缺血再灌注損傷與細胞凋亡課件

美國科學情報研究所（ISI）1997年SCI（ScienceCitationIndex）收錄及引用論文檢索，全世界自然科學研究中論文發(fā)表最集中的三個領域分別是：細胞信號轉導（signaltransduction）；細胞凋亡（cellapoptosis）；基因組與后基因組學研究（genomeandpost-genomicanalysis）。 美國科學情報研究所（ISI）1997年SCI（Scien1缺血再灌注損傷與細胞凋亡課件2內容細胞凋亡的概念及其生物學意義細胞凋亡的形態(tài)學和生物化學特征細胞凋亡的分子調控機理細胞凋亡與疾病缺血再灌注損傷缺血再灌注損傷與細胞凋亡研究內容細胞凋亡的概念及其生物學意義3細胞凋亡(Apoptosis)早在1972年Kerr等已發(fā)現(xiàn)從細胞形態(tài)、超微結構和生化變化等方面來分析，細胞有二種死亡形式,一種是早被熟知的細胞壞死（Necrosis），另一種是新提出的程序性細胞死亡（Programmedcelldeath,PCD）學說。但該學說到九十年代初才進入研究高潮，進展極快，現(xiàn)在普遍稱之為細胞凋亡（Apoptosis）細胞凋亡由體內外因素觸發(fā)細胞內預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程是一個由基因調控的細胞主動結束生命的過程細胞凋亡(Apoptosis)早在1972年Kerr等已發(fā)現(xiàn)4細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別—————————————————————————————————————————————————————————壞死凋亡1.性質2.誘導因素強烈刺激，隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點4.形態(tài)變化6.DNA電泳5.炎癥反應7.凋亡小體8.基因調控被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能細胞結構全面溶解、破壞、細胞腫脹胞膜及細胞器相對完整細胞皺縮，核固縮彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-200bp），電泳呈“梯”狀條帶溶酶體破裂，局部炎癥反應溶酶體相對完整，局部無炎癥反應有病理性，非特異性生理性或病理性，特異性無有無細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別——————————————————5缺血再灌注損傷與細胞凋亡課件6例如蝌蚪尾的消失脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育發(fā)育過程中手和足的成形過程例如7細胞凋亡的生理意義確保正常發(fā)育、生長維持內環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮積極的防御功能細胞凋亡是正常的生理過程，但是凋亡可能會引起疾病發(fā)生。因此，近年來對于細胞凋亡的研究，已成為自然科學界的關注熱點。細胞凋亡的生理意義確保正常發(fā)育、生長8形態(tài)學特征

凋亡的起始：細胞器、染色質等開始變化凋亡小體的形成：質膜包裹染色質和細胞器凋亡小體的消化：被吞噬細胞消化形態(tài)學特征凋亡的起始：細胞器、染色質等開始變化9生物化學特征胞漿內Ca2+濃度升高。細胞內活性氧增多。質膜通透性變大。DNA內切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成180~200bp為基數(shù)的有序片段。Ⅱ型谷氨酰胺轉移酶和需鈣蛋白酶（Calpain）活性升高。典型凋亡細胞DNA瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)梯狀條帶生物化學特征胞漿內Ca2+濃度升高。典型凋亡細胞DNA瓊脂糖10細胞因子：IL-2，神經(jīng)生長因子某些激素某些二價金屬陽離子、藥物凋亡相關因素誘導性因素：激素和生長因子失衡理化因素：高溫、強酸、強堿、抗癌藥物免疫性因素微生物學因素：細菌、病毒抑制性因素凋亡的基因調控抑制凋亡基因：Bcl-2，EIB，IAP促進凋亡基因：P53，Bax，ICE雙向調控基因：c-myc，Bcl-x細胞因子：IL-2，神經(jīng)生長因子凋亡相關因素誘導性因素：激素11Caspase家族凋亡的執(zhí)行者Caspase活性位點是半胱氨酸，裂解靶蛋白位點是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase特點：前體形式存在,級聯(lián)反應作用：滅活凋亡抑制物水解蛋白質結構，形成凋亡小體水解凋亡相關活性蛋白Caspase家族12使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD破壞細胞結構，如Lamina將調節(jié)區(qū)與催化區(qū)分離，使蛋白失活，如GelsolinCaspase如何殺死細胞？使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICADCaspase如何殺13Hengartner,M.O.2000.Nature.407:770.Green,D.andKroemer,G.1998.TrendsCellBiol.

8:267.MitochondrialPathwayDeathReceptorPathwayFasLCaspase3DDDDFas/Apo1/CD95FADDProcaspase8Caspase8BIDoxidantsceramideothersBcl-2DCytochromecdATPProcaspase9Apaf-1dATPApaf-1Caspase9Procaspase3apoptosomeDNAdamageCellulartargets細胞凋亡的途徑Hengartner,M.O.2000.Nature.14細胞凋亡發(fā)生的時間過程細胞凋亡發(fā)生的時間過程15細胞凋亡不足：腫瘤，自身免疫病細胞凋亡過度：心肌缺血，心力衰竭，神經(jīng)元退行性疾病，病毒感染凋亡與疾病細胞凋亡不足：凋亡與疾病16NATURECELLBIOLOGYVOL4JUNE2002細胞凋亡與腫瘤NATURECELLBIOLOGYVOL4JUNE17細胞凋亡在疾病防治中的意義可以通過不同的手段在不同的階段進行干預而治療疾病合理利用凋亡相關因素干預凋亡信號轉導調節(jié)凋亡相關基因控制凋亡相關酶學機制細胞凋亡在疾病防治中的意義18動脈粥樣硬化與細胞凋亡人AS冠狀動脈和頸動脈病變內膜中TUNEL細胞數(shù)(346%)明顯高于無病變的內膜(83%)；AS斑塊中可檢出核苷酸片段，而無AS的血管未檢出此種片段。Han等觀察35例人AS冠狀動脈標本，25例證實有細胞凋亡。Isner等報道人原發(fā)性AS病變中細胞凋亡檢出率：冠狀動脈29%，周圍動脈未為43%動物實驗也證明AS斑塊中有細胞凋亡發(fā)生動脈粥樣硬化與細胞凋亡人AS冠狀動脈和頸動脈病變內膜中TUN19Hegyi等研究提示AS發(fā)病中某些細胞的增殖和凋亡活性都是增高的細胞凋亡可能是AS病變中細胞死亡的主要方式，SMC凋亡失調和凋亡小體消除不足可能是加劇AS發(fā)展的重要因素AS病變中細胞凋亡發(fā)生率雖然較低，但可致細胞數(shù)減少并貫穿于整個病變發(fā)展過程中纖維帽中細胞凋亡增加可降低斑塊穩(wěn)定性而致急性臨床事件發(fā)生Hegyi等研究提示AS發(fā)病中某些細胞的增殖和凋亡活性都是增20高血壓病Hemet等報道，遺傳性高血壓病鼠的心、腦、腎組織中實質細胞凋亡增多凋亡誘導劑對自發(fā)性高血壓病大鼠主動脈SMC的作用明顯強于正常血壓鼠，提示原發(fā)性高血壓病的發(fā)病和高血壓所致靶器官損害的機制可能與細胞凋亡有關。心臟壓力符合增加可誘發(fā)心肌細胞凋亡增加，隨后發(fā)生心肌肥大，說明凋亡可能參與高血壓心室重構的發(fā)病過程。高血壓病Hemet等報道，遺傳性高血壓病鼠的心、腦、腎組織中21心肌病和心肌炎原發(fā)性心肌病終末期心衰患者心肌中脫氧核糖核酸酶水平升高快速起搏心室導致的擴張型心肌病狗心肌中Fas表達增加，心肌細胞凋亡增加上述研究提示，心肌細胞凋亡可能是心肌病中心肌細胞數(shù)減少的主要機制，病毒性心肌炎可能是通過激發(fā)心肌細胞凋亡進而發(fā)展成心肌病的心肌病和心肌炎原發(fā)性心肌病終末期心衰患者心肌中脫氧核糖核酸酶22心律失常James用電鏡觀察了從反復發(fā)作室性心率失常伴暈厥的長 QT綜合癥患者切除下來的竇房結，發(fā)現(xiàn)有典型的細胞凋亡，認為其心率失常反復發(fā)作可能是細胞凋亡反復發(fā)生所致房室交界區(qū)組織的細胞凋亡在維持心電穩(wěn)定方面起有益作用，但如果細胞凋亡過渡或不足則會引起有害作用心律失常James用電鏡觀察了從反復發(fā)作室性心率失常伴暈厥的23房室結的殘存性胎塊(persistingfetalpocket)退化清除不全可能使殘留的肌細胞具有異常搞的興奮性而產(chǎn)生自律性心率失常胎兒出生后如果房室結組織退化消除過度，則會導致正常房室傳導途徑的中斷有人觀察到，心率失常患者致心率失常的內膜下心肌有凋亡現(xiàn)象。故細胞凋亡失平衡可能是某些心率失常的發(fā)病基礎房室結的殘存性胎塊(persistingfetalpoc24心力衰竭心肌細胞凋亡參與心衰的心肌重構，是心衰發(fā)病學上的新觀點。在擴張性心肌病和缺血性心臟病的充血性心衰患者和動物均已證實有心肌細胞凋亡。心肌細胞凋亡使心肌數(shù)目逐漸減少，纖維化進行性加重，從而心功能不全進行性發(fā)展心力衰竭心肌細胞凋亡參與心衰的心肌重構，是心衰發(fā)病學上的新觀25缺血再灌注損傷缺血組織恢復血液灌注后反而引起損傷加重的現(xiàn)象。1935年tennant和wiggers室顫與再灌注1943年harris再灌注心率失常概念提出1960年jennings心肌再灌注損傷概念提出1980年以來再灌注損傷研究興起缺血再灌注損傷缺血組織恢復血液灌注后反而引起損傷加重的現(xiàn)象。26再灌注損傷與臨床冠脈解痙（心絞痛擴冠后）心腦血管栓塞再通（介入治療、溶栓治療、自然再通）心肺手術體外循環(huán)后心肺復蘇各種動脈搭橋術斷肢再植、器官移植再灌注損傷與臨床冠脈解痙（心絞痛擴冠后）27缺血再灌注損傷發(fā)生機制自由基損傷1979年fridovich鈣超載1966年zimmerman和hulsmann白細胞介導損傷1984年mullane缺血再灌注損傷發(fā)生機制自由基損傷1979年fridovic28什么是自由基自由基是指外層軌道上具有一個或多個不配對電子的原子、原子團或分子的總稱。自由基主要包括：脂自由基、氧自由基由氧衍生的自由基叫氧自由基。氧自由基與多聚不飽和脂肪酸作用后生成的中間代謝產(chǎn)物烷自由基、烷氧自由基、烷過氧自由基等均屬脂自由基什么是自由基自由基是指外層軌道上具有一個或多個不配對電子的原29活性氧代謝物是氧的一些代謝產(chǎn)物和其衍生的含氧物質，由于均含有氧，化學性質活潑，成為ROS活性氧代謝物是氧的一些代謝產(chǎn)物和其衍生的含氧物質，由于均含有30氧自由基的清除生理情況下，僅有少量氧自由基生成，同時細胞內存在有SOD、谷胱甘肽過氧化物酶以及過氧化氫酶等抗氧化酶類可以及時清除它們維生素E、C、半胱氨酸、谷胱甘肽等也有助于清除自由基朝氧化物岐化酶的種類氧自由基的清除生理情況下，僅有少量氧自由基生成，同時細胞內存31缺血再灌注時自由基的來源黃嘌呤氧化酶形成增多中性粒細胞呼吸爆發(fā)線粒體呼吸鏈電子傳遞異常兒茶酚胺的自身氧化花生四烯酸代謝缺血再灌注時自由基的來源黃嘌呤氧化酶形成增多32自由基的損傷作用膜脂質損傷蛋白質損傷核酸損傷細胞成分間的廣泛交聯(lián)炎癥介質產(chǎn)生自由基的損傷作用膜脂質損傷33鈣超載1966年zimmerman細胞內Ca2+大量聚集超過正常限量的現(xiàn)象叫鈣超載。鈣超載發(fā)生機制：Na+-Ca2+交換增加細胞膜通透性增高，Ca2+內流線粒體受損，鈣泵轉運障礙鈣超載1966年zimmerman細胞內Ca2+大量聚集超34Na+-Ca2+交換增加缺血缺氧時能量供應不足，鈉泵轉運障礙，胞內Na+濃度升高。缺血期無氧代謝，酸性代謝產(chǎn)物積聚，細胞內pH降低(酸中毒)，再灌注時細胞外H+迅速帶走，形成細胞內外H+濃度梯度，Na+-H+交換，使胞內Na+增加。再灌注時隨血液帶來大量Ca2+，通過Na+-Ca2+交換機制使細胞外鈣大量內流而造成細胞鈣超載Na+-Ca2+交換增加缺血缺氧時能量供應不足，鈉泵轉運障35細胞膜通透性增高，Ca2+內流Na+-Ca2+交換使胞內鈣增加，進而激活磷脂酶，降解膜磷脂，提高細胞膜通透性，形成惡性循環(huán)。再灌注時氧自由基大量產(chǎn)生，引發(fā)細胞膜的脂質過氧化，膜受損，通透性增高。細胞膜通透性增高，Ca2+內流Na+-Ca2+交換使胞內36線粒體受損，鈣泵轉運障礙缺血時線粒體結構的功能障礙出現(xiàn)最早，再灌注損傷加重，ATP生成障礙。ATP減少使肌膜及肌漿網(wǎng)膜鈣泵功能障礙。鈣泵不能排出和攝取胞漿中過多的鈣，胞漿中游離鈣濃度增加而鈣超載。胞漿中過多的鈣最終形成磷酸鹽沉積于線粒體，對線粒體結構及功能進一步破壞。線粒體受損，鈣泵轉運障礙缺血時線粒體結構的功能障礙出現(xiàn)最早，37鈣超載損傷的機制導致線粒體功能障礙，ATP生成減少Ca2+激活磷脂酶，促進膜磷脂水解，造成細胞膜及細胞器質膜受損引起心率失常，通過Na+-Ca2+交換形成一過性內向離子流，在心肌動作電位后形成短暫除極（遲后除極）而引起心率失常。鈣超載損傷的機制導致線粒體功能障礙，ATP生成減少384.促進氧自由基生成：鈣超負荷使鈣敏蛋白水解酶活性增高，促使黃嘌呤脫氫酶轉變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，使自由基生成增加。5.使肌原纖維攣縮、斷裂：生物膜機械損傷，細胞骨架破壞4.促進氧自由基生成：鈣超負荷使鈣敏蛋白水解酶活性增高，促39白細胞介導損傷1984年mullane中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制白細胞介導損傷1984年mullane中性粒細胞再灌注區(qū)增40中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制心臟缺血期，血管內皮損傷，釋放PAF、LTB4、補體等活性物質，對中性粒細胞起趨化作用。再灌注后，自由基可以引起內皮細胞膜磷脂降解，花生四烯酸代謝產(chǎn)物增多，起趨化作用。中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制心臟缺血期，血管內皮損傷，釋放41中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制白細胞本身釋放具有趨化作用的炎性介質，如PAF、LTB4等，使微循環(huán)中白細胞進一步增加。中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制白細胞本身釋放具有趨化作用的炎42中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制自由基和各種炎癥介質誘導內皮細胞和白細胞表面粘附分子表達，促進二者相互作用。如imegrin，selectin、intracellularadhesionmolecule，從而使中性粒細胞粘附、聚集、游離出血管進入組織，中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制自由基和各種炎癥介質誘導內皮細43白細胞與內皮細胞的相互作用滾動（rolling）：在趨化因子作用下，白細胞大量隨血流到達再灌注區(qū)，白細胞表面的L-selectin與內皮細胞表面P-selectin、E-selectin作用，白細胞流動速度下降，在血管內皮表面發(fā)生滾動。白細胞與內皮細胞的相互作用滾動（rolling）：在趨化因子44粘著（adherence）：白細胞表面imegrinCD11/CD18與內皮細胞表面intracellularadhesionmolecule相互作用，使?jié)L動停止，白細胞與內皮粘著固定。白細胞通過內皮進入組織間。粘著（adherence）：白細胞表面imegrinCD145白細胞在缺血-再灌注損傷中的作用釋放自由基被激活的中性粒細胞脫顆粒，大量釋放蛋白水解酶類如彈性蛋白酶、膠原酶、磷脂酶、脂氧酶等。白細胞在缺血-再灌注損傷中的作用釋放自由基46白細胞活化，產(chǎn)生PAF、LTB4、TNF-、IL-1、IL-8、IFN-等炎癥介質引起無復流現(xiàn)象（當缺血組織恢復血液供應后，部分缺血區(qū)組織并不能得到充分的血液灌流，成為無復流）。白細胞活化，產(chǎn)生PAF、LTB4、TNF-、IL-1、IL47各器官的再灌注損傷心臟缺血再灌注損傷腦缺血再灌注損傷腸缺血再灌注損傷各器官的再灌注損傷心臟缺血再灌注損傷48心臟缺血再灌注損傷代謝改變超微結構變化臨床表現(xiàn)心臟缺血再灌注損傷代謝改變49代謝改變ATP、CP大量分解，能量供應不足ATP分解產(chǎn)物聚集、流失：AMP、肌苷、腺苷、次黃嘌呤酸性代謝產(chǎn)物聚集，細胞內酸中毒細胞內Na+、Ca2+增多，細胞水腫代謝改變ATP、CP大量分解，能量供應不足50超微結構改變細胞腫脹，膜結構破壞線粒體損傷：極度腫脹、嵴斷裂、溶解，空泡形成、基質內致密物增多。心肌攣縮，出現(xiàn)過度收縮帶（肌纖維過度收縮，肌節(jié)明、暗帶分界不清，粗細肌絲過度重合）甚至肌絲斷裂、溶解，肌原纖維結構破壞超微結構改變細胞腫脹，膜結構破壞51臨床及大體表現(xiàn)心臟功能下降-心肌頓抑再灌注心率失常：室性心動過速、室顫心肌細胞死亡-心肌梗塞細胞壞死細胞凋亡臨床及大體表現(xiàn)心臟功能下降-心肌頓抑52心肌頓抑指心肌短暫缺血后，當冠脈血流恢復正?；蚪咏r，心肌形態(tài)和超微結構正常，但心功能和心肌代謝異常卻長時間持續(xù)存在的狀態(tài)。缺血后心室功能障礙“缺血心肌血流恢復與機械功能恢復不匹配”。心肌頓抑指心肌短暫缺血后，當冠脈血流恢復正?；蚪咏r，心53

特點：發(fā)生于短時缺血(2-20min)再灌注后心功能障礙是可逆的局部心肌血流正?；驇缀跽Ｐ募【植磕芰课镔|儲備降低特點：54

機制：氧自由基損傷鈣超載心肌能量(缺氧)利用障礙冠脈內皮細胞功能失調熱休克蛋白釋放機制：55心肌冬眠指由于冠狀動脈血流減少或/心肌需氧量增加，引起靜息時左室功能持久性減退，當心肌再灌注或氧需求減少，氧供求重新恢復平衡后，心肌功能可完全恢復正常的現(xiàn)象。心肌血流與機械功能的低匹配。心肌冬眠指由于冠狀動脈血流減少或/心肌需氧量增加，引起靜息時56

特點：持續(xù)性收縮功能障礙心功能障礙是可逆的降低的心肌血流尚足以維持組織存活糖代謝正常甚至略有增高特點：57

機制建立側枝循環(huán)心肌低代謝：心臟缺血后，心肌通過主動調節(jié)機制降低心功能，進而降低缺血心肌對代謝底物的需求量。此時殘余血流所能提供的營養(yǎng)物甚至可以超過心肌對代謝底物的需求量，能量物質產(chǎn)生大于消耗，而防止心肌壞死。機制58多發(fā)生在冠脈搭橋手術前后，是一種心肌的保護性機制。主要特征：血流減少不嚴重但持續(xù)時間長的供養(yǎng)量減少，心肌需要亦隨之減少，在低水平維持一個脆弱得到心肌代謝平衡，即維持最低的功能狀態(tài)。，繼之則會引起緩慢的心肌功能失代償表現(xiàn)。多發(fā)生在冠脈搭橋手術前后，是一種心肌的保護性機制。59當冠脈血供改善或心肌需氧量降低達到供需平衡時，心肌可能部分或全部恢復。心肌頓抑需與心肌缺血或梗塞過程中的收縮功能異常相區(qū)別：頓抑的心肌在血流恢復后，功能可以恢復，但壞死的心肌不能恢復。當冠脈血供改善或心肌需氧量降低達到供需平衡時，心肌可能部分或60腦的缺血再灌注損傷腦一旦缺血時間較長即可引起嚴重的不可逆損傷。腦缺血時生物電發(fā)生改變，出現(xiàn)病理性慢波，缺血一定時間后再灌注，慢波持續(xù)并加重。腦的缺血再灌注損傷腦一旦缺血時間較長即可引起嚴重的不可逆損傷61腦富含磷脂，缺血后游離脂肪酸明顯增加。大鼠斷頭1min后腦內游離脂肪酸含量增加2倍以上。隨缺血時間延長持續(xù)增加，增加最顯著的是花生四烯酸及硬脂酸。腦富含磷脂，缺血后游離脂肪酸明顯增加。62再灌注后游離脂肪酸的增加更為顯著，恢復血流90min，反而有更多的游離脂肪酸貯留。血流重新恢復時游離脂肪酸的增加，是由于來源于游離脂肪酸的過氧化物進一步損傷膜的同時，由cAMP介導膜磷脂繼續(xù)降解的結果（cAMP激活磷脂酶）。再灌注后游離脂肪酸的增加更為顯著，恢復血流90min，反而有63腦缺血后短時間內ATP，CP、葡萄糖、糖原等均減少，乳酸明顯增加。結扎沙鼠兩側頸總動脈致缺血30min，cAMP增加2.2倍，cGMP減少53%。恢復血流15min后cAMP進一步增加，為缺血前21倍，cGMP進一步下降21%。腦缺血后短時間內ATP，CP、葡萄糖、糖原等均減少，乳酸明顯64上述研究提示：缺血及再灌注時過氧化反應增強，因cAMP上升激活磷脂酶，降解磷脂，游離脂肪酸增多；缺血后血流再灌注時，自由基產(chǎn)生增加，與游離脂肪酸作用而使過氧化脂質生成增多，引起細胞和組織的損傷。上述研究提示：缺血及再灌注時過氧化反應增強，因cAMP上升激65缺血時腦的最明顯的組織學變化為腦水腫及腦細胞壞死（二者?；橐蚬ＤX水腫是各種腦血管意外的常見病理過程。缺血及再灌注過程腫腦含水量持續(xù)增加。缺血時腦的最明顯的組織學變化為腦水腫及腦細胞壞死（二者?；?6缺血時水中的產(chǎn)生是膜脂降解，游離脂肪酸增加的結果。細胞膜脂質過氧化使膜結構破壞，從而使再灌注后水中持續(xù)加重。缺血時水中的產(chǎn)生是膜脂降解，游離脂肪酸增加的結果。67腸缺血再灌注損傷腸管缺血時，液體通過毛細血管濾出而形成間質水中。缺血后再灌注，腸管毛細血管通透性更加升高。嚴重腸管缺血所致?lián)p傷的形態(tài)學特征變化為粘膜病變（粘膜損傷）。人和動物在出血性休克及局部腸管缺血后均出現(xiàn)腸粘膜損傷。腸缺血再灌注損傷腸管缺血時，液體通過毛細血管濾出而形成間質水68粘膜損傷的特點：廣泛的上皮與絨毛分離，上皮壞死，固有層破壞，出血及潰瘍形成；進而致功能障礙，如吸收障礙及粘膜屏障的通透性增高，大分子得以通過。粘膜損傷的特點：廣泛的上皮與絨毛分離，上皮壞死，固有層破壞，69缺血再灌注損傷的防治縮短臟器缺血時間采用低壓、低溫低鈣再灌注液清除自由基及活性氧鈉鈣交換體抑制劑的應用抑制中性粒細胞藥物補充能量及促進能量生成輔助治療，使用預適應等措施缺血再灌注損傷的防治縮短臟器缺血時間70

美國科學情報研究所（ISI）1997年SCI（ScienceCitationIndex）收錄及引用論文檢索，全世界自然科學研究中論文發(fā)表最集中的三個領域分別是：細胞信號轉導（signaltransduction）；細胞凋亡（cellapoptosis）；基因組與后基因組學研究（genomeandpost-genomicanalysis）。 美國科學情報研究所（ISI）1997年SCI（Scien71缺血再灌注損傷與細胞凋亡課件72內容細胞凋亡的概念及其生物學意義細胞凋亡的形態(tài)學和生物化學特征細胞凋亡的分子調控機理細胞凋亡與疾病缺血再灌注損傷缺血再灌注損傷與細胞凋亡研究內容細胞凋亡的概念及其生物學意義73細胞凋亡(Apoptosis)早在1972年Kerr等已發(fā)現(xiàn)從細胞形態(tài)、超微結構和生化變化等方面來分析，細胞有二種死亡形式,一種是早被熟知的細胞壞死（Necrosis），另一種是新提出的程序性細胞死亡（Programmedcelldeath,PCD）學說。但該學說到九十年代初才進入研究高潮，進展極快，現(xiàn)在普遍稱之為細胞凋亡（Apoptosis）細胞凋亡由體內外因素觸發(fā)細胞內預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程是一個由基因調控的細胞主動結束生命的過程細胞凋亡(Apoptosis)早在1972年Kerr等已發(fā)現(xiàn)74細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別—————————————————————————————————————————————————————————壞死凋亡1.性質2.誘導因素強烈刺激，隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點4.形態(tài)變化6.DNA電泳5.炎癥反應7.凋亡小體8.基因調控被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能細胞結構全面溶解、破壞、細胞腫脹胞膜及細胞器相對完整細胞皺縮，核固縮彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-200bp），電泳呈“梯”狀條帶溶酶體破裂，局部炎癥反應溶酶體相對完整，局部無炎癥反應有病理性，非特異性生理性或病理性，特異性無有無細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別——————————————————75缺血再灌注損傷與細胞凋亡課件76例如蝌蚪尾的消失脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育發(fā)育過程中手和足的成形過程例如77細胞凋亡的生理意義確保正常發(fā)育、生長維持內環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮積極的防御功能細胞凋亡是正常的生理過程，但是凋亡可能會引起疾病發(fā)生。因此，近年來對于細胞凋亡的研究，已成為自然科學界的關注熱點。細胞凋亡的生理意義確保正常發(fā)育、生長78形態(tài)學特征

凋亡的起始：細胞器、染色質等開始變化凋亡小體的形成：質膜包裹染色質和細胞器凋亡小體的消化：被吞噬細胞消化形態(tài)學特征凋亡的起始：細胞器、染色質等開始變化79生物化學特征胞漿內Ca2+濃度升高。細胞內活性氧增多。質膜通透性變大。DNA內切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成180~200bp為基數(shù)的有序片段。Ⅱ型谷氨酰胺轉移酶和需鈣蛋白酶（Calpain）活性升高。典型凋亡細胞DNA瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)梯狀條帶生物化學特征胞漿內Ca2+濃度升高。典型凋亡細胞DNA瓊脂糖80細胞因子：IL-2，神經(jīng)生長因子某些激素某些二價金屬陽離子、藥物凋亡相關因素誘導性因素：激素和生長因子失衡理化因素：高溫、強酸、強堿、抗癌藥物免疫性因素微生物學因素：細菌、病毒抑制性因素凋亡的基因調控抑制凋亡基因：Bcl-2，EIB，IAP促進凋亡基因：P53，Bax，ICE雙向調控基因：c-myc，Bcl-x細胞因子：IL-2，神經(jīng)生長因子凋亡相關因素誘導性因素：激素81Caspase家族凋亡的執(zhí)行者Caspase活性位點是半胱氨酸，裂解靶蛋白位點是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase特點：前體形式存在,級聯(lián)反應作用：滅活凋亡抑制物水解蛋白質結構，形成凋亡小體水解凋亡相關活性蛋白Caspase家族82使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD破壞細胞結構，如Lamina將調節(jié)區(qū)與催化區(qū)分離，使蛋白失活，如GelsolinCaspase如何殺死細胞？使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICADCaspase如何殺83Hengartner,M.O.2000.Nature.407:770.Green,D.andKroemer,G.1998.TrendsCellBiol.

8:267.MitochondrialPathwayDeathReceptorPathwayFasLCaspase3DDDDFas/Apo1/CD95FADDProcaspase8Caspase8BIDoxidantsceramideothersBcl-2DCytochromecdATPProcaspase9Apaf-1dATPApaf-1Caspase9Procaspase3apoptosomeDNAdamageCellulartargets細胞凋亡的途徑Hengartner,M.O.2000.Nature.84細胞凋亡發(fā)生的時間過程細胞凋亡發(fā)生的時間過程85細胞凋亡不足：腫瘤，自身免疫病細胞凋亡過度：心肌缺血，心力衰竭，神經(jīng)元退行性疾病，病毒感染凋亡與疾病細胞凋亡不足：凋亡與疾病86NATURECELLBIOLOGYVOL4JUNE2002細胞凋亡與腫瘤NATURECELLBIOLOGYVOL4JUNE87細胞凋亡在疾病防治中的意義可以通過不同的手段在不同的階段進行干預而治療疾病合理利用凋亡相關因素干預凋亡信號轉導調節(jié)凋亡相關基因控制凋亡相關酶學機制細胞凋亡在疾病防治中的意義88動脈粥樣硬化與細胞凋亡人AS冠狀動脈和頸動脈病變內膜中TUNEL細胞數(shù)(346%)明顯高于無病變的內膜(83%)；AS斑塊中可檢出核苷酸片段，而無AS的血管未檢出此種片段。Han等觀察35例人AS冠狀動脈標本，25例證實有細胞凋亡。Isner等報道人原發(fā)性AS病變中細胞凋亡檢出率：冠狀動脈29%，周圍動脈未為43%動物實驗也證明AS斑塊中有細胞凋亡發(fā)生動脈粥樣硬化與細胞凋亡人AS冠狀動脈和頸動脈病變內膜中TUN89Hegyi等研究提示AS發(fā)病中某些細胞的增殖和凋亡活性都是增高的細胞凋亡可能是AS病變中細胞死亡的主要方式，SMC凋亡失調和凋亡小體消除不足可能是加劇AS發(fā)展的重要因素AS病變中細胞凋亡發(fā)生率雖然較低，但可致細胞數(shù)減少并貫穿于整個病變發(fā)展過程中纖維帽中細胞凋亡增加可降低斑塊穩(wěn)定性而致急性臨床事件發(fā)生Hegyi等研究提示AS發(fā)病中某些細胞的增殖和凋亡活性都是增90高血壓病Hemet等報道，遺傳性高血壓病鼠的心、腦、腎組織中實質細胞凋亡增多凋亡誘導劑對自發(fā)性高血壓病大鼠主動脈SMC的作用明顯強于正常血壓鼠，提示原發(fā)性高血壓病的發(fā)病和高血壓所致靶器官損害的機制可能與細胞凋亡有關。心臟壓力符合增加可誘發(fā)心肌細胞凋亡增加，隨后發(fā)生心肌肥大，說明凋亡可能參與高血壓心室重構的發(fā)病過程。高血壓病Hemet等報道，遺傳性高血壓病鼠的心、腦、腎組織中91心肌病和心肌炎原發(fā)性心肌病終末期心衰患者心肌中脫氧核糖核酸酶水平升高快速起搏心室導致的擴張型心肌病狗心肌中Fas表達增加，心肌細胞凋亡增加上述研究提示，心肌細胞凋亡可能是心肌病中心肌細胞數(shù)減少的主要機制，病毒性心肌炎可能是通過激發(fā)心肌細胞凋亡進而發(fā)展成心肌病的心肌病和心肌炎原發(fā)性心肌病終末期心衰患者心肌中脫氧核糖核酸酶92心律失常James用電鏡觀察了從反復發(fā)作室性心率失常伴暈厥的長 QT綜合癥患者切除下來的竇房結，發(fā)現(xiàn)有典型的細胞凋亡，認為其心率失常反復發(fā)作可能是細胞凋亡反復發(fā)生所致房室交界區(qū)組織的細胞凋亡在維持心電穩(wěn)定方面起有益作用，但如果細胞凋亡過渡或不足則會引起有害作用心律失常James用電鏡觀察了從反復發(fā)作室性心率失常伴暈厥的93房室結的殘存性胎塊(persistingfetalpocket)退化清除不全可能使殘留的肌細胞具有異常搞的興奮性而產(chǎn)生自律性心率失常胎兒出生后如果房室結組織退化消除過度，則會導致正常房室傳導途徑的中斷有人觀察到，心率失?；颊咧滦穆适С５膬饶は滦募∮械蛲霈F(xiàn)象。故細胞凋亡失平衡可能是某些心率失常的發(fā)病基礎房室結的殘存性胎塊(persistingfetalpoc94心力衰竭心肌細胞凋亡參與心衰的心肌重構，是心衰發(fā)病學上的新觀點。在擴張性心肌病和缺血性心臟病的充血性心衰患者和動物均已證實有心肌細胞凋亡。心肌細胞凋亡使心肌數(shù)目逐漸減少，纖維化進行性加重，從而心功能不全進行性發(fā)展心力衰竭心肌細胞凋亡參與心衰的心肌重構，是心衰發(fā)病學上的新觀95缺血再灌注損傷缺血組織恢復血液灌注后反而引起損傷加重的現(xiàn)象。1935年tennant和wiggers室顫與再灌注1943年harris再灌注心率失常概念提出1960年jennings心肌再灌注損傷概念提出1980年以來再灌注損傷研究興起缺血再灌注損傷缺血組織恢復血液灌注后反而引起損傷加重的現(xiàn)象。96再灌注損傷與臨床冠脈解痙（心絞痛擴冠后）心腦血管栓塞再通（介入治療、溶栓治療、自然再通）心肺手術體外循環(huán)后心肺復蘇各種動脈搭橋術斷肢再植、器官移植再灌注損傷與臨床冠脈解痙（心絞痛擴冠后）97缺血再灌注損傷發(fā)生機制自由基損傷1979年fridovich鈣超載1966年zimmerman和hulsmann白細胞介導損傷1984年mullane缺血再灌注損傷發(fā)生機制自由基損傷1979年fridovic98什么是自由基自由基是指外層軌道上具有一個或多個不配對電子的原子、原子團或分子的總稱。自由基主要包括：脂自由基、氧自由基由氧衍生的自由基叫氧自由基。氧自由基與多聚不飽和脂肪酸作用后生成的中間代謝產(chǎn)物烷自由基、烷氧自由基、烷過氧自由基等均屬脂自由基什么是自由基自由基是指外層軌道上具有一個或多個不配對電子的原99活性氧代謝物是氧的一些代謝產(chǎn)物和其衍生的含氧物質，由于均含有氧，化學性質活潑，成為ROS活性氧代謝物是氧的一些代謝產(chǎn)物和其衍生的含氧物質，由于均含有100氧自由基的清除生理情況下，僅有少量氧自由基生成，同時細胞內存在有SOD、谷胱甘肽過氧化物酶以及過氧化氫酶等抗氧化酶類可以及時清除它們維生素E、C、半胱氨酸、谷胱甘肽等也有助于清除自由基朝氧化物岐化酶的種類氧自由基的清除生理情況下，僅有少量氧自由基生成，同時細胞內存101缺血再灌注時自由基的來源黃嘌呤氧化酶形成增多中性粒細胞呼吸爆發(fā)線粒體呼吸鏈電子傳遞異常兒茶酚胺的自身氧化花生四烯酸代謝缺血再灌注時自由基的來源黃嘌呤氧化酶形成增多102自由基的損傷作用膜脂質損傷蛋白質損傷核酸損傷細胞成分間的廣泛交聯(lián)炎癥介質產(chǎn)生自由基的損傷作用膜脂質損傷103鈣超載1966年zimmerman細胞內Ca2+大量聚集超過正常限量的現(xiàn)象叫鈣超載。鈣超載發(fā)生機制：Na+-Ca2+交換增加細胞膜通透性增高，Ca2+內流線粒體受損，鈣泵轉運障礙鈣超載1966年zimmerman細胞內Ca2+大量聚集超104Na+-Ca2+交換增加缺血缺氧時能量供應不足，鈉泵轉運障礙，胞內Na+濃度升高。缺血期無氧代謝，酸性代謝產(chǎn)物積聚，細胞內pH降低(酸中毒)，再灌注時細胞外H+迅速帶走，形成細胞內外H+濃度梯度，Na+-H+交換，使胞內Na+增加。再灌注時隨血液帶來大量Ca2+，通過Na+-Ca2+交換機制使細胞外鈣大量內流而造成細胞鈣超載Na+-Ca2+交換增加缺血缺氧時能量供應不足，鈉泵轉運障105細胞膜通透性增高，Ca2+內流Na+-Ca2+交換使胞內鈣增加，進而激活磷脂酶，降解膜磷脂，提高細胞膜通透性，形成惡性循環(huán)。再灌注時氧自由基大量產(chǎn)生，引發(fā)細胞膜的脂質過氧化，膜受損，通透性增高。細胞膜通透性增高，Ca2+內流Na+-Ca2+交換使胞內106線粒體受損，鈣泵轉運障礙缺血時線粒體結構的功能障礙出現(xiàn)最早，再灌注損傷加重，ATP生成障礙。ATP減少使肌膜及肌漿網(wǎng)膜鈣泵功能障礙。鈣泵不能排出和攝取胞漿中過多的鈣，胞漿中游離鈣濃度增加而鈣超載。胞漿中過多的鈣最終形成磷酸鹽沉積于線粒體，對線粒體結構及功能進一步破壞。線粒體受損，鈣泵轉運障礙缺血時線粒體結構的功能障礙出現(xiàn)最早，107鈣超載損傷的機制導致線粒體功能障礙，ATP生成減少Ca2+激活磷脂酶，促進膜磷脂水解，造成細胞膜及細胞器質膜受損引起心率失常，通過Na+-Ca2+交換形成一過性內向離子流，在心肌動作電位后形成短暫除極（遲后除極）而引起心率失常。鈣超載損傷的機制導致線粒體功能障礙，ATP生成減少1084.促進氧自由基生成：鈣超負荷使鈣敏蛋白水解酶活性增高，促使黃嘌呤脫氫酶轉變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，使自由基生成增加。5.使肌原纖維攣縮、斷裂：生物膜機械損傷，細胞骨架破壞4.促進氧自由基生成：鈣超負荷使鈣敏蛋白水解酶活性增高，促109白細胞介導損傷1984年mullane中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制白細胞介導損傷1984年mullane中性粒細胞再灌注區(qū)增110中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制心臟缺血期，血管內皮損傷，釋放PAF、LTB4、補體等活性物質，對中性粒細胞起趨化作用。再灌注后，自由基可以引起內皮細胞膜磷脂降解，花生四烯酸代謝產(chǎn)物增多，起趨化作用。中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制心臟缺血期，血管內皮損傷，釋放111中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制白細胞本身釋放具有趨化作用的炎性介質，如PAF、LTB4等，使微循環(huán)中白細胞進一步增加。中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制白細胞本身釋放具有趨化作用的炎112中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制自由基和各種炎癥介質誘導內皮細胞和白細胞表面粘附分子表達，促進二者相互作用。如imegrin，selectin、intracellularadhesionmolecule，從而使中性粒細胞粘附、聚集、游離出血管進入組織，中性粒細胞再灌注區(qū)增多的的機制自由基和各種炎癥介質誘導內皮細113白細胞與內皮細胞的相互作用滾動（rolling）：在趨化因子作用下，白細胞大量隨血流到達再灌注區(qū)，白細胞表面的L-selectin與內皮細胞表面P-selectin、E-selectin作用，白細胞流動速度下降，在血管內皮表面發(fā)生滾動。白細胞與內皮細胞的相互作用滾動（rolling）：在趨化因子114粘著（adherence）：白細胞表面imegrinCD11/CD18與內皮細胞表面intracellularadhesionmolecule相互作用，使?jié)L動停止，白細胞與內皮粘著固定。白細胞通過內皮進入組織間。粘著（adherence）：白細胞表面imegrinCD1115白細胞在缺血-再灌注損傷中的作用釋放自由基被激活的中性粒細胞脫顆粒，大量釋放蛋白水解酶類如彈性蛋白酶、膠原酶、磷脂酶、脂氧酶等。白細胞在缺血-再灌注損傷中的作用釋放自由基116白細胞活化，產(chǎn)生PAF、LTB4、TNF-、IL-1、IL-8、IFN-等炎癥介質引起無復流現(xiàn)象（當缺血組織恢復血液供應后，部分缺血區(qū)組織并不能得到充分的血液灌流，成為無復流）。白細胞活化，產(chǎn)生PAF、LTB4、TNF-、IL-1、IL117各器官的再灌注損傷心臟缺血再灌注損傷腦缺血再灌注損傷腸缺血再灌注損傷各器官的再灌注損傷心臟缺血再灌注損傷118心臟缺血再灌注損傷代謝改變超微結構變化臨床表現(xiàn)心臟缺血再灌注損傷代謝改變119代謝改變ATP、CP大量分解，能量供應不足ATP分解產(chǎn)物聚集、流失：AMP、肌苷、腺苷、次黃嘌呤酸性代謝產(chǎn)物聚集，細胞內酸中毒細胞內Na+、Ca2+增多，細胞水腫代謝改變ATP、CP大量分解，能量供應不足120超微結構改變細胞腫脹，膜結構破壞線粒體損傷：極度腫脹、嵴斷裂、溶解，空泡形成、基質內致密物增多。心肌攣縮，出現(xiàn)過度收縮帶（肌纖維過度收縮，肌節(jié)明、暗帶分界不清，粗細肌絲過度重合）甚至肌絲斷裂、溶解，肌原纖維結構破壞超微結構改變細胞腫脹，膜結構破壞121臨床及大體表現(xiàn)心臟功能下降-心肌頓抑再灌注心率失常：室性心動過速、室顫心肌細胞死亡-心肌梗塞細胞壞死細胞凋亡臨床及大體表現(xiàn)心臟功能下降-心肌頓抑122心肌頓抑指心肌短暫缺血后，當冠脈血流恢復正?；蚪咏r，心肌形態(tài)和超微結構正常，但心功能和心肌代謝異常卻長時間持續(xù)存在的狀態(tài)。缺血后心室功能障礙“缺血心肌血流恢復與機械功能恢復不匹配”。心肌頓抑指心肌短暫缺血后，當冠脈血流恢復正常或接近正常時，心123

特點：發(fā)生于短時缺血(2-20min)再灌注后心功能障礙是可逆的局部心肌血流正?；驇缀跽Ｐ募【植磕芰课镔|儲備