植物生物技術(shù)：第五章 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)課件

1第五章單倍體細(xì)胞培養(yǎng)第五章1第五章單倍體細(xì)胞培養(yǎng)第五章2第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值第二節(jié)離體花粉/小孢子發(fā)育途徑第三節(jié)花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)第四節(jié)植物單倍體育種本章主要內(nèi)容第四章2第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值本章主要內(nèi)容第四章3本章教學(xué)目的與要求概念：花粉培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)，花粉二型性單倍體的應(yīng)用價(jià)值離體花粉的發(fā)育途徑花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較第四章3本章教學(xué)目的與要求概念：花粉培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)，花粉二型性第四4第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值一、概念二、單倍體的起源三、單倍體植物的特點(diǎn)及遺傳行為四、單倍體的應(yīng)用價(jià)值第五章4第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值一、概念第五章5一、概念單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個(gè)體或組織，體細(xì)胞染色體數(shù)為n單倍體細(xì)胞培養(yǎng)主要包括三個(gè)方面：花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)未受精子房及卵細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)5一、概念第一節(jié)6二、單倍體的起源①種間和屬間雜交

遠(yuǎn)緣雜交中，異種植物雖然不能與母本授粉、受精，由于遠(yuǎn)緣花粉的誘導(dǎo)作用，卵細(xì)胞在沒有受精的情況下受刺激而發(fā)育成胚土豆、大麥、小麥、玉米②物理照射和化學(xué)誘變

花粉用射線照射后失去了受精能力，然后與母株授粉，卵細(xì)胞在花粉的刺激作用下進(jìn)行孤雌發(fā)育，從而產(chǎn)生單倍體煙草、小麥、金魚草第一節(jié)6二、單倍體的起源①種間和屬間雜交第一節(jié)7③雙生苗的篩選（selectionoftwins）有些植物可產(chǎn)生多胚種子，即兩個(gè)或多個(gè)胚被共同的種皮包裹著，這些種子可產(chǎn)生單倍體-單倍體、二倍體-二倍體和單倍體-二倍體植株在辣椒中，雙生苗的頻率受母本基因型控制通過篩選可以提高雙生苗的頻率④花藥和花粉培養(yǎng)

第一節(jié)7③雙生苗的篩選（selectionoftwins）8三、單倍體植物的特點(diǎn)及遺傳行為1、單倍體分成兩類:一倍單倍體（monohaploids），這類單倍體起源于二倍體物種多倍單倍體（polyhaploids），這類單倍體起源于多倍體（如4X，6X等）第一節(jié)8三、單倍體植物的特點(diǎn)及遺傳行為第一節(jié)9diploid植物其haploid即為monoploid

玉米2n=2x=20n=x=10

水稻2n=2x=24n=x=12

柑橘2n=2x=18n=x=9

tetraploid植物其haploid為dihaploid

馬鈴薯2n=4x=48n=2x=24

陸地棉2n=4x=52n=2x=26

hexaploid植物其haploid為triploid

普通小麥2n=6x=42n=3x=21

octoploid植物其haploid為tetraploid

草莓2n=8x=56n=4x=28第一節(jié)9diploid植物其haploid即為monoploid102、單倍體植物的特點(diǎn)體細(xì)胞染色體數(shù)減半；生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮械纳踔敛荒苓M(jìn)入有性世代第一節(jié)3、單倍體的遺傳行為一倍的單倍體只有一個(gè)染色體基數(shù)（X），減數(shù)分裂時(shí)染色體不能配對，分離極不正常但具有一定同源關(guān)系的染色體可以部分配對，從而可以對染色體的演化過程進(jìn)行研究102、單倍體植物的特點(diǎn)第一節(jié)3、單倍體的遺傳行為11四、單倍體的應(yīng)用價(jià)值母本×父本F1F2花藥培養(yǎng)花粉植株加倍選擇鑒定品系比較試驗(yàn)區(qū)域試驗(yàn)品種5—8代（一）、縮短育種周期第一節(jié)11四、單倍體的應(yīng)用價(jià)值母本×父本F1F2花藥培養(yǎng)花粉植株加12（二）、提高目標(biāo)基因型的選擇效率如果某一性狀受一對基因控制AA×aa→F1→F2中純合AA個(gè)體只有1/4F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生的后代中AA個(gè)體占1/2，比常規(guī)雜交育種提高一倍如屬兩對基因控制AAbb×aaBB,F2中要選出AABB個(gè)體的機(jī)率只有1/16F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，AaBb只產(chǎn)生4種花粉：AB、Ab、aB、ab，加倍后AABB個(gè)體的頻率可達(dá)1/4比常規(guī)雜交育種效率提高4倍常規(guī)育種：單倍體育種=1/22n：1/2n。12（二）、提高目標(biāo)基因型的選擇效率13（三）、排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾

對于雜交育種來講，由于低世代很多基因位點(diǎn)尚處于雜合狀態(tài)，會有不同程度的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)，對個(gè)體的選擇會造成一定誤差采用DH群體進(jìn)行選擇育種，由于各基因位點(diǎn)在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能更大程度上代表真實(shí)變異第一節(jié)13（三）、排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾

第一節(jié)14（四）、遺傳研究的良好實(shí)驗(yàn)材料體系

單倍體在作物的數(shù)量遺傳研究中可能有較大用途，如：基因相互作用的檢測、遺傳變異的估計(jì)、連鎖群的檢測、影響數(shù)量性狀的基因數(shù)目的估計(jì)及多基因的定位等

DH系是分子標(biāo)記遺傳作圖的良好群體單倍體可用來創(chuàng)造非整倍體材料，用單倍體與二倍體雜交，可創(chuàng)造一系列的附加系，從而研究染色體的遺傳功能花藥和花粉培養(yǎng)體系還是發(fā)育遺傳研究的良好材料，可以用來研究細(xì)胞的分裂及分化，研究花粉發(fā)育途徑的轉(zhuǎn)變，以及與轉(zhuǎn)變有關(guān)的基因的表達(dá)與調(diào)控第一節(jié)14（四）、遺傳研究的良好實(shí)驗(yàn)材料體系第一節(jié)15（五）、突變體的篩選單倍體的每個(gè)基因都是單拷貝的，各種隱性基因都可以表現(xiàn)出來，加倍后形成的雙單倍體各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來，大大提高了抗性或其它突變體的篩選效率對花藥進(jìn)行離子照射，然后對花藥愈傷篩選，可以獲得理想的突變體第一節(jié)15（五）、突變體的篩選第一節(jié)16（六）、消除致死基因單倍體帶有致死基因的個(gè)體即使加倍后形成雙單倍體也會由于基因的純合而被消除而致死基因在自然群體里常常因?yàn)殡s合體的存在而不易被徹底消除。（七）、選育新型自交系對雙親或多親雜交的雜種一代進(jìn)行花藥或花粉培養(yǎng)，獲得的雙單倍體實(shí)際上是純合的自交系，在雜種優(yōu)勢利用育種中有很大用途第一節(jié)16（六）、消除致死基因第一節(jié)17（八）、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料在轉(zhuǎn)基因育種中，如果用體細(xì)胞為受體，經(jīng)常遇到轉(zhuǎn)基因后代材料分離問題，經(jīng)多代選擇才能穩(wěn)定下來如用單倍體細(xì)胞作受體，獲得的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)加倍后，從理論上講會很快達(dá)到純合狀態(tài)受體材料可以是花粉、單倍體原生質(zhì)體、單倍體胚或單倍體植株作外植體第一節(jié)本節(jié)完17（八）、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料第一節(jié)本節(jié)完18第二節(jié)離體花粉/小孢子發(fā)育途徑一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段二、離體小孢子的發(fā)育途徑三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理第二節(jié)18第二節(jié)離體花粉/小孢子發(fā)育途徑一、花粉/小孢子的正19一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段19一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段20（一）、花粉不均等分裂途徑(A途徑)小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂，形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞。（1）營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑:由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（2）生殖細(xì)胞發(fā)育途徑:由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（3）營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑:由營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體（4）營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過核融合，形成多倍體植株二、離體小孢子的發(fā)育途徑第二節(jié)20（一）、花粉不均等分裂途徑(A途徑)二、離體小孢子的發(fā)21第二節(jié)（二）花粉均等分裂途徑（B途徑）小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個(gè)細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞繼續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株21第二節(jié)（二）花粉均等分裂途徑（B途徑）221、雄核發(fā)育與P花粉的形成花粉的二型性：在花藥/花粉培養(yǎng)時(shí)，由于對培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同，花粉在形態(tài)上形成兩種類型，一類是具胚性的，在煙草和大麥中，花粉小，染色淺；另一類為花粉大，染色深，朝成熟花粉方向發(fā)展P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理第二節(jié)221、雄核發(fā)育與P花粉的形成三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理第二節(jié)23在煙草和大麥中，花粉小，染色淺，為胚性的胚性小孢子第三節(jié)23在煙草和大麥中，花粉小，染色淺，為胚性的胚性小孢子第三24水稻花粉二型性在水稻中，胚性小孢子（約10%）比非胚性小孢子大、高度液泡化胚性小孢子第三節(jié)24水稻花粉二型性在水稻中，胚性小孢子（約10%）比非胚性小252、逆境處理與雄核發(fā)育的誘導(dǎo)

熱激處理物理或化學(xué)處理低溫處理營養(yǎng)饑餓處理重金屬脅迫激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚促使細(xì)胞同步分裂改變細(xì)胞分裂周期第二節(jié)本節(jié)完252、逆境處理與雄核發(fā)育的誘導(dǎo) 熱激處理第二節(jié)本節(jié)完26第三節(jié)花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)二、花粉培養(yǎng)操作技術(shù)三、單倍體植株再生、鑒定及加倍四、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較五、影響花藥培養(yǎng)的因素六、禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)象第三節(jié)26第三節(jié)花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)第三節(jié)27花藥培養(yǎng):是植物雄性生殖器官-花藥為外植體離體培養(yǎng)技術(shù)，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來講，屬于器官培養(yǎng)的范疇?；ǚ叟囵B(yǎng)：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離出來，再加以離體培養(yǎng)。也稱為小孢子培養(yǎng)(microsporeculture)27花藥培養(yǎng):是植物雄性生殖器官-花藥為外植體離體培養(yǎng)技術(shù)，28一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精浸泡30-60s花蕾后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min，無菌水沖洗3-5次。

3、培養(yǎng)固體或液體培養(yǎng)基均可。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。第三節(jié)28一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的29二、花粉培養(yǎng)操作技術(shù)(一)花粉的分離與純化1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機(jī)械游離（1）磁攪拌法：用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；（2）超速旋切法：通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化對上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子第三節(jié)29二、花粉培養(yǎng)操作技術(shù)(一)花粉的分離與純化第三節(jié)30(二)花粉培養(yǎng)方式1、平板培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)：花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)：花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。

4、看護(hù)培養(yǎng)：利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng)：利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)：利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。第三節(jié)30(二)花粉培養(yǎng)方式第三節(jié)31看護(hù)培養(yǎng)：第三節(jié)31看護(hù)培養(yǎng)：第三節(jié)32（一）花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式1、器官發(fā)生型花粉-----多細(xì)胞花粉粒----細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）-----繼代培養(yǎng)-----單倍體植株。2、胚狀體發(fā)生型花粉-----多細(xì)胞花粉粒----進(jìn)一步培養(yǎng)----胚狀體-----釋放-----植物體。第三節(jié)三、單倍體植株再生、鑒定及加倍32（一）花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式1、器官發(fā)生型第三節(jié)三、單倍33第三節(jié)33第三節(jié)34（二）、單倍體植株鑒定1、染色體直接計(jì)數(shù)法：通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。2、間接鑒定（1）流式細(xì)胞儀鑒定：主要測定葉片單個(gè)細(xì)胞中DNA的含量確定細(xì)胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法：葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。第三節(jié)34（二）、單倍體植株鑒定1、染色體直接計(jì)數(shù)法：通常取根尖、35（3）植株形態(tài)學(xué)鑒定法：單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結(jié)實(shí)。（4）雜交鑒定法：自交或測交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細(xì)胞。（5）分子標(biāo)記鑒定 如RFLP、RAPD、AFLP等第三節(jié)35（3）植株形態(tài)學(xué)鑒定法：單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱36（三）、染色體加倍1.莖段培養(yǎng)：將單倍體植株的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細(xì)胞，分化出純合的二倍體植株。2.化學(xué)試劑誘變：秋水仙素誘導(dǎo)（1）

浸泡法：無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（2）

生長錐處理：秋水仙素水溶液直接涂抹生長點(diǎn)（頂芽或腋芽）。（3）

培養(yǎng)基處理：將單倍體植株和任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度和秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體。第三節(jié)36（三）、染色體加倍1.莖段培養(yǎng)：將單倍體植株的莖段進(jìn)行37花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)”形成小植株。選擇合適的供體植株（F1）倍性鑒定或染色體加倍第三節(jié)37花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）收集38四、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較第三節(jié)花藥培養(yǎng)有時(shí)會由于花藥中的有害物質(zhì)而不能誘導(dǎo)小孢子啟動第一次分裂，小孢子培養(yǎng)則不會花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)都是單倍體植株或雙單倍體，不含有因藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織的干擾而形成的體細(xì)胞植株花粉培養(yǎng)獲得的材料總是純合的由于花粉能均勻地接觸化學(xué)的和物理的誘變因素，花粉是研究吸收、轉(zhuǎn)化和誘變的理想材料可觀察到由單個(gè)細(xì)胞開始雄核發(fā)育的全過程，是遺傳與發(fā)育研究良好的材料體系38四、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較第三節(jié)花藥培養(yǎng)有時(shí)會由于花藥391.供體植株的生長條件

煙草：短光周期（8h）和高光強(qiáng)（16000lux）大麥：低溫（12℃

）和高光強(qiáng)（20000lux）油菜：高光強(qiáng)和一定的溫度變化2.供體植株的年齡多數(shù)情況下幼年植株優(yōu)于老年植株第三節(jié)五、影響花藥培養(yǎng)的因素391.供體植株的生長條件

第三節(jié)五、影響花藥培養(yǎng)的因素403.花粉發(fā)育時(shí)期花粉發(fā)育時(shí)期對誘導(dǎo)雄核發(fā)育非常重要一般從單核早期到雙核早期第三節(jié)發(fā)育時(shí)期物種減數(shù)分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄單核早中期大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍(lán)403.花粉發(fā)育時(shí)期第三節(jié)發(fā)育時(shí)期物種減數(shù)分裂期草莓、番茄41花粉發(fā)育時(shí)期的確定花藥在接種以前，一般需先用醋酸洋紅壓片法進(jìn)行鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時(shí)期，并找出花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾或幼穗大小、顏色等特征之間的相應(yīng)關(guān)系根據(jù)花蕾和花藥的長度判斷小孢子發(fā)育時(shí)期，從而為取材提供參考第三節(jié)單核晚期第一次有絲分裂后期雙核早期雙核中期41花粉發(fā)育時(shí)期的確定第三節(jié)單核晚期第一次有絲分裂后期雙核早424.花蕾和花藥的預(yù)處理：低溫、EMS、秋水仙素、γ射線、酒精、高低滲、饑餓處理、高溫處理、重金屬脅迫等低溫預(yù)處理：煙草3～5℃72小時(shí)水稻10℃10～14天第三節(jié)424.花蕾和花藥的預(yù)處理：低溫、EMS、秋水仙素、γ射線43

5.供體植株的基因型

供體植株的基因型是影響花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的關(guān)鍵因素不同基因型的植株對培養(yǎng)的反應(yīng)不同表現(xiàn)為是否可誘導(dǎo)胚狀體的生成，生成胚狀體的多少，以及由胚再生成植株的能力大小第三節(jié)43

5.供體植株的基因型第三節(jié)44

基因型接種愈傷再生率（%）植株數(shù)/花藥花藥數(shù)產(chǎn)量綠苗率白苗率綠苗數(shù)白苗數(shù)綠苗/白苗

Igri18010.5733.3316.673.521.672.0IgriHO42012.9230.643.233.960.429.4IgriH118022.1830.3018.186.724.031.7Atias608.577.147.140.610.611.0No.1G.N.12014.144.004.000.570.571.0Doublet18011.6615.007.501.750.872.0Harrington3002.1223.535.880.500.124.2Triumph2402.6266.6716.671.750.444.0Goft1801.1416.6711.110.190.131.5WenI2401.6310.0013.330.160.220.7Ht/GmF63002.8220.005.000.560.144.0No.3Z.S/IgriF124010.2014.2928.571.462.910.5G.M.R.T./IgriF16012.5311.547.691.450.961.5Harrington/IgriF1608.4033.3333.332.802.801.0Igri/HarryF118038.6137.5016.6714.486.442.2Igri/J.Q.F112027.8756.2518.7515.685.233.0

平均—11.5524.6212.823.341.64—

大麥基因型對花藥培養(yǎng)效果的影響反應(yīng)差反應(yīng)好第三節(jié)44

基因型接種愈傷456.培養(yǎng)基：①花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基種類MSNitschN6B5第三節(jié)456.培養(yǎng)基：第三節(jié)46

②滲透壓花藥培養(yǎng)時(shí)往往需要一定的滲透壓，成熟花粉是二細(xì)胞結(jié)構(gòu)的，往往需低濃度糖成熟花粉為三細(xì)胞結(jié)構(gòu)的植物往往需高滲條件，如油菜小孢子培養(yǎng)時(shí)，糖的濃度可用到13-17%番茄花藥培養(yǎng)對蔗糖濃度的誘導(dǎo)反應(yīng):蔗糖濃度2％3％4％6％10％13％17％誘導(dǎo)頻率5％10％12％18％25％45％

8％第三節(jié)46②滲透壓第三節(jié)47③激素

2，4-D對啟動分裂和愈傷的增殖往往有刺激作用，但對分化卻有抑制作用，在誘導(dǎo)單倍體愈傷分化時(shí)，應(yīng)及時(shí)降低或去除2，4-D高濃度的2,4-D主要誘導(dǎo)花藥形成愈傷組織，增加了二倍體細(xì)胞發(fā)育的機(jī)會

在茄子中的研究表明：MS＋2,4-D0.5mgl-1＋KT1mgl-1，n-93.8%，2n-6.2%

MS＋2,4-D2mgl-1＋KT1mgl-1，n-64.1%，2n-35.9%第三節(jié)47③激素

2，4-D對啟動分裂和愈傷的增殖往往有刺激作用，48④氮素的量和各種氮素的比例朱至清等（1974）在水稻花藥培養(yǎng)中改變培養(yǎng)基中無機(jī)氮源可以顯著改變花粉形成愈傷組織的頻率，隨后又能影響由愈傷組織分化綠苗的頻率在他們所研制的N6培養(yǎng)基中，供試的三個(gè)水稻品種花粉出愈率分別為37.7%,32.2%和7.5%，而在Miller培養(yǎng)基上分別只有15.5%,10.8%和0%N6與Miller培養(yǎng)基中氮的組成有明顯不同為禾本科作物的花藥培養(yǎng)主要使用N6培養(yǎng)基第三節(jié)48④氮素的量和各種氮素的比例第三節(jié)49⑤有機(jī)物質(zhì)在大麥和小麥的花藥培養(yǎng)中，谷氨酰胺對小孢子胚形成具有明顯的促進(jìn)作用對于某些植物種來講，添加某種植物的提取物或椰汁可以改善培養(yǎng)效果

第三節(jié)49⑤有機(jī)物質(zhì)第三節(jié)50⑥有些作物的花藥對培養(yǎng)基的pH值有一定要求在曼陀羅的花藥培養(yǎng)中，觀察到隨著pH值的變化，產(chǎn)生胚狀體的花藥百分率增加，當(dāng)pH值達(dá)到5.8時(shí)，效果最好，當(dāng)pH值增至6.5時(shí)，花粉不形成胚狀體，鏡檢發(fā)現(xiàn)花粉不發(fā)生細(xì)胞分裂。在油菜的小孢子培養(yǎng)中，通常采用6.2的pH值效果較好第三節(jié)50⑥有些作物的花藥對培養(yǎng)基的pH值有一定要求第三節(jié)517.培養(yǎng)條件：多數(shù)植物在25℃下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織可某些植物，尤其是蕓苔屬，在高溫35℃下處理幾天，然后進(jìn)入25℃培養(yǎng)能收到最好培養(yǎng)效果玉米需要在14-15℃培養(yǎng)4天再轉(zhuǎn)到27-28℃的條件下培養(yǎng)，效果較好花藥培養(yǎng)一般在暗處進(jìn)行，直到愈傷或胚狀體形成再轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)第三節(jié)517.培養(yǎng)條件：第三節(jié)52六、禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)象禾谷類植物花粉單倍體生產(chǎn)中出現(xiàn)大量白化苗內(nèi)部因素：基因型和花粉發(fā)育時(shí)期的影響最為明顯外界因素：如高溫、高濃度2，4-D、延遲轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)時(shí)間等均可促進(jìn)白化苗產(chǎn)生白化苗產(chǎn)生的機(jī)制質(zhì)體23S和16SRNA基因組的變異造成來自染色體畸變的花粉花粉有絲分裂過程中，質(zhì)體不能分化并降解第三節(jié)本節(jié)完52六、禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)象禾谷類植物花粉單倍53第四節(jié)植物單倍體育種

我國花粉培育種技術(shù)走在世界前列，育成各種農(nóng)作物新品種幾十個(gè)，有的已推廣很大面積，在生產(chǎn)上發(fā)揮著重要作。水稻：“中花8－11號”，“朝花矮”、“寧糯1號”、“寧糯6號”、“單209”、“浙粳66”、油菜小孢子培養(yǎng)培育品種：“華雙3號”雙低油菜品種，累計(jì)推廣面積達(dá)3000萬畝第四節(jié)53第四節(jié)植物單倍體育種我國花粉培育種技術(shù)走在世界前54

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種技術(shù)路線第四節(jié)54單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種技術(shù)路線第四節(jié)55第四節(jié)本節(jié)完華雙3號審定的技術(shù)路線圖55第四節(jié)本節(jié)完華雙3號審定的技術(shù)路線圖56概念：花粉的二型性單倍體在遺傳和育種中的應(yīng)用價(jià)值培養(yǎng)條件下小孢子的發(fā)育途徑花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的優(yōu)勢體現(xiàn)在哪些方面玉米種群中存在高產(chǎn)不抗病（AAbb）、低產(chǎn)抗病(aaBB)兩種類型，以此為材料，采用何種技術(shù)路線培育高產(chǎn)抗病新品種，繪出技術(shù)路線圖。第四節(jié)本章思考題56概念：花粉的二型性第四節(jié)本章思考題57第五章單倍體細(xì)胞培養(yǎng)第五章1第五章單倍體細(xì)胞培養(yǎng)第五章58第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值第二節(jié)離體花粉/小孢子發(fā)育途徑第三節(jié)花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)第四節(jié)植物單倍體育種本章主要內(nèi)容第四章2第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值本章主要內(nèi)容第四章59本章教學(xué)目的與要求概念：花粉培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)，花粉二型性單倍體的應(yīng)用價(jià)值離體花粉的發(fā)育途徑花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較第四章3本章教學(xué)目的與要求概念：花粉培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)，花粉二型性第四60第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值一、概念二、單倍體的起源三、單倍體植物的特點(diǎn)及遺傳行為四、單倍體的應(yīng)用價(jià)值第五章4第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值一、概念第五章61一、概念單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個(gè)體或組織，體細(xì)胞染色體數(shù)為n單倍體細(xì)胞培養(yǎng)主要包括三個(gè)方面：花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)未受精子房及卵細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)5一、概念第一節(jié)62二、單倍體的起源①種間和屬間雜交

遠(yuǎn)緣雜交中，異種植物雖然不能與母本授粉、受精，由于遠(yuǎn)緣花粉的誘導(dǎo)作用，卵細(xì)胞在沒有受精的情況下受刺激而發(fā)育成胚土豆、大麥、小麥、玉米②物理照射和化學(xué)誘變

花粉用射線照射后失去了受精能力，然后與母株授粉，卵細(xì)胞在花粉的刺激作用下進(jìn)行孤雌發(fā)育，從而產(chǎn)生單倍體煙草、小麥、金魚草第一節(jié)6二、單倍體的起源①種間和屬間雜交第一節(jié)63③雙生苗的篩選（selectionoftwins）有些植物可產(chǎn)生多胚種子，即兩個(gè)或多個(gè)胚被共同的種皮包裹著，這些種子可產(chǎn)生單倍體-單倍體、二倍體-二倍體和單倍體-二倍體植株在辣椒中，雙生苗的頻率受母本基因型控制通過篩選可以提高雙生苗的頻率④花藥和花粉培養(yǎng)

第一節(jié)7③雙生苗的篩選（selectionoftwins）64三、單倍體植物的特點(diǎn)及遺傳行為1、單倍體分成兩類:一倍單倍體（monohaploids），這類單倍體起源于二倍體物種多倍單倍體（polyhaploids），這類單倍體起源于多倍體（如4X，6X等）第一節(jié)8三、單倍體植物的特點(diǎn)及遺傳行為第一節(jié)65diploid植物其haploid即為monoploid

玉米2n=2x=20n=x=10

水稻2n=2x=24n=x=12

柑橘2n=2x=18n=x=9

tetraploid植物其haploid為dihaploid

馬鈴薯2n=4x=48n=2x=24

陸地棉2n=4x=52n=2x=26

hexaploid植物其haploid為triploid

普通小麥2n=6x=42n=3x=21

octoploid植物其haploid為tetraploid

草莓2n=8x=56n=4x=28第一節(jié)9diploid植物其haploid即為monoploid662、單倍體植物的特點(diǎn)體細(xì)胞染色體數(shù)減半；生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減小；雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮?，有的甚至不能進(jìn)入有性世代第一節(jié)3、單倍體的遺傳行為一倍的單倍體只有一個(gè)染色體基數(shù)（X），減數(shù)分裂時(shí)染色體不能配對，分離極不正常但具有一定同源關(guān)系的染色體可以部分配對，從而可以對染色體的演化過程進(jìn)行研究102、單倍體植物的特點(diǎn)第一節(jié)3、單倍體的遺傳行為67四、單倍體的應(yīng)用價(jià)值母本×父本F1F2花藥培養(yǎng)花粉植株加倍選擇鑒定品系比較試驗(yàn)區(qū)域試驗(yàn)品種5—8代（一）、縮短育種周期第一節(jié)11四、單倍體的應(yīng)用價(jià)值母本×父本F1F2花藥培養(yǎng)花粉植株加68（二）、提高目標(biāo)基因型的選擇效率如果某一性狀受一對基因控制AA×aa→F1→F2中純合AA個(gè)體只有1/4F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生的后代中AA個(gè)體占1/2，比常規(guī)雜交育種提高一倍如屬兩對基因控制AAbb×aaBB,F2中要選出AABB個(gè)體的機(jī)率只有1/16F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，AaBb只產(chǎn)生4種花粉：AB、Ab、aB、ab，加倍后AABB個(gè)體的頻率可達(dá)1/4比常規(guī)雜交育種效率提高4倍常規(guī)育種：單倍體育種=1/22n：1/2n。12（二）、提高目標(biāo)基因型的選擇效率69（三）、排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾

對于雜交育種來講，由于低世代很多基因位點(diǎn)尚處于雜合狀態(tài)，會有不同程度的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)，對個(gè)體的選擇會造成一定誤差采用DH群體進(jìn)行選擇育種，由于各基因位點(diǎn)在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能更大程度上代表真實(shí)變異第一節(jié)13（三）、排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾

第一節(jié)70（四）、遺傳研究的良好實(shí)驗(yàn)材料體系

單倍體在作物的數(shù)量遺傳研究中可能有較大用途，如：基因相互作用的檢測、遺傳變異的估計(jì)、連鎖群的檢測、影響數(shù)量性狀的基因數(shù)目的估計(jì)及多基因的定位等

DH系是分子標(biāo)記遺傳作圖的良好群體單倍體可用來創(chuàng)造非整倍體材料，用單倍體與二倍體雜交，可創(chuàng)造一系列的附加系，從而研究染色體的遺傳功能花藥和花粉培養(yǎng)體系還是發(fā)育遺傳研究的良好材料，可以用來研究細(xì)胞的分裂及分化，研究花粉發(fā)育途徑的轉(zhuǎn)變，以及與轉(zhuǎn)變有關(guān)的基因的表達(dá)與調(diào)控第一節(jié)14（四）、遺傳研究的良好實(shí)驗(yàn)材料體系第一節(jié)71（五）、突變體的篩選單倍體的每個(gè)基因都是單拷貝的，各種隱性基因都可以表現(xiàn)出來，加倍后形成的雙單倍體各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來，大大提高了抗性或其它突變體的篩選效率對花藥進(jìn)行離子照射，然后對花藥愈傷篩選，可以獲得理想的突變體第一節(jié)15（五）、突變體的篩選第一節(jié)72（六）、消除致死基因單倍體帶有致死基因的個(gè)體即使加倍后形成雙單倍體也會由于基因的純合而被消除而致死基因在自然群體里常常因?yàn)殡s合體的存在而不易被徹底消除。（七）、選育新型自交系對雙親或多親雜交的雜種一代進(jìn)行花藥或花粉培養(yǎng)，獲得的雙單倍體實(shí)際上是純合的自交系，在雜種優(yōu)勢利用育種中有很大用途第一節(jié)16（六）、消除致死基因第一節(jié)73（八）、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料在轉(zhuǎn)基因育種中，如果用體細(xì)胞為受體，經(jīng)常遇到轉(zhuǎn)基因后代材料分離問題，經(jīng)多代選擇才能穩(wěn)定下來如用單倍體細(xì)胞作受體，獲得的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)加倍后，從理論上講會很快達(dá)到純合狀態(tài)受體材料可以是花粉、單倍體原生質(zhì)體、單倍體胚或單倍體植株作外植體第一節(jié)本節(jié)完17（八）、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料第一節(jié)本節(jié)完74第二節(jié)離體花粉/小孢子發(fā)育途徑一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段二、離體小孢子的發(fā)育途徑三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理第二節(jié)18第二節(jié)離體花粉/小孢子發(fā)育途徑一、花粉/小孢子的正75一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段19一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段76（一）、花粉不均等分裂途徑(A途徑)小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂，形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞。（1）營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑:由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（2）生殖細(xì)胞發(fā)育途徑:由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（3）營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑:由營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體（4）營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過核融合，形成多倍體植株二、離體小孢子的發(fā)育途徑第二節(jié)20（一）、花粉不均等分裂途徑(A途徑)二、離體小孢子的發(fā)77第二節(jié)（二）花粉均等分裂途徑（B途徑）小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個(gè)細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞繼續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株21第二節(jié)（二）花粉均等分裂途徑（B途徑）781、雄核發(fā)育與P花粉的形成花粉的二型性：在花藥/花粉培養(yǎng)時(shí)，由于對培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同，花粉在形態(tài)上形成兩種類型，一類是具胚性的，在煙草和大麥中，花粉小，染色淺；另一類為花粉大，染色深，朝成熟花粉方向發(fā)展P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理第二節(jié)221、雄核發(fā)育與P花粉的形成三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理第二節(jié)79在煙草和大麥中，花粉小，染色淺，為胚性的胚性小孢子第三節(jié)23在煙草和大麥中，花粉小，染色淺，為胚性的胚性小孢子第三80水稻花粉二型性在水稻中，胚性小孢子（約10%）比非胚性小孢子大、高度液泡化胚性小孢子第三節(jié)24水稻花粉二型性在水稻中，胚性小孢子（約10%）比非胚性小812、逆境處理與雄核發(fā)育的誘導(dǎo)

熱激處理物理或化學(xué)處理低溫處理營養(yǎng)饑餓處理重金屬脅迫激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚促使細(xì)胞同步分裂改變細(xì)胞分裂周期第二節(jié)本節(jié)完252、逆境處理與雄核發(fā)育的誘導(dǎo) 熱激處理第二節(jié)本節(jié)完82第三節(jié)花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)二、花粉培養(yǎng)操作技術(shù)三、單倍體植株再生、鑒定及加倍四、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較五、影響花藥培養(yǎng)的因素六、禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)象第三節(jié)26第三節(jié)花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)第三節(jié)83花藥培養(yǎng):是植物雄性生殖器官-花藥為外植體離體培養(yǎng)技術(shù)，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來講，屬于器官培養(yǎng)的范疇?；ǚ叟囵B(yǎng)：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離出來，再加以離體培養(yǎng)。也稱為小孢子培養(yǎng)(microsporeculture)27花藥培養(yǎng):是植物雄性生殖器官-花藥為外植體離體培養(yǎng)技術(shù)，84一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精浸泡30-60s花蕾后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min，無菌水沖洗3-5次。

3、培養(yǎng)固體或液體培養(yǎng)基均可。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。第三節(jié)28一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的85二、花粉培養(yǎng)操作技術(shù)(一)花粉的分離與純化1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機(jī)械游離（1）磁攪拌法：用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；（2）超速旋切法：通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化對上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子第三節(jié)29二、花粉培養(yǎng)操作技術(shù)(一)花粉的分離與純化第三節(jié)86(二)花粉培養(yǎng)方式1、平板培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)：花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)：花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。

4、看護(hù)培養(yǎng)：利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng)：利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)：利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。花藥條件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。第三節(jié)30(二)花粉培養(yǎng)方式第三節(jié)87看護(hù)培養(yǎng)：第三節(jié)31看護(hù)培養(yǎng)：第三節(jié)88（一）花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式1、器官發(fā)生型花粉-----多細(xì)胞花粉粒----細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）-----繼代培養(yǎng)-----單倍體植株。2、胚狀體發(fā)生型花粉-----多細(xì)胞花粉粒----進(jìn)一步培養(yǎng)----胚狀體-----釋放-----植物體。第三節(jié)三、單倍體植株再生、鑒定及加倍32（一）花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式1、器官發(fā)生型第三節(jié)三、單倍89第三節(jié)33第三節(jié)90（二）、單倍體植株鑒定1、染色體直接計(jì)數(shù)法：通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。2、間接鑒定（1）流式細(xì)胞儀鑒定：主要測定葉片單個(gè)細(xì)胞中DNA的含量確定細(xì)胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法：葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。第三節(jié)34（二）、單倍體植株鑒定1、染色體直接計(jì)數(shù)法：通常取根尖、91（3）植株形態(tài)學(xué)鑒定法：單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結(jié)實(shí)。（4）雜交鑒定法：自交或測交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細(xì)胞。（5）分子標(biāo)記鑒定 如RFLP、RAPD、AFLP等第三節(jié)35（3）植株形態(tài)學(xué)鑒定法：單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱92（三）、染色體加倍1.莖段培養(yǎng)：將單倍體植株的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細(xì)胞，分化出純合的二倍體植株。2.化學(xué)試劑誘變：秋水仙素誘導(dǎo)（1）

浸泡法：無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（2）

生長錐處理：秋水仙素水溶液直接涂抹生長點(diǎn)（頂芽或腋芽）。（3）

培養(yǎng)基處理：將單倍體植株和任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度和秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體。第三節(jié)36（三）、染色體加倍1.莖段培養(yǎng)：將單倍體植株的莖段進(jìn)行93花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)”形成小植株。選擇合適的供體植株（F1）倍性鑒定或染色體加倍第三節(jié)37花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）收集94四、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較第三節(jié)花藥培養(yǎng)有時(shí)會由于花藥中的有害物質(zhì)而不能誘導(dǎo)小孢子啟動第一次分裂，小孢子培養(yǎng)則不會花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)都是單倍體植株或雙單倍體，不含有因藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織的干擾而形成的體細(xì)胞植株花粉培養(yǎng)獲得的材料總是純合的由于花粉能均勻地接觸化學(xué)的和物理的誘變因素，花粉是研究吸收、轉(zhuǎn)化和誘變的理想材料可觀察到由單個(gè)細(xì)胞開始雄核發(fā)育的全過程，是遺傳與發(fā)育研究良好的材料體系38四、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較第三節(jié)花藥培養(yǎng)有時(shí)會由于花藥951.供體植株的生長條件

煙草：短光周期（8h）和高光強(qiáng)（16000lux）大麥：低溫（12℃

）和高光強(qiáng)（20000lux）油菜：高光強(qiáng)和一定的溫度變化2.供體植株的年齡多數(shù)情況下幼年植株優(yōu)于老年植株第三節(jié)五、影響花藥培養(yǎng)的因素391.供體植株的生長條件

第三節(jié)五、影響花藥培養(yǎng)的因素963.花粉發(fā)育時(shí)期花粉發(fā)育時(shí)期對誘導(dǎo)雄核發(fā)育非常重要一般從單核早期到雙核早期第三節(jié)發(fā)育時(shí)期物種減數(shù)分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄單核早中期大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍(lán)403.花粉發(fā)育時(shí)期第三節(jié)發(fā)育時(shí)期物種減數(shù)分裂期草莓、番茄97花粉發(fā)育時(shí)期的確定花藥在接種以前，一般需先用醋酸洋紅壓片法進(jìn)行鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時(shí)期，并找出花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾或幼穗大小、顏色等特征之間的相應(yīng)關(guān)系根據(jù)花蕾和花藥的長度判斷小孢子發(fā)育時(shí)期，從而為取材提供參考第三節(jié)單核晚期第一次有絲分裂后期雙核早期雙核中期41花粉發(fā)育時(shí)期的確定第三節(jié)單核晚期第一次有絲分裂后期雙核早984.花蕾和花藥的預(yù)處理：低溫、EMS、秋水仙素、γ射線、酒精、高低滲、饑餓處理、高溫處理、重金屬脅迫等低溫預(yù)處理：煙草3～5℃72小時(shí)水稻10℃10～14天第三節(jié)424.花蕾和花藥的預(yù)處理：低溫、EMS、秋水仙素、γ射線99

5.供體植株的基因型

供體植株的基因型是影響花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的關(guān)鍵因素不同基因型的植株對培養(yǎng)的反應(yīng)不同表現(xiàn)為是否可誘導(dǎo)胚狀體的生成，生成胚狀體的多少，以及由胚再生成植株的能力大小第三節(jié)43

5.供體植株的基因型第三節(jié)100

基因型接種愈傷再生率（%）植株數(shù)/花藥花藥數(shù)產(chǎn)量綠苗率白苗率綠苗數(shù)白苗數(shù)綠苗/白苗

Igri18010.5733.3316.673.521.672.0IgriHO42012.9230.643.233.960.429.4IgriH118022.1830.3018.186.724.031.7Atias608.577.147.140.610.611.0No.1G.N.12014.144.004.000.570.571.0Doublet18011.6615.007.501.750.872.0Harrington3002.1223.535.880.500.124.2Triumph2402.6266.6716.671.750.444.0Goft1801.1416.6711.110.190.131.5WenI2401.6310.0013.330.160.220.7Ht/GmF63002.8220.005.000.560.144.0No.3Z.S/IgriF124010.2014.2928.571.462.910.5G.M.R.T./IgriF16012.5311.547.691.450.961.5Harrington/IgriF1608.4033.3333.332.802.801.0Igri/HarryF118038.6137.5016.6714.486.442.2Igri/J.Q.F112027.8756.2518.7515.685.233.0

平均—11.5524