免疫分型基礎(chǔ)介紹

近年來白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。早年曾用過的熒光顯微鏡或APAAP方法基本被廢棄。國(guó)際上公認(rèn)的通用的方法是流式細(xì)胞術(shù)利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿或細(xì)胞核的免疫表型，由此了解被測(cè)白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。流式細(xì)胞儀診斷白血病的依據(jù)⑴FCM能快速，多參數(shù)，客觀的定性又定量測(cè)定細(xì)胞膜、漿、核的抗原表達(dá)⑵至今尚未發(fā)現(xiàn)白血病的特異抗原。⑶能用正常血細(xì)胞的單抗來進(jìn)行免疫分型是基于白血病形成的分化阻斷學(xué)說。即白血病細(xì)胞基因異常，分化受阻于某階段形成不同?型的白血病。這群細(xì)胞充盈于骨髓。正常血細(xì)胞從多能干細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟為功能細(xì)胞的過程中，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或胞核抗原的出現(xiàn)、表達(dá)增多與減少甚至消失與血細(xì)胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)，而且表現(xiàn)出與細(xì)胞系列及其分化程度相關(guān)的特異性。因此，這些抗原的表達(dá)與否可作為鑒別和分類血細(xì)胞的基礎(chǔ)。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，在形態(tài)上變化雖相當(dāng)大，但仍能表達(dá)正常血細(xì)胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達(dá)譜對(duì)白血病進(jìn)行免疫分型。流式細(xì)胞儀診斷白血病的意義⑴骨髓血細(xì)胞是形態(tài)學(xué)分型的基礎(chǔ)，MIC形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來源的白血病。②形態(tài)學(xué)為急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）或急性未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型對(duì)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞白血病的鑒別尚有一定困難。⑤慢性淋巴細(xì)胞白血病。⑥微小殘留白血病。⑵臨床預(yù)測(cè)；可根據(jù)抗原的表達(dá)情況預(yù)測(cè)病情的預(yù)后：如白血病患者有CD7+與CD34+共表達(dá)，預(yù)后不好。⑶疾病監(jiān)測(cè)：可監(jiān)測(cè)病程的發(fā)展，療效，可進(jìn)行微小殘留白血病的檢測(cè)。二、免疫分型常用的免疫標(biāo)志及其意義1．白血病系列分化抗原T淋巴細(xì)胞白血病：CD3、CD5、CD7。B淋巴細(xì)胞白血?。篊D10、CD19、CD22。NK淋巴細(xì)胞白血?。篊D16、CD56、CD57。髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓過氧化物酶紅白血病：GlyA（血型糖蛋白A。巨核細(xì)胞白血?。篊D41、CD42、CD61。2．白血病系列非特異性抗原CD34、HLA－DR為早期細(xì)胞抗原，無系列特異性，可與CD38聯(lián)合運(yùn)用于免疫分型。一般而言，干/祖細(xì)胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始細(xì)胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚細(xì)胞（如早幼粒細(xì)胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。白血病分化階段抗原TCD4、CD8BCD10、Cyμ（胞漿μ（表面膜免疫球蛋白、CD38和CyIg（胞漿免疫球蛋白CD11C。白細(xì)胞共同抗原CD45為白細(xì)胞共同抗原，其表達(dá)量在淋巴細(xì)胞最高，單核細(xì)胞，成熟粒細(xì)胞，早期造血細(xì)胞次減弱。紅細(xì)胞（中，晚幼紅細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞）不表達(dá)CD45。用SSC/CD45PerCP雙參數(shù)分析可十分McAbCD45進(jìn)行三色免疫熒光染色，經(jīng)FSCSSCMcAbl-FITC、McAb2-PECD45PerCP五參數(shù)分析，可特異地分析原幼白血病細(xì)胞的免疫表型而不受成熟細(xì)胞的干擾。三、白血病及淋巴瘤免疫分型1．AMLMOSSCFSCCD45－SSCCD13CD116MPOCD13與CD33更靈敏。一般淋系標(biāo)志陰性，但也可表達(dá)CD7或CD4－DR、CD34陽(yáng)性，有些研究表明CD7與CD34共表達(dá)在AML且預(yù)后差。M1：流式上M1與M0相似不易區(qū)分，M1一般CD13＋、CD33＋、HLA－DR－，但CD34表達(dá)少于M0，可能表達(dá)部分CD15。M2：M0與M1的主要區(qū)別是成熟度增加，blasts減少，CD15較M1較顯著，CD34弱于M1，CD13CD33HLA－DR（。CD45－SSCblast連續(xù)細(xì)胞帶，CD45－SSCblasts比例。M3SSCCD45較成熟CHLA－DR或表達(dá)減少，CD34少M(fèi)2CD13（＋CD2M4M5：兩型表型相似，但M4M5CD34（＋M0、M1，M4M5SSCCD45－SSC圖上，成熟CCD13、CD33、HLA－DRCD14CD15，CD33CD13，CD33（＋、CD13（－、CD34（－）M5M5CD56（＋。M6：M6較少見且特征不明顯，一般HLA－DR，CD34、CD13、CD33陽(yáng)性，CD45－SSC圖顯示主要為紅系成份。M7AML1CD61（Gpa）和CD41（GpⅡb-Ⅲa）陽(yáng)性，blastsEDTA存在下，測(cè)GpⅡb/ⅢaCD34以減少激活血小板的粘附。ALL：ALL25，ALL25ALLB，CD10CD10B，B，TB祖細(xì)胞型ALL：ALL65％～7055％～605090CD10＋，在幼兒只有少于50CD10＋，blastsFSCSSC很少，是FAB標(biāo)準(zhǔn)的L1或L2，2CD10CD24＋，CD34＋，CD20表達(dá)隨成熟度增加而增加，BBALLALL25CD19＋，，－DR＋，胞漿CD22＋，＋，CD20變化，CD34多為陰性，前BB祖型預(yù)后更差，這與E2A－PBX1融合蛋白，它的表型為CD19＋、CD10＋、CD9CD20表達(dá)，CD34－，確認(rèn)此表型有助于診斷基因上不確定的病例。B細(xì)胞型ALL：BALLALL2％～5BALLBALLFSCSSCCD45－SSC圖上出現(xiàn)在淋巴和單核細(xì)胞區(qū)域，即FAB標(biāo)準(zhǔn)的L3，表型為CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（IGM）CD10sIgBALLBALLFAB－L3T－ALLFSCSSCCD45－SSC圖上可能出現(xiàn)在淋系未成熟細(xì)胞和髓系未成熟細(xì)胞CD2CD5CD7CD4/CD8CD3、TdTCD2、CD5、CD7、TdTCD2、CD5、CD7CD3＋CD4＋/CD3+CD8+,TdTTCD7胞漿CD3T，TT合。雜合型白血?。?2)或（11q23，現(xiàn)在雜合型的誤診率很高。最常導(dǎo)致誤診的原因是在分析中未能排除非白細(xì)胞，過度強(qiáng)BT。CML：CD45－SSC圖上除了髓系細(xì)胞占主導(dǎo)外，只顯示一個(gè)正常骨髓像，CML1急變期?型的診斷具有極高價(jià)值。直接影響到治療效果。急變期CML主要表現(xiàn)為髓系，偶為淋系，髓性急變可表現(xiàn)出多種形態(tài)包括未分化細(xì)胞。淋性急變具典型形態(tài)特征，為CD10＋B祖細(xì)胞ALL極少有T細(xì)胞型ALL。CLL：CLL細(xì)胞主要為較正常淋巴細(xì)胞稍大的小淋巴細(xì)胞。免疫分型主要為：SIgMSIgD弱表達(dá)，BCD20CD43CD79a與CD5共表達(dá)，表達(dá)使得CLLMU（CLL＋，MCL：CD23－，CD10－、CD23－、CD11cCD25、CD20CLLCLLtrisony1214q13q11qtrisony12SIg、CD20表達(dá)量高度相關(guān)，與CD23FMC7相關(guān)。B（B－DLLCLLB－DLLCLLBDLLCD5－，CD22。MU病人平均生存率不超過5CLLCLLCD5＋BSigCLLCD22－。CLLFCCSig、CD5－、CD10＋、CD23B系表型：對(duì)于診斷為CLL，CD5、FMC7、CD22與SIg，CD20DLLMCCCLL?型（trisomy12）因?yàn)樗鼈兾ｋU(xiǎn)性更大。四、流式細(xì)胞儀免疫分型實(shí)驗(yàn)1脊液、皮膚、黏膜（內(nèi)窺鏡活檢物、細(xì)針穿刺物等等。⑵抗凝劑的選擇：外周血標(biāo)本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標(biāo)本做白細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式分析，則應(yīng)用EDTA抗凝。骨髓穿刺可用肝素。其他體液用EDTA、ACD或肝素均可，但保存的樣本活性可能會(huì)降低，EDTA的優(yōu)點(diǎn)是成熟髓性細(xì)胞貼壁造成的損失及血小板聚集較小，但細(xì)胞散射光特征丟失較肝素標(biāo)本快；由于相對(duì)大量的ACD會(huì)通過改變pH而影響骨髓細(xì)胞活性問題，通常不推薦用ACD做骨髓穿刺抗凝劑。⑶樣本的保存：樣本的完整性和細(xì)胞活性與抗凝劑的選擇、運(yùn)輸、保存和溫度息息相關(guān)。①理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采集后立刻進(jìn)行處理和染色。②短期保存（1小時(shí)或更短）應(yīng)在室溫(18-22℃);③長(zhǎng)時(shí)間保存血或骨髓標(biāo)本室溫即可，有些樣本可能4℃為佳。④標(biāo)本保存的時(shí)間上限取決于標(biāo)本類型及其保存條件。⑤肝素抗凝的血和骨髓通?？杀４嬷?8-72小時(shí)；⑥EDTA12－24⑦ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小時(shí)，但?quot性和染色方式，采用之前一定要進(jìn)行新鮮標(biāo)本的對(duì)照和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。樣本制備⑴單細(xì)胞懸液的制備①血和骨髓：天然單細(xì)胞懸液。當(dāng)有血凝塊時(shí)，應(yīng)用50um尼龍網(wǎng)過濾，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和血涂片以判斷靶細(xì)胞群體是否仍然存在。②組織塊：機(jī)械分離和酶分離兩種方法。分離不僅是要獲得最大產(chǎn)量的單細(xì)胞懸液，還要盡量保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性。大多數(shù)淋巴樣組織可用輕柔的機(jī)械方法快速分離，并保持收獲細(xì)胞的相對(duì)完整。某些組織由于細(xì)胞間連接緊密，需在機(jī)械分離的基礎(chǔ)上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。骨髓標(biāo)本亦可能因骨細(xì)胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要確認(rèn)酶的使用沒有改變、減弱靶抗原的表達(dá)，細(xì)胞活性沒有顯著降低。⑵分離靶細(xì)胞群體樣本的任何處理方式都可能導(dǎo)致靶細(xì)胞群體的丟失。所以應(yīng)盡可能使用最接近原始標(biāo)本狀態(tài)的處理過程。去除紅細(xì)胞是流式分析要求的至少步驟。兩種方法：性去除成熟紅細(xì)胞而最小程度的影響其他細(xì)胞的特點(diǎn)。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認(rèn)：抗②度梯度離心：白血病細(xì)胞回收較好并可能得到富集，同時(shí)去除死細(xì)胞。但費(fèi)時(shí)，白血病細(xì)胞的相對(duì)頻率較難分析，某些重要細(xì)胞群體可能選擇性丟失。根據(jù)密度梯度原理，若白血病細(xì)胞沒有與淋巴細(xì)胞相似的浮力密度即可能丟失。所以用此方法時(shí)應(yīng)檢查各層細(xì)胞特性以防止靶細(xì)胞的丟失。⑶估細(xì)胞懸液①樣本外觀：有嚴(yán)重溶血和血凝塊的標(biāo)本可能會(huì)有白細(xì)胞的損壞以及細(xì)胞?群的丟失或改變，應(yīng)棄用。②細(xì)胞丟失和分布：確認(rèn)細(xì)胞形態(tài)和原始標(biāo)本相似。密度梯度離心之后更應(yīng)檢查細(xì)胞分布?？勺鲅科袛?。③細(xì)胞計(jì)數(shù)和濃度調(diào)整：廠家推薦的抗體濃度通常是假定靶細(xì)胞數(shù)量在正常范圍內(nèi)(500,000-1,000,000／testAb)。白細(xì)胞數(shù)量上的顯著變化會(huì)帶來染色模式的變化。而白血病標(biāo)本常常有異常的白細(xì)胞數(shù)量，骨髓標(biāo)本也可能被外周血稀釋，這些標(biāo)本的細(xì)胞性可能有極大的變異。因此有些標(biāo)本沒有足夠的細(xì)胞做流式分析，有些則由于細(xì)胞量大，正常濃度下的抗體相對(duì)不足，不能飽和所有的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。所以染色前的細(xì)胞計(jì)數(shù)非常必要。推薦方法：WBC<1000/uL: 用200uL全血并調(diào)整相應(yīng)溶血?jiǎng)┯昧浚籛BC:1000-10000/uL, 用100uL全血并用溶血?jiǎng)?biāo)準(zhǔn)量；WBC:10000-20000/uL, 用50uL全血并調(diào)整相應(yīng)溶血?jiǎng)┯昧浚籛BC>20000/uL ，用稀釋至(2)(3范圍內(nèi)。骨髓標(biāo)本常常要在PBS1:10稀釋后計(jì)數(shù)。應(yīng)該指出由于不同的標(biāo)本中不同系列的細(xì)胞比例不同調(diào)整細(xì)胞總數(shù)不一定合適每一個(gè)系列特異的抗體實(shí)驗(yàn)室若選擇不同于廠家推薦的方（如自己稀釋抗體抗體一定需要進(jìn)行測(cè)試以得到抗體和細(xì)胞的最佳比率。④細(xì)胞活性：死細(xì)胞對(duì)許多抗體有非特異性染色，有些抗原同時(shí)存在于胞膜和胞漿，這就使樣本的細(xì)胞活ǔＳ辛街鄭、7-AAD或EMA（ethidiummonoacide。活細(xì)胞將拒染這些染料。此方法的優(yōu)勢(shì)是細(xì)胞表面標(biāo)志和活性分析可同時(shí)進(jìn)行，通過設(shè)門即可得到活細(xì)胞的染色特性。尤其適7AAD，以保證區(qū)分的是固定前細(xì)胞的死活狀態(tài)。但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，7AAD12EMA。EMA與死細(xì)胞DNA證了長(zhǎng)時(shí)間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。二是手工檢測(cè)：使用Trypanblue染料。⑷細(xì)胞染色所以在細(xì)胞表面抗原檢測(cè)時(shí)應(yīng)特別注意保持細(xì)胞膜的完整以保證檢測(cè)的特異性。例如免疫球蛋白重鏈在細(xì)胞內(nèi)和表面的存在有著不同的意義，檢測(cè)表面標(biāo)記必須是未固定的活細(xì)胞。TdT,MPO,cCD3,cCD22,以及胞漿內(nèi)IgDNA染色。固定劑和通透劑都可能對(duì)細(xì)胞和參數(shù)有不同的多重影響，應(yīng)根據(jù)情況選擇。每一步染色對(duì)熒光素的選擇和抗體的選擇都很重要。如，用于表面標(biāo)記的熒光素應(yīng)不被隨后的固定和通透步驟所影響，而對(duì)于胞內(nèi)染色，所用的熒光素應(yīng)足夠小能穿透到胞膜內(nèi)?？贵w組合的確定：選擇抗體組合的技術(shù)性考慮：基于血液腫瘤的復(fù)雜性，提供一個(gè)通用的抗體選擇策略是不現(xiàn)實(shí)的。國(guó)際上迄今也沒有一致性的抗體組合。應(yīng)該意識(shí)到，沒有一個(gè)神奇的既小又功能齊全的抗體組合可以解決所有的臨床相關(guān)答案。一個(gè)局限性的小組合也可能影響對(duì)樣本的正確評(píng)估和分類。確認(rèn)細(xì)胞異常的能力與所用抗體的數(shù)量直接成正比。⑴選擇抗體組合的基本原則如下：測(cè)的靈敏度越高。應(yīng)該指出，由于腫瘤細(xì)胞常常缺少細(xì)胞的正常標(biāo)記或表達(dá)異常，所以特異性抗體一定程度上的重復(fù)選擇有時(shí)是必要的。。如現(xiàn)在用CD45抗體來區(qū)分正常和幼稚細(xì)胞，此方法尤其在幼稚細(xì)胞含量少時(shí)更顯優(yōu)勢(shì)。3）熒光強(qiáng)度和表位密度應(yīng)同時(shí)考慮。對(duì)表達(dá)少的抗原表位應(yīng)盡可能選擇強(qiáng)度強(qiáng)的熒光素。必要時(shí)用活性檢測(cè)排除死細(xì)胞較強(qiáng)的非特異性染色。國(guó)外統(tǒng)計(jì)，約70%48%有活性檢測(cè)結(jié)果。CD編號(hào)的不⑵常用的方案考慮：大而全的抗體組合：全面了解抗原表達(dá)，無需額外染色，省時(shí)但費(fèi)用高。先用篩查試劑了解樣本的一般情況，再根據(jù)所得信息采用第二線特異性更高的抗體組。經(jīng)濟(jì)，但費(fèi)時(shí)，也需要正確的抗體選擇的策略性決定。但考慮到所用時(shí)間和設(shè)備費(fèi)用，只有約30%國(guó)外實(shí)驗(yàn)室采用此法。基于臨床或形態(tài)學(xué)的資料，選用有目標(biāo)性的抗體組合以確認(rèn)可疑的診斷或分類。樣本獲取1-2x1045x104個(gè)細(xì)胞。惡性細(xì)胞常有較寬的大小和粒度范圍，獲取時(shí)最好收集無門的數(shù)據(jù)以保留所有未知異常細(xì)胞群體的所有特256道的分辨率。無論選擇對(duì)數(shù)或線性放大都要以保證異常細(xì)胞都能被檢測(cè)到。數(shù)據(jù)分析只有通過多參數(shù)分析，才能最大程度地區(qū)分異質(zhì)的樣本中的正常和異常細(xì)胞。多參數(shù)分析意味著綜合細(xì)胞的光散射和多色熒光特征。最少的要求應(yīng)是42析步驟越復(fù)雜，流式免疫分型的靈敏度越高。⑴分析技術(shù)：數(shù)據(jù)的分析方式隨樣本的特性、抗體組合及臨床情況的不同而變化。但總的原則是要用多參FSCvs.SSC,FLvs.FL,Scatterv光參數(shù)的綜合分析常常能提供有效的信息。

散射光與熒⑵分析步驟：首先分析所有細(xì)胞的抗原表達(dá)情況，鑒別出正常細(xì)胞和異常細(xì)胞群體，正常細(xì)胞的表現(xiàn)可以作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)染色過程的內(nèi)部參照，提供實(shí)驗(yàn)一致性與否的客觀證據(jù)，異常細(xì)胞則通過進(jìn)一步設(shè)門分析確定表型特點(diǎn)。⑶設(shè)門：即選擇特殊的細(xì)胞群體分析其各個(gè)參數(shù)的表現(xiàn)，是一個(gè)基本的分析技巧。把分析局限在門內(nèi)的細(xì)胞群體的前提是門內(nèi)的細(xì)胞代表所有感興趣的細(xì)胞，而且沒有其他細(xì)胞的污染。一般來說，不同疾病的FSCvs.SSCL&LSSCBB設(shè)門來看抗κ鏈和抗λ鏈的表現(xiàn)TT外，通過細(xì)胞特異