微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測(cè)概述

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測(cè)概述發(fā)布時(shí)間：2019-12-20（原創(chuàng)2019-12-19CMDE中國(guó)器審）

一、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）簡(jiǎn)介

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MicrosatelliteInstability，MSI），是指由于在DNA復(fù)制時(shí)插入或缺失突變引起的微衛(wèi)星（Microsatellite,MS）序列長(zhǎng)度改變的現(xiàn)象，常由錯(cuò)配修復(fù)功能（Mismatchrepair,MMR）缺陷引起。MS序列，是一些短而重復(fù)的DNA序列，一般由1～6個(gè)核苷酸組成，串聯(lián)重復(fù)排列，常見(jiàn)類(lèi)型為雙堿基CA/GA/GT或單堿基A/T等。MS序列可以位于基因的重要非編碼區(qū)，也可以位于基因的編碼區(qū)，多態(tài)性分布于整個(gè)基因組，個(gè)體差異大。

MSI現(xiàn)象于1993年被Jacobs等人在結(jié)直腸癌中首次發(fā)現(xiàn)。隨著針對(duì)MSI的研究深入，發(fā)現(xiàn)MSI現(xiàn)象不止存在于結(jié)直腸癌，在子宮內(nèi)膜癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌等實(shí)體瘤中均有發(fā)生。

二、MSI檢測(cè)方法

目前檢測(cè)癌細(xì)胞中的MSI時(shí)，既可以通過(guò)檢測(cè)MMR基因缺失來(lái)確定是否發(fā)生MSI，如依賴(lài)于免疫組化技術(shù)的蛋白水平檢測(cè)，也可以直接檢測(cè)MSI的序列變化，如PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）檢測(cè)等的分子水平檢測(cè)。

（一）免疫組化方法（Immunohistochemistry,IHC）

常見(jiàn)的方法為采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織中錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表達(dá)。任何一項(xiàng)錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)缺失，被定義為MSI，否則即為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。其中一個(gè)表達(dá)缺失則稱(chēng)為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-L)，2種或2種以上蛋白表達(dá)缺失為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)。

此方法檢測(cè)MSI相對(duì)較簡(jiǎn)單，成本較低。但存在一些問(wèn)題，如使用抗體的不一致、病理醫(yī)生的閱片標(biāo)準(zhǔn)不一致等。

（二）分子水平的檢測(cè)

1.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)

目前主要采用多重?zé)晒釶CR結(jié)合毛細(xì)管電泳的方法。通過(guò)PCR方法檢測(cè)特異的微衛(wèi)星重復(fù)序列擴(kuò)增判定MSI狀態(tài)，比較腫瘤患者的標(biāo)本組織與正常組織的位點(diǎn)突變情況。其比較的位點(diǎn)為美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）推薦的5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)：BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250。其中≥2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變判定為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H），僅1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變判定為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L），無(wú)位點(diǎn)改變判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。有研究認(rèn)為，二核苷酸重復(fù)序列的特異性和靈敏度比單核苷酸重復(fù)序列要低，因此關(guān)于最適合MSI檢測(cè)的位點(diǎn)仍存在爭(zhēng)議。Bacher等對(duì)266個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(其中包括單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸以及五核苷酸微衛(wèi)星位點(diǎn))檢測(cè)的敏感性及準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估，提出了Promega分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用五個(gè)單核苷酸微衛(wèi)星位點(diǎn)(BAT-25,BAT-26,NR-21,NR-24和MONO-27)及兩個(gè)五核苷酸微衛(wèi)星位點(diǎn)(PentaC和PentaD)檢測(cè)MSI。

大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MMR免疫組化檢測(cè)結(jié)果與MS的PCR檢測(cè)結(jié)果有高度關(guān)聯(lián)性，靈敏度92%，特異性可達(dá)100%。

該方法目前是檢測(cè)MSI的方法學(xué)“金標(biāo)準(zhǔn)”，但操作過(guò)程復(fù)雜，花費(fèi)較高，且在結(jié)果判斷中會(huì)碰到以下問(wèn)題，如熒光的過(guò)強(qiáng)或過(guò)少、非特異性峰、不顯著的峰大小改變，雜合性缺失等。

2.新一代測(cè)序方法（NextGenerationSequencing,NGS）

NGS又稱(chēng)為第二代測(cè)序技術(shù)，是一種高通量測(cè)序技術(shù)，能一次性對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條基因分子進(jìn)行序列測(cè)定。目前NGS方法已經(jīng)成為檢測(cè)MSI的新工具，其最大優(yōu)勢(shì)是可以實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)高通量檢測(cè)。紀(jì)念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（MemorialSloanKetteringCancerCenter，MSK）的一項(xiàng)研究使用NGS方法對(duì)12,288例實(shí)體瘤病人進(jìn)行檢測(cè)，判定MSI狀態(tài)，并用MSI-PCR/MMR-IHC進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)證明,NGS方法較MSI-PCR方法具有更高的敏感性。

三、MSI檢測(cè)的臨床意義

目前，有關(guān)MSI檢測(cè)的臨床意義有如下觀點(diǎn)：

（一）Lynch綜合征的篩查

Lynch綜合征，亦稱(chēng)遺傳非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC），是一種呈家族遺傳傾向的常染色體顯性遺傳病，由于MMR基因發(fā)生胚系突變所致，約占所有結(jié)直腸癌（Colorectalcarcinoma,CRC）3%～5%。Lynch綜合征最突出的特點(diǎn)之一是攜帶者本人或家族成員可發(fā)生CRC及其他多種Lynch相關(guān)腫瘤。MSI是Lynch綜合征的特征性分子，約90%以上表現(xiàn)出MSI。同時(shí)并不是所有的MSI均是Lynch綜合征，在散發(fā)性CRC中也存在10%～15%的MSI。

（二）MSI與結(jié)直腸癌的預(yù)后

臨床研究證實(shí)，MSI與結(jié)直腸癌的預(yù)后有著密切的關(guān)系。MSI-H結(jié)直腸癌患者相比MSS患者具有顯著的生存優(yōu)勢(shì)，臨床表現(xiàn)較差，但預(yù)后更好。研究證實(shí)，針對(duì)Ⅱ/Ⅲ期結(jié)直腸癌患者，MSI-H患者的總生存期及無(wú)病生存期明顯延長(zhǎng)。美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NationalComprehensiveCancerNetwork，NCCN）發(fā)布的結(jié)直腸癌指南，建議MSI檢測(cè)應(yīng)在所有結(jié)直腸癌史的病人中進(jìn)行。

（三）MSI與指導(dǎo)用藥

研究證實(shí)，MSI-H的結(jié)直腸癌Ⅱ期患者不能在氟尿嘧啶（5-FU）治療中獲益。同時(shí)因MSI-H的晚期結(jié)直腸癌患者通常具有PD-1及PDL-1等的高表達(dá)，可通過(guò)對(duì)PD-1/PD-L1的靶向抑制，促使機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊和殺滅腫瘤細(xì)胞。目前美國(guó)FDA已批準(zhǔn)PD-1免疫治療單抗pembrolizumab、ipilimumab和nivolumab用于具有錯(cuò)配修復(fù)缺陷（dMMR）/MSI-H表型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）的末線治療。除了mCRC的治療外，2017年5月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了PD-1抗體pembrolizumab用于治療成人和兒童具有dMMR/MSI-H表型的沒(méi)有其他治療選擇的，不可切除或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤患者。

《中國(guó)結(jié)直腸癌診療指南》（2010版）就明確了“Ⅱ期結(jié)直腸癌，有條件者建議檢測(cè)組織標(biāo)本MMR或MSI，如為dMMR或MSI-H，不推薦氟尿嘧啶類(lèi)藥物的單藥輔助化療”。在《中國(guó)結(jié)直腸癌診療指南》（2017版）的組織病理學(xué)檢查部分，增加了MMR或MSI的檢測(cè)作為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的推薦檢測(cè)方法，“確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌時(shí)，推薦檢測(cè)腫瘤組織K-ras及N-ras基因、BRAF基因、錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)或微衛(wèi)星狀態(tài)及其他相關(guān)基因狀態(tài)以指導(dǎo)進(jìn)一步治療?！?/p>

四、相關(guān)檢測(cè)產(chǎn)品介紹

目前國(guó)際上已上市的產(chǎn)品有：

（一）MSI-IVDKit(FALCO)

日本FALCO公司的MSI-IVDKit已獲得日本厚生勞動(dòng)省的批準(zhǔn)上市。該試劑盒采用PCR技術(shù)檢測(cè)癌組織中提取的基因組DNA中的MSI狀態(tài)，檢測(cè)7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（五個(gè)單核苷酸微衛(wèi)星位點(diǎn)BAT-25,BAT-26,NR-21,NR-24和MONO-27及兩個(gè)五核苷酸微衛(wèi)星位點(diǎn)PentaC和PentaD）。該產(chǎn)品由日本FALCO公司與Promega公司合作開(kāi)發(fā)，作為伴隨診斷試劑，用于指導(dǎo)PD-1抗體pembrolizumab在局部晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥患者中的應(yīng)用。

（二）VENTANAMMRIHCpanel

該產(chǎn)品采用IHC方法檢測(cè)經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋的結(jié)直腸癌組織切片中的四種MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，及BRAFV600E

突變蛋白。用于Lynch綜合征的輔助診斷，同時(shí)檢測(cè)BRAFV600E突變蛋白用于散發(fā)性CRC及Lynch綜合征的輔助鑒別診斷。此產(chǎn)品通過(guò)DeNovo途徑在美國(guó)上市。

（三）MSK-IMPACTTM

2017年11月16日，美國(guó)FDA批準(zhǔn)紀(jì)念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（MemorialSloanKetteringCancerCenter，簡(jiǎn)稱(chēng)MSK）基于二代測(cè)序技術(shù)的癌癥基因檢測(cè)分析平臺(tái)MSK-IMPACTTM。該產(chǎn)品能夠一次對(duì)病人腫瘤468個(gè)基因的突變進(jìn)行檢測(cè)，并且可以檢測(cè)MSI基因組特征。該產(chǎn)品僅限于在MSK中進(jìn)行使用，其檢測(cè)結(jié)果不與任何藥物聯(lián)用。該產(chǎn)品的MSI的檢測(cè)性能通過(guò)對(duì)10,900名患有66種不同類(lèi)型晚期實(shí)體瘤患者的研究進(jìn)行確定。

（四）FoundationOneCDx(F1CDx)

2017年11月30日，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了FoundationMedicine公司針對(duì)多種實(shí)體瘤的二代測(cè)序的體外檢測(cè)產(chǎn)品—FoundationOneCDx（F1CDx）。該產(chǎn)品僅允許在FoundationMedicine公司進(jìn)行檢測(cè)。這款產(chǎn)品除了可檢測(cè)5種腫瘤中的324個(gè)基因的突變，還可以檢測(cè)MSI和腫瘤突變負(fù)荷（TMB）兩個(gè)基因組特征，是FDA批準(zhǔn)的首款獲得突破性認(rèn)定的癌癥NGS體外診斷檢測(cè)產(chǎn)品。

五、總結(jié)

隨著研究的進(jìn)一步深入，MSI在腫瘤的發(fā)生機(jī)制中所起的作用越來(lái)越被人們所關(guān)注。雖然近年來(lái)MSI的檢測(cè)在臨床應(yīng)用方面被日趨關(guān)注，但是國(guó)內(nèi)還未有注冊(cè)獲批的產(chǎn)品。2018年已有MSI檢測(cè)試劑盒通過(guò)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局的創(chuàng)新醫(yī)療器械特別審查程序，該產(chǎn)品采用熒光PCR-毛細(xì)管電泳法。

參考文獻(xiàn)：

[1]LindorNM,BurgartLJ,LeontovichO,etal.Immunohistochemistryversusmicrosatelliteinstabillitytestinginphenotypingcolorectaltumors[J].JournalofClinicalOncologyOfficialJournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology,2002,20(4):1043;

[2]BacherJW,FlanaganLA,SmalleyRL,etal.DevelopmentofafluorescentmultiplexassayfordetectionofMSI-hightumors.DiseaseMarkers,2004,20(4-5):237-250;

[3]MiddhaS,ZhangLY,NafaK,etal.Reliablepan-cancermicrosatelliteinstabilityassessmentbyusingtargetednext-generationsequencingdata.JournalofClinicalOncologyPrecisionOncology,2017;

[4]中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2017版），中華外科雜志，2018,56（4）：241-258;

[5]FDA,EVALUATIONOFAUTOMATICCLASSIIIDESIGNATIONF