調(diào)整細胞總數(shù)不一定合適每一個系列特異的抗體實驗室若選擇不同于廠家推薦的方（如自己稀釋抗體抗體一定需要進行測試以得到抗體和細胞的最佳比率。④細胞活性：死細胞對許多抗體有非特異性染色，有些抗原同時存在于胞膜和胞漿，這就使樣本的細胞活ǔＳ辛街鄭、7-AAD或EMA（ethidiummonoacide?；罴毎麑⒕苋具@些染料。此方法的優(yōu)勢是細胞表面標志和活性分析可同時進行，通過設(shè)門即可得到活細胞的染色特性。尤其適7AAD，以保證區(qū)分的是固定前細胞的死活狀態(tài)。但隨著時間延長，7AAD12EMA。EMA與死細胞DNA證了長時間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。二是手工檢測：使用Trypanblue染料。⑷細胞染色所以在細胞表面抗原檢測時應(yīng)特別注意保持細胞膜的完整以保證檢測的特異性。例如免疫球蛋白重鏈在細胞內(nèi)和表面的存在有著不同的意義，檢測表面標記必須是未固定的活細胞。TdT,MPO,cCD3,cCD22,以及胞漿內(nèi)IgDNA染色。固定劑和通透劑都可能對細胞和參數(shù)有不同的多重影響，應(yīng)根據(jù)情況選擇。每一步染色對熒光素的選擇和抗體的選擇都很重要。如，用于表面標記的熒光素應(yīng)不被隨后的固定和通透步驟所影響，而對于胞內(nèi)染色，所用的熒光素應(yīng)足夠小能穿透到胞膜內(nèi)。抗體組合的確定：選擇抗體組合的技術(shù)性考慮：基于血液腫瘤的復(fù)雜性，提供一個通用的抗體選擇策略是不現(xiàn)實的。國際上迄今也沒有一致性的抗體組合。應(yīng)該意識到，沒有一個神奇的既小又功能齊全的抗體組合可以解決所有的臨床相關(guān)答案。一個局限性的小組合也可能影響對樣本的正確評估和分類。確認細胞異常的能力與所用抗體的數(shù)量直接成正比。⑴選擇抗體組合的基本原則如下：測的靈敏度越高。應(yīng)該指出，由于腫瘤細胞常常缺少細胞的正常標記或表達異常，所以特異性抗體一定程度上的重復(fù)選擇有時是必要的。。如現(xiàn)在用CD45抗體來區(qū)分正常和幼稚細胞，此方法尤其在幼稚細胞含量少時更顯優(yōu)勢。3）熒光強度和表位密度應(yīng)同時考慮。對表達少的抗原表位應(yīng)盡可能選擇強度強的熒光素。必要時用活性檢測排除死細胞較強的非特異性染色。國外統(tǒng)計，約70%48%有活性檢測結(jié)果。CD編號的不⑵常用的方案考慮：大而全的抗體組合：全面了解抗原表達，無需額外染色，省時但費用高。先用篩查試劑了解樣本的一般情況，再根據(jù)所得信息采用第二線特異性更高的抗體組。經(jīng)濟，但費時，也需要正確的抗體選擇的策略性決定。但考慮到所用時間和設(shè)備費用，只有約30%國外實驗室采用此法。基于臨床或形態(tài)學(xué)的資料，選用有目標性的抗體組合以確認可疑的診斷或分類。樣本獲取1-2x1045x104個細胞。惡性細胞常有較寬的大小和粒度范圍，獲取時最好收集無門的數(shù)據(jù)以保留所有未知異常細胞群體的所有特256道的分辨率。無論選擇對數(shù)或線性放大都要以保證異常細胞都能被檢測到。數(shù)據(jù)分析只有通過多參數(shù)分析，才能最大程度地區(qū)分異質(zhì)的樣本中的正常和異常細胞。多參數(shù)分析意味著綜合細胞的光散射和多色熒光特征。最少的要求應(yīng)是42析步驟越復(fù)雜，流式免疫分型的靈敏度越高。⑴分析技術(shù)：數(shù)據(jù)的分析方式隨樣本的特性、抗體組合及臨床情況的不同而變化。但總的原則是要用多參FSCvs.SSC,FLvs.FL,Scatterv光參數(shù)的綜合分析常常能提供有效的信息。

散射光與熒⑵分析步驟：首先分析所有細胞的抗原表達情況，鑒別出正常細胞和異常細胞群體，正常細胞的表現(xiàn)可以作為整個實驗染色過程的內(nèi)部參照，提供實驗一致性與否的客觀證據(jù)，異常細胞則通過進一步設(shè)門分析確定表型特點。⑶設(shè)門：即選擇特殊的細胞群體分析其各個參數(shù)的表現(xiàn)，是一個基本的分析技巧。把分析局限在門內(nèi)的細胞群體的前提是門內(nèi)的細胞代表所有感興趣的細胞，而且沒有其他細胞的污染。一般來說，不同疾病的FSCvs.SSCL&LSSCBB設(shè)門來看抗κ鏈和抗λ鏈的表現(xiàn)TT外，通過細胞特異