2022年醫(yī)學(xué)專題-即對昆蟲或高等動物體內(nèi)膽堿酯酶的活性能起抑制作用

環(huán)境(huánjìng)毒理學(xué)實驗授課教師：蘇增建試驗(shìyàn)地點：環(huán)境毒理實驗室適用專業(yè)：環(huán)境科學(xué)相關(guān)專業(yè)第一頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)一、目的與要求（1）學(xué)習(xí)和掌握濾紙接觸毒性(dúxìnɡ)實驗和人工土壤實驗的基本原理和方法。（2）初步了解評價環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)對土壤中動物急生傷害的標(biāo)準(zhǔn)和基本步驟。第二頁，共二十四頁。二、原理濾紙接觸法毒性實驗簡單易行，可對受試物毒性進(jìn)行初篩。將蚯蚓與濕潤(shīrùn)的濾紙上的受試物接觸，測定土壤中受試物對蚯蚓的潛在影響。人工土壤實驗系統(tǒng)將蚯蚓置于含不同濃度受試物的人工土壤中，飼養(yǎng)7d和14d，評價其死亡率，評價受試物對蚯蚓的急性毒性作用。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)第三頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)三、設(shè)備與材料1、主要儀器和設(shè)備玻璃容器：平底玻璃管（3cm×8cm）培養(yǎng)裝置：光強(qiáng)400-800lx的溫控培養(yǎng)箱中性(zhōngxìng)濾紙：80-85g/m2移液器、塑料薄膜、烘箱、電吹風(fēng)第四頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)2、試驗生物選用二月齡以上，體重300-500mg左右的健康赤子愛勝蚓。實驗前應(yīng)在實驗室條件(tiáojiàn)下馴養(yǎng)2周以上。第五頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)3、人工土壤人工土壤基質(zhì)組成(zǔchénɡ)（干重）：（1）10%干牛糞（PH為5.5-6.0，磨細(xì)，風(fēng)干，測定含水量）；（2）20%高嶺黏土（含50%以上高嶺土）；（3）70%石英沙（粒徑的石顆粒50%以上）；（4）混合人工土壤的組成成分，加入蒸餾水使其含水量為干重的25%-42%，混合均勻。第六頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)四、方法和步驟1、清腸用蒸餾水清洗蚯蚓，然后置于鋪有濾紙的磁盤上清腸24h，用去離子水沖洗(chōngxǐ)后，濾紙吸干稱重，供試。注：清腸過程用薄膜包緊磁盤，防止蚯蚓爬出磁盤死亡。第七頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)2、濾紙實驗在平底試管內(nèi)壁襯濾紙，鋪滿不重疊；設(shè)5個濃度梯度（見附表）及對照共6組試管，每組≥10個重復(fù)，每個試管內(nèi)首先移取1ml對應(yīng)濃度的受試物溶液，用潔凈空氣吹干，然后每個試管加入1ml去離子水，然后加入1條蚯蚓，用薄膜封口，在黑暗、20±2℃環(huán)境培養(yǎng)48h，每24h觀察(guānchá)一次，記錄死亡情況，同時還有蚯蚓的病理癥狀和行為。第八頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)選擇濃度(nóngdù)范圍的預(yù)試驗受試物在濾紙的沉積量（mg/cm2）受試物濃度（g/ml）1.07×10-20.17×10-30.017×10-40.0017×10-50.00017×10-6注：受試物溶于水（≥1000mg/l）或丙酮等助溶劑(róngjì)，配成系列濃度第九頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)3、人工土壤試驗正式試驗前，需進(jìn)行濃度范圍選擇實驗。最終設(shè)定至少5個濃度梯度級及空白組，濃度范圍應(yīng)包括最大耐受濃度和致死(zhìsǐ)濃度兩組濃度，每組至少有4個平行樣。受試蚯蚓需在人工土壤中先馴養(yǎng)24h，實驗前沖洗干凈。實驗進(jìn)行14d，每7d觀察蚯蚓的病理癥狀及行為、死亡。測定介質(zhì)中的含水量。第十頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)4、質(zhì)量控制(kòngzhì)可在實驗中加入陽性對照組（氯乙酰胺），空白組用去離子水代替受試物，實驗結(jié)束后空白對照組死亡率應(yīng)不超過10%。第十一頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)五、結(jié)果及實驗報告記錄不同受試物濃度對應(yīng)(duìyìng)的死亡情況，實驗報告就包括以下內(nèi)容：受試物的基本物化性質(zhì)；實驗動物的飼養(yǎng)條件等；試驗條件包括溫度、濕度、光照條件、實驗介質(zhì)的成分級成和制備條件；實驗結(jié)果報告。第十二頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)六、注意事項1、牛糞與其他人工土壤成分混合前應(yīng)充分(chōngfèn)磨細(xì)風(fēng)干、烘干，測定含水量；2、蚯蚓馴養(yǎng)條件：溫度18-22℃，持續(xù)光照（強(qiáng)度400-800lx），保證濕度；第十三頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)一蚯蚓急性毒性實驗(shíyàn)3、實驗中管口或瓶口必須(bìxū)用薄膜封緊并保證通氣，防止蚯蚓鉆出；4、根據(jù)LC50值可將農(nóng)藥對蚯蚓的毒性劃分三個等級：<1ppm的為高毒農(nóng)藥1-10ppm的為中毒農(nóng)藥>10ppm的為低毒農(nóng)藥第十四頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)二有機(jī)磷農(nóng)藥對膽堿酯酶活性的抑制一、目的(mùdì)與要求1、了解有機(jī)磷殺蟲劑共同的特性，即對昆蟲或高等動物體內(nèi)膽堿酯酶的活性能起抑制作用，而引起動物中毒死亡。2、利用這一原理測定各種有機(jī)磷殺蟲劑在動、植物體內(nèi)的殘留毒性，為安全使用農(nóng)藥提供依據(jù)。第十五頁，共二十四頁。實驗二有機(jī)磷農(nóng)藥(nóngyào)對膽堿酯酶的抑制實驗二、原理當(dāng)高等動物或昆蟲被有機(jī)磷殺蟲劑作用之后(zhīhòu)，體內(nèi)膽堿酯酶就受抑制，不能繼續(xù)起水解作用，因此，它們體內(nèi)的乙酰膽堿大量積累，而導(dǎo)致中毒死亡第十六頁，共二十四頁。實驗二有機(jī)磷農(nóng)藥(nóngyào)對膽堿酯酶的抑制實驗三、設(shè)備與材料1、設(shè)備：可見光分光光度計；試管13支，移液器；振蕩(zhèndàng)水浴鍋，燒杯，研缽。2、試劑：（1）0.004M溴化或氯化乙酰膽堿；（2）2M鹽酸羥胺溶液；（3）3.5NNaOH；（4）4N鹽酸溶液；（5）0.37M三氯化鐵溶液。第十七頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)二有機(jī)磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗(shíyàn)四、步驟與方法1、將臺面的大試管(shìguǎn)進(jìn)行編號1-9（其中6號管為空白管，9號管為對照管），另有一支2ml有蓋管；2、每一排所有組將芽蟲放在一起，加入5倍左右的冷凍蒸餾水，進(jìn)行研磨，然后將漿液全部倒入離心管中，在2500rpm離心15min，取離心管中上清液作為正常蟲漿，共用；第十八頁，共二十四頁。實驗二有機(jī)磷農(nóng)藥(nóngyào)對膽堿酯酶的抑制實驗3、各小組向2ml管加入0.5ml正常蟲漿，然后由老師幫忙加入20μl0.1%敵百蟲液，放置15分鐘；4、向1-6號管分別(fēnbié)添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.0ml試劑（1），再分別加入1.3、1.1、0.9、0.7、0.5、0.5磷酸鹽緩沖液，搖勻；向7號管中分別加入0.5ml無處理的正常蟲漿，向8號管中加入0.5ml敵百蟲處理過的蟲漿，然后分別向7-9號管加入1ml試劑（1），搖勻；第十九頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)二有機(jī)磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗(shíyàn)5、將6-9號管放入37℃振蕩(zhèndàng)水浴鍋中，40min后取出；6、向6號管中加入1ml試劑（4），搖勻后；7、分別向1-9號管中加入2ml試劑（2）與試劑（3）的混合液（1：1臨時配用），大力搖動1min以上；第二十頁，共二十四頁。實驗(shíyàn)二有機(jī)磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗(shíyàn)8、向9號管中加入0.5ml正常蟲漿；9、除6號管外，分別向各管（1-5號、7-9號）加入1ml試劑(shìjì)（4），搖勻；10、向1-9號管加入1ml試劑（5），各管即呈現(xiàn)深淺不同的紅棕色，用可見光光度計（540nm進(jìn)行測定）。第二十一頁，共二十四頁。實驗二有機(jī)磷農(nóng)藥(nóngyào)對膽堿酯酶的抑制實驗五、結(jié)果與報告要求作出乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)這條標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣本所含的乙酰膽堿量，從而計算(jìsuàn)出膽堿酯酶被抑制的百分率。第二十二頁，共二十四頁。實驗二有機(jī)磷農(nóng)藥(nóngyào)對膽堿酯酶的抑制實驗六、注意事項1、受試生物如果是荔枝蝽，則需雄雌各3頭，實驗時需去除雄性的睪丸，剪去翅膀、附肢、觸角等，研磨(yánmó)后需用玻璃絲過濾；2、手工研磨時可先加少量冷凍蒸餾水，快速研磨后再加適量冷凍蒸餾水磨拌均勻。第二十三頁，共二十四頁。內(nèi)容(nèiróng)總結(jié)環(huán)境毒理學(xué)實驗。（2）初步了解評