植物組織培養(yǎng)實驗課件

植物組織培養(yǎng)陳勇一、實驗室設(shè)計、基本設(shè)備及操作技術(shù)二、培養(yǎng)基的成分及作用三、培養(yǎng)基的制備概念：本世紀初開始，以植物生理學為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一項技術(shù)。即應用無菌操作方法，培養(yǎng)植物的一個離體器官、組織或細胞。這項技術(shù)已在快速繁殖、去除病毒、加速育種進程、次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)和種質(zhì)資源的保存等方面取得了巨大的經(jīng)濟效益、社會效益及生態(tài)效益。根芽形成的激素控制理論：細胞分裂素與生長素的比例與絕對含量，調(diào)控著植物組織的形態(tài)發(fā)生及細胞分化，當比值高時產(chǎn)生芽，低時產(chǎn)生根，比值適中時可能維持原組織生長而不分化。植物組織培養(yǎng)的優(yōu)點1.研究材料來源單一，無性系遺傳背景一致2.經(jīng)濟方便效率高3.條件可控誤差小4.生長快周期短重復性強5.周年試驗或生產(chǎn)（一）實驗室設(shè)計與要求房屋可劃分為準備室、培養(yǎng)室、無菌操作室等。1.準備室20m2左右：完成器皿洗滌、培養(yǎng)基配制、分裝、包扎、高壓滅菌等環(huán)節(jié)。主要設(shè)備及用具：電冰箱、高壓滅菌鍋、電爐或煤氣爐、不銹鋼鍋、水槽、大型工作臺、玻璃櫥、干燥箱、蒸餾水發(fā)生器或無離子發(fā)生器、酸度計或PH計、托盤天平、電子天平或工業(yè)天平、培養(yǎng)器皿、下口杯、試劑瓶、移液管、量筒、燒杯、容量瓶、洗瓶、手套、塑料籃等。2.無菌操作室（接種室）是進行無菌工作的場所，如材料的消毒接種、無菌材料的繼代。是植物組織培養(yǎng)研究或生產(chǎn)工作中的最關(guān)鍵的部分。主要設(shè)備是超凈工作臺：其優(yōu)點是操作方便自如，比較舒適，工作效率高，預備時間短，開機10分鐘以上即可操作。無菌室需安裝紫外滅菌燈，定期用70%酒精或其他滅菌手段消毒。無菌室內(nèi)還需有小擱架、醫(yī)用小平車、無菌操作用器具、小白瓷圓碟、適當大小的燒杯或廣口瓶、常備的消毒滅菌藥、毛刷、無菌水等?！?.培養(yǎng)室盡量安排在樓層較高處，以利采光、減少塵埃和雜菌污染的機會；還應清潔、干燥、保溫隔熱、盡量利用自然光照等措施。主要設(shè)備與用具：培養(yǎng)架與燈光、配電板、時控器、空調(diào)機、控溫儀、溫度濕度計、溫度自動記錄儀、最高最低溫度計等儀器。（二）操作技術(shù)1.洗滌培養(yǎng)過程中最經(jīng)常最大量的工作之一，是洗滌培養(yǎng)瓶及其它常用器皿。最常用的洗滌助劑就是家庭用的洗衣粉及肥皂。2.滅菌有菌的范疇：凡是暴露在空氣中的物體，曾經(jīng)接觸過自然水源的物體，至少它的表面，毫無例外都是有菌的。無菌的范疇：經(jīng)過高溫灼燒或蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學滅菌方法處理過后的物體，是無菌的。常用的滅菌方法可分為物理方法和化學方法兩大類。（1）培養(yǎng)基的滅菌：常規(guī)方法是放入高壓滅菌鍋內(nèi)加熱加壓滅菌。一般少量的液體只要121℃即每平方厘米1.1kg的壓力20分鐘就能達到徹底滅菌。滅菌的功效主要是靠溫度，而不是壓力。高壓滅菌鍋的使用可選用以下任一種：A.打開放氣閥，煮沸15分鐘后再關(guān)閉；B打開放氣閥煮沸至大量熱蒸汽噴出再關(guān)閉；C先關(guān)閉放氣閥，待壓力上升到0.5kg/cm2以上時，打開放氣閥放出空氣，再關(guān)閉。（2）不耐熱的物質(zhì)將采用過濾滅菌如赤霉素、玉米素、脫落酸、尿素和某些維生素等。過濾滅菌的原理：溶液通過濾膜后，細菌的細胞和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻。（3）玻璃器皿及耐熱用具等可采用干熱滅菌即利用烘箱加熱到160-180℃的溫度來殺滅微生物。（4）用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌（5）布制品采用高壓滅菌（6）其它（7）植物材料的表面滅菌接種：把處理好的材料經(jīng)無菌操作手續(xù)放置到培養(yǎng)基上。外植體：即接種的植物材料。材料處理的第一步：刷洗、沖洗。第二步：用洗衣粉水或肥皂水浸洗并攪動。第三步：超凈臺內(nèi)材料的表面滅菌滅菌劑使用濃度（%）持續(xù)時間（分鐘）去除的難易效果次氯酸鈣次氯酸鈉過氧化氫（雙氧水）溴水硝酸銀氯化汞（升汞）抗菌素9-10210-121-210.1–14-50ppm5-305-305-152-105-302-1530-60易易最易易較難較難中很好很好好很好好最好較好要根據(jù)植物材料對滅菌劑的敏感性來選用不同的藥劑，確定適宜的處理時間和水洗的次數(shù)。次氯酸鈣、次氯酸鈉——氯氣過氧化氫——原子態(tài)氧升汞滅菌效果最好，去除較難，需無菌水刷洗8-10次。95%酒精——灼燒表面不同植物、部位、組織年齡及環(huán)境狀況——滅菌時間不同3無菌操作無菌操作程序：（1）滅菌（2）刷洗（3）切割（4）接種二、培養(yǎng)基的成分及作用

完善的培養(yǎng)基配方：包括大量元素、微量元素、鐵鹽溶液、碳源、有機附加成分、植物激素、瓊脂等。配置中注意8個字：大、微、鐵、有、糖、瓊、激、PH。（一）大量元素植物所需元素，濃度大于0.5mmol/l的應屬于大量元素，而小于0.5mmol/l的則屬于微量元素。植物必需的元素在體內(nèi)的生理作用有四方面（P49）。MS培養(yǎng)基的特點：含有很高量的氮、鉀，尤其硝酸鹽的用量很大，還含有一定數(shù)量的銨鹽。（二）微量元素植物所需的微量元素至少包括鐵、硼、錳、鋅、鉬、銅、鈷和氯。微量元素的生理作用主要在酶的催化功能和細胞分化、維持細胞的完整機能等方面。（三）鐵鹽現(xiàn)在培養(yǎng)基中幾乎都采用Fe·EDTA形態(tài)的鐵鹽。鐵促進細胞分裂與伸長，還影響到葉綠體的結(jié)構(gòu)組成與葉綠素形成。（四）有機成分植物組織需要的一些維生素、氨基酸、肌醇，統(tǒng)稱為有機附加成分。維生素有維生素B1（硫胺素）、維生素B6（吡哆醇）、維生素B3或維生素PP（煙酸）、維生素B5（泛酸鈣）等氨基酸中最常用的是甘氨酸。（五）糖作用：碳源、碳骨架、提供底物與能源、維持一定的滲透勢。常用的碳源是蔗糖，濃度為2—5%。（六）瓊脂瓊脂是最好的固化劑，本身并不提供任何營養(yǎng)。用量一般在4-10g/l之間。（七）植物激素植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、脫落、衰老和休眠、萌發(fā)等許許多多的生理生化活動。常用種類有：1.生長素類：生理作用（P61），主要有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4-D等。脫分化：使已分化了的停止分裂的細胞失去分化特性，回復到未分化的幼齡狀態(tài)，恢復細胞分裂的能力。分化階段：使脫分化形成的處于幼齡狀態(tài)的細胞團或組織，再產(chǎn)生根、芽、胚狀體等有高層次組織結(jié)構(gòu)的特化細胞。2細胞分裂素生理作用：（P63）種類有芐基腺嘌呤（6-BA）、糠基腺嘌（激動素）等。3赤霉素（GA）生理作用：（P67）4脫落酸（ABA）生理作用：（P68）5乙烯生理作用：（P69）（八）PH值PH值即酸堿度培養(yǎng)的植物材料大多數(shù)要求弱酸性的環(huán)境，一般用1N的KOH或NaOH調(diào)整到PH5.6-5.8的范圍內(nèi)。（九）其它成分較常見的有活性炭、抗生素、抗氧化劑、誘變劑、生長抑制劑、促進細胞分裂和胚狀體同步發(fā)生的藥劑等。三、培養(yǎng)基的制備（一）儲備液的配置與保存將配方中的藥品一次稱量供一段時間使用，即配一些濃溶液，用時稀釋，這種濃溶液就是儲備液或母液。一般大量元素比使用液濃度高10-100倍，微量元素等可高200-1000倍。表4-1MS培養(yǎng)基儲備液的配制成分用量（mg/l)每升培養(yǎng)基取用量（ml）儲備液1（大量元素）NH4NO3KNO3CaCl2.2H2OMgSO4.7H2OKH2PO4330003800088007400340050儲備液2（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O16612404460172050555儲備液3（鐵鹽）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O550074605儲備液4（有機成分）肌醇煙酸鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸20000100100204005（二）培養(yǎng)基的配制1.先在潔凈的不銹鋼量杯里放入約750ml蒸餾水，加入所需要的瓊脂和糖。2.加入各種母液，按需要加入植物激素2.4-D1mg/l。3.加蒸餾水將最終體積調(diào)整到1l。4.充分混合好以后，用1NKOH（或NaOH)調(diào)整PH值到5.8左右。5.趁熱將培養(yǎng)基倒入三角燒瓶中。6.加蓋牛皮紙。7.高壓滅菌后取出。配置1升培養(yǎng)基分工：稱重：1瓊脂8克；2蔗糖30克；3肌醇100毫克。母液：大量元素100ml、微量元素10ml、有機物質(zhì)10ml、鐵鹽10ml、生長素2.4-D10ml配置75%酒精500ml裁牛皮紙準備：培養(yǎng)皿1副/人；解剖刀柄2把；鑷子（大、?。└鲀砂?；三角燒瓶50ml