代謝組學(xué)小常識

代謝組學(xué)小常識概念：代謝組：指一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中所有代謝物的集合，包含一系列不同類型的小分子（通常分子量＜1000）,比如肽、碳水化合物、脂類、核酸等。代謝組學(xué)：通過考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動(dòng)后，其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。實(shí)驗(yàn)流程：（以液質(zhì)聯(lián)用為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)為例）樣本前處理：在保證小分子代謝物完整的前提下，處理的步驟越簡單越好，以保證操作容易重復(fù)，也為大批量樣本的處理節(jié)約時(shí)間。數(shù)據(jù)采集：依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠兴煌?。o非目標(biāo)代謝組學(xué)：選用高分辨質(zhì)譜儀（TOF,Orbitrap等），有助于檢測到盡可能多的化合物，另外高分辨的質(zhì)核比數(shù)據(jù)也有助于數(shù)據(jù)庫檢索以及化合物的鑒定。o目標(biāo)代謝組學(xué)：通常使用三重四極其桿質(zhì)譜，提高檢測的靈敏度以及定量的準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)預(yù)處理：峰提取，排列，歸一化。o多數(shù)質(zhì)譜商家都提供了配套的預(yù)處理軟件，例如安捷倫公司的MassHunter,熱電的Sieve，沃特世的MarkerLynx以及ProgenisisQI。o同時(shí)也有一些基于網(wǎng)絡(luò)的可以免費(fèi)獲取的軟件。建議使用配套的軟件，因?yàn)椴恍枰~外的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，不需要上傳數(shù)據(jù)，節(jié)省時(shí)間。數(shù)據(jù)分析：多元統(tǒng)計(jì)分析包括主成份分析（PCA），偏最小二乘判別分析（PLS-DA），正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），聚類分析（HCA）等。各個(gè)廠商也提供了相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析軟件，比如安捷倫的MPP,熱電的Sieve，沃特世的Ezinfor。目前常用的第三方軟件是Simca-p,同時(shí)也有一些網(wǎng)絡(luò)的開源軟件可以使用?；衔镨b定：數(shù)據(jù)庫檢索，標(biāo)準(zhǔn)品對比，二級質(zhì)譜對比。代謝組學(xué)文章中常見的統(tǒng)計(jì)圖（一）主成分分析（PCA）

1000 500 0 5QQ 1QQ0Component1(76.85%)』備虧星鳥回1000 500 0 5QQ 1QQ0Component1(76.85%)』備虧星鳥回PCA得分圖(scoreplot),用來看樣本天然的分組情況，在分析時(shí)不加任何分組信息。中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，樣本在空間中所處的位置由其中所含有的代謝物的差異決定M4-DmKyeryttironKads-4 -3 2 -1Component1g4附“—訕:偉焊涮M4-DmKyeryttironKads-4 -3 2 -1Component1g4附“—訕:偉焊涮PCA載荷圖(loadingplot),用來尋找差異變量。同種的每一個(gè)點(diǎn)代表樣本中還有的一個(gè)代謝物物，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的代謝物被認(rèn)為對樣本的分類貢獻(xiàn)越大。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）LPC(ia；l}LK(20:4)vriW載荷圖的解釋同PCA。區(qū)別在于，PLS-DA在分析時(shí)提前賦予每個(gè)樣本分組信息,就是在分析時(shí)擴(kuò)大組間差異，減少組內(nèi)差異，多用來尋找標(biāo)記物。正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）得分圖和簡單說，在OPLS-DA分析中，尋找標(biāo)記物通常使用S-plot。如圖中所示，得分圖中，兩組樣本分布在y軸兩側(cè)，通過S-plot可以獲得標(biāo)記物在兩組中相對含量的變化。也就是說，處在S-plot右上角的化合物（距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，對分類貢獻(xiàn)越大）在處在得分圖y軸右側(cè)的樣本中含量較高，反之亦然。代謝組學(xué)文章中常見的統(tǒng)計(jì)圖（二）

熬圖(heatmap)0,Q 20LHtOTTiCLCCPir><-「qc寸s丄丄j壬些丄丄7丄4注點(diǎn)甘"S.注*Ei."S.藝旨.輕電旨.云Cj-*3.O任口a,Q,Q.CkdC.Q.o.三-C匸 匸匸工匸q工匸qu匸二呑垢辱吁石氐蓋蟲屋挨列異竺茗葛芯耳免常紓導(dǎo)旨尊MS-,,」-<胃■■?二■■■?門麗■■■聶MS-,,」-<胃■■?二■■■?門麗■■■聶削IHB■■D-glucnseProlinePhenylalanineL&ucineIsoleucineVaiineethionineTyrosineThreomneGafactopyranoseMannaseUrea5-okcprolineGlkrtamicacidSerineAlpha-tocopfiercfCholesterolcxanthin&圖中每一行代表一個(gè)化合物，每一列代表一個(gè)樣本。上邊對樣本進(jìn)行聚類分析，左邊對化合物進(jìn)行聚類分析。綠色代表該化合物在樣本中含量較低，紅色代表含量較高（也有用其他顏色表示的）。通過此圖，可以直觀地看出化合物在樣本間的變化趨勢；同時(shí)也可以找出具有相同變化趨勢的代謝物。

代謝通踣分析圖“ ； ?PurinemetatiolisiTi4 A i ：? ■:. TOC\o"1-5"\h\zi < i i r>Amino3dyl4RNA'metabdtism? Phenylalaninei^netsb-oliism3_._L 二?daifejw血tabolisjn7i ■ ■ ■ kd■ * ■ ■ F<O: ；Histadinemetab&ti^mfilitrQgQn;metab-oSism2… 卜…^Pantothenateand:CoAba&yn-thesis；f^Pantothenateand:CoAba&yn-thesis；f(qem&tatjohs^rrinsand:cCitratecycEe:Ci^cin&psfrine.poflrJ：「Qia血隹myiabci冷叫0.00 0.0& 0.10 0.15 0.20PathwayImpact乙制迪鬆陰在對化合物進(jìn)行鑒定之后或選擇出生物標(biāo)記物之后，可將化合物名稱（或?qū)?yīng)的HMDB或者KEGG編號）輸入MetaboAnalyst軟件（免費(fèi)）進(jìn)行此分析，來觀察體內(nèi)哪些代謝途徑受到了影響。在圖中，p值越小（Togo（p）越大），pathwayimpact越大，證明該條代謝通路被嚴(yán)重?cái)_動(dòng)。相關(guān)性分析(correlationanalysis)1■*Is1■*Is此分析可用來尋找化合物之間的內(nèi)在聯(lián)系（數(shù)值上的聯(lián)系），如圖中紅色表示負(fù)相關(guān)，黃色表示正相關(guān)?？捎脕砗Y選與某一類或者某一個(gè)自己感興趣的化合物產(chǎn)生正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)的代謝物。L0DiscoveryL0DiscoverysetHCCvs.(Ciniiosis&HealthJ-.4

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o—3MetabolitesAUC^O.96?-4M?tabolit-esAUC=0卿"1豎T篇呦會略評"1豎T篇呦會略評用來評價(jià)算選出的標(biāo)記物的診斷能力。AUC曲線下面積越大，診斷能力越好。

非目標(biāo)代謝組學(xué)（untargetedmetabolomics）中常用的方法學(xué)考察的方法QC樣本的制備：混合相同體積的所有待檢測樣本，然后按照與待測樣本相同的前處理方法來處理QC樣本,之后進(jìn)樣進(jìn)行LC-MS分析。樣本檢測時(shí)，通常在檢測最開始運(yùn)行幾次QC樣本，之后根據(jù)樣本量的大小在每檢測幾個(gè)樣本之后檢測一次QC樣本。MfltaDckiniiCfidataevaluationwotWIom-(oFlTentflsisampRunordersequence?匸■代削紐學(xué)黑昌團(tuán)(oFlTentflsisampRunordersequence?匸■代削紐學(xué)黑昌團(tuán)（團(tuán)片來IS;Wan:EJWilson；D.Gikah.etal.Globa：metabolcprafilingproceduresforurineusingUPLC-M3Natureprolocols,2010.5（^）1005-101S\方法學(xué)考察：方法一：最早使用的一種方法，從QC樣本的總離子流圖中選擇具有代表性的離子峰（覆蓋不同的保留時(shí)間，不同的強(qiáng)度），在對QC樣本進(jìn)行重復(fù)檢測之后，計(jì)算這些離子的保留時(shí)間以及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）,用以考察分析方法的穩(wěn)定性以及重復(fù)性。

方法二:所有樣品檢測完之后，收集所有的QC樣本的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括（峰提取，排列，歸一化等），經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾（80%規(guī)則）之后，計(jì)算剩下的峰的峰面積的RSD值。通常如果在一個(gè)樣本中有超過70%的化合物的RSD值小于等于30%，則證明該方法有良好的穩(wěn)定性以及重復(fù)性，所得到的數(shù)據(jù)可靠（也有不同的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，比如要求LC-MS數(shù)據(jù)小于20%，GC-MS數(shù)據(jù)小于30%等）。5-10 1D-15RSD(%)Range旳Mesa5-10 1D-15RSD(%)Range旳Mesa-CD-0〔％|￥5用運(yùn)30」中」圖中柱形圖表示化合物在不同RSD范圍內(nèi)的百分比分布，折線圖表示在不同RSD范圍的累計(jì)百分比。方法三：原始數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理之后，將所有樣本（包括QC樣本）進(jìn)行PCA分析，在得分圖中觀察QC樣本的聚集程度。由于QC樣本是等量混合了所有的被檢測樣本,理論上QC樣本包含了所有樣本中的代謝物,因此QC樣本理論上會分布在原點(diǎn)周圍。圖中QC樣本緊密聚集，證明方法穩(wěn)定，重復(fù)性良好。方法四：采用混合標(biāo)準(zhǔn)品作為QC，該QC通常包含不同物理化學(xué)性質(zhì)的體內(nèi)和體外代謝物（使所選擇的化合物具有代表性）。檢測結(jié)束后，計(jì)算這些化合物的保留時(shí)間以及峰面積的RSD用以對分離分析方法進(jìn)行評價(jià)。代謝組學(xué)研究中需要了解的質(zhì)譜知識（一）主要介紹以液質(zhì)聯(lián)用為分析工具的代謝組學(xué)研究中的常見問題：1） 在分析樣本時(shí)，要選用什么質(zhì)譜？2） 質(zhì)譜儀中通常按照質(zhì)量分析器以及聯(lián)用方式的不同對質(zhì)譜進(jìn)行分類，常見的包括包括：單四級桿，三重四級桿，飛行時(shí)間（TOF）,Q-TOF，離子阱，線性離子阱（LTQ）,靜電場軌道阱（Orbitrap），LTQ-Orbitrap等。這么多質(zhì)譜，我們應(yīng)該如何選擇？在靶向代謝組學(xué)中，通常使用三重四級桿質(zhì)譜。因?yàn)榘邢虼x組學(xué)是針對某一些特定的化合物進(jìn)行定量檢測，而LC-QqQ/MS在MRM掃描模式下對化合物進(jìn)行定量分析（如藥代動(dòng)力學(xué)研究）已非常普遍，所以使用此方法以達(dá)到更高的靈敏度，更準(zhǔn)確的定量。在非靶向代謝組學(xué)研究中，需要選擇高分辨質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，因?yàn)楦叻直尜|(zhì)譜可以幫助我們檢測到盡可能多的化合物，提供所檢測化合物的精確分子量，同位素分布等信息，有助于化合物的鑒定。何為高分辨？首先了解以下分辨率，分辨率就是指質(zhì)譜儀區(qū)分兩個(gè)質(zhì)量相近的離子的能力。這個(gè)區(qū)分能力也有不同的定義，如10%峰谷分離，50%峰谷分離等。理論知識就不多解釋了，舉個(gè)例子說明便知。以H為例，低分辨質(zhì)譜測得的H的分子量為1,而高分辨質(zhì)譜測得的H分子量為1.007825（當(dāng)然，能測到多精確，取決于分辨率有多高）。有什么用呢？有用！以C2H4,CO,N2為例，這三者在低分辨質(zhì)譜中測得的分子量均為28，也就是說低分辨的質(zhì)譜沒有辦法根據(jù)分子量將三者分離；但是高分辨質(zhì)譜測得三者的分子量分別為28.0313，27.9949，28.0061，可以將三者分開。所以在非靶向代謝組學(xué)中，由于生物樣本中化合物的組成非常復(fù)雜，所以要用高分辨的質(zhì)譜儀對其進(jìn)行檢測，以達(dá)到盡可能多的檢測到化合物的目的。常用的高分辨質(zhì)質(zhì)量分析器：TOF和Or比trap，以及他們與其他質(zhì)量分析器的聯(lián)用形式如Q-TOF，Q-Orbitrap，LTQ-Orbitrap等。注：可以簡單的認(rèn)為，分辨率越高，區(qū)分離子的能力越強(qiáng)，即能夠區(qū)分離子在很細(xì)微的分子量上的差異。但請不要將分辨率和質(zhì)量精度混淆，兩者不一樣。有一個(gè)簡單的類比，低分辨質(zhì)譜對比高分辨質(zhì)譜就類似于普通天平對比十萬分之一天平，精密天平可以區(qū)分物質(zhì)質(zhì)量的細(xì)微差異，但是天平稱出的質(zhì)量準(zhǔn)確與否，取決于天平在使用之前是否校正。代謝組學(xué)研究中需要了解的質(zhì)譜知識(二)上一篇介紹了以下質(zhì)譜的分辨率，高分辨率質(zhì)譜有區(qū)分分子量細(xì)微差異的能力，但是測得的分子量準(zhǔn)確與否，則要看質(zhì)譜的質(zhì)量精度了。分辨率和質(zhì)量精度不一樣，高分辨質(zhì)譜也會有質(zhì)量偏差很大的情況，那今天就來談一談質(zhì)量精度。什么是質(zhì)量精度？質(zhì)量精度指的是質(zhì)譜測得值和理論值之間的誤差。常以mDa或者ppm表/示O舉個(gè)例子：C6H1206理論精確分子量為180.0634,如果測得分子量為180.0631，則誤差為180.0631T80.0634=-0.0003Da=-0.3mDa或者(180.0631-180.0634)/180.0634=1.67e-6即1.67ppm在液質(zhì)聯(lián)用中，化合物通常是以加合離子的形式出現(xiàn)，如[M+H]+,[M+Na]+等，以上只是舉例說明。那么，如何保持較高的質(zhì)量精度呢？所有的高分辨質(zhì)譜在使用之前都需要對質(zhì)譜儀進(jìn)行校正，這個(gè)校正其實(shí)就是校正質(zhì)譜的質(zhì)量軸。就像我們使用十萬分之一天平時(shí)用一個(gè)200克的砝碼對天平進(jìn)行校正一樣，質(zhì)譜的校正也是使用一系列已知分子量的物質(zhì)（覆蓋了從低到高的質(zhì)量范圍）對其進(jìn)行校正?？梢越邮艿钠钔ǔ?ppm,校正的頻率依實(shí)際情況而定，Q-TOF質(zhì)譜大多數(shù)一周校正一次，Orbitrap質(zhì)譜校正的頻率稍少一些。各大儀器廠商常用的校正液如下:安捷f&Q■了OF區(qū)諸ESI調(diào)諧法，備帯號G1^69-85000PoMtivNegativeVass1H8.0Hfi2?5J12955S7、伽半2遠(yuǎn)翎i胛劃詢Mas?*362202S960MjxsJ922.GOT79ft⑷打一朋創(chuàng)旳Mass5妙*7Mass6152L97147S1希期49加石Maiis118219523132122.933152223k?IL46392-I2S.91J9902533.892W1Mass10272I.K94K292833^73139掘電6i"即虜gA.2ESI校正液=順啡因，MRFA,Ultramark1621準(zhǔn)備1如戚正臧，如札I服孤MOulflWJ因儲油到個(gè)呻的F蝶的I加I休和的琥璃版妝2J吸2<Khi【MR卜A儲淞J班璃賊中.二囉IMdUIgma誡1621儲液曲■■^.r.--A,.,J.-：I■ .kl-Ji^,5.I??!!■?H,；;L.I|^'.-■■,.J,If6r.--Al命弓I人冉S?4最lOQulMWig于璇璃JK中6.ffl5Or30的甲阱系藩液將玻聊然的濬泄體稅補(bǔ)半節(jié)10創(chuàng)鋼甩7?充分湖勻SUE液匚稅將懈港裝入F凈的小ftu9.l；|f記ESICnUbfiriiunSoMon儲存尼冰箱中frJH?獲特世Q-TOF?用0SJB甲酸鈉沼液。、疋代前粗字誕身團(tuán)此外，幾乎所有的Q-TOF質(zhì)譜除了在檢測之前進(jìn)行質(zhì)量軸校正外，在質(zhì)譜運(yùn)行過程中還需要對質(zhì)譜進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。安捷f&Q?TOF質(zhì)曙參比離子列表正離子負(fù)離子68.995758]12.9S55X7121.O5087J]19.()36320922,0097481033.988109沃特世Q-TDF質(zhì)墻使用LE作為實(shí)肘校正處在IE員離子模式T頒產(chǎn)住質(zhì)荷出為:55五.2771和554.2丘丄5的離子.二?飭紐諷謂團(tuán)在非目標(biāo)代謝組學(xué)中，代謝物的鑒定通常依賴精確分子量，同位素分布等信息，儀器的數(shù)據(jù)處理軟件通?？梢愿鶕?jù)采集