PCR檢驗質(zhì)量控制課件

PCR檢驗質(zhì)量控制主講人：姜銳ppt課件PCR檢驗質(zhì)量控制主講人：姜銳ppt課件實驗室設(shè)置要求四個區(qū)域（試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)）必須是互相獨立的各區(qū)間不能直通，應(yīng)有緩沖間應(yīng)有充分合理的空間、良好的照明、通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備(不能使用中央空調(diào))

標本制備區(qū)有生物安全柜、沖眼器除移動紫外燈外，各工作區(qū)域內(nèi)應(yīng)有固定于房頂?shù)淖贤鉄魝鬟f窗ppt課件實驗室設(shè)置要求四個區(qū)域（試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物傳遞窗傳遞窗ppt課件傳遞窗傳遞窗ppt課件

實驗室管理進入和使用實驗室各區(qū)域應(yīng)有明確的限制和控制，防止患者和其他非相關(guān)人員的隨意進出不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用ppt課件實驗室管理進入和使用實驗室各區(qū)域應(yīng)有明確的限制和控制，防止臨床基因擴增檢驗質(zhì)量控制分析前—患者準備、標本（采集、運送、驗收、保存）、醫(yī)生報告單申請分析中—樣本分樣、儀器、核酸提取、核酸擴增、產(chǎn)物分析、檢測的有效性判斷分析后—試驗報告、報告?zhèn)鬟f、結(jié)果的接收、結(jié)果的審核、結(jié)果解釋ppt課件臨床基因擴增檢驗質(zhì)量控制分析前—患者準備、標本（采集、運送、標本標本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響標本的類型和采集量采樣及運輸容器采樣質(zhì)量的評價標本采集中的防污染ppt課件標本標本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響ppt課件

標本采集時間1、血清（漿）：無特殊要求2、如用泌尿生殖道分泌物做CT項目：應(yīng)在抗生素應(yīng)用前或停藥兩周后采集標本，如不能停用抗生素，應(yīng)于下次抗生素應(yīng)用前采集3、如用痰做TB：應(yīng)在抗結(jié)核藥物應(yīng)用前或停藥兩周后采集標本，如不能停用抗結(jié)核藥物，應(yīng)于下次抗結(jié)核藥物應(yīng)用前采集。

ppt課件標本采集時間1、血清（漿）：無特殊要求ppt課件標本采集量標本的類型和采集量應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。血漿：HBV,HCV全血：EB生殖道分泌物：CT痰液，肺泡灌洗液：TBppt課件標本采集量標本的類型和采集量應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。ppt課件采樣容器采樣所用的抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對核酸擴增及檢測過程造成干擾。如全血、骨髓和血漿標本，用EDTA抗凝，不使用肝素，因其是Taq酶的強抑制劑，且在核酸提取過程中很難完全去除。

使用玻璃器皿，必須為密閉的、必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的RNase永久性失活。ppt課件采樣容器采樣所用的抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對核酸擴增及檢測過標本驗收、拒收血液標本：溶血、嚴重脂血等應(yīng)拒收泌尿生殖道分泌物：鏡下觀察到上皮細胞存在。痰液：鏡下觀察上皮細胞很少，一般<10個，白細胞一般>25個。ppt課件標本驗收、拒收血液標本：溶血、嚴重脂血等應(yīng)拒收ppt課件標本運送實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床標本的運送條件（溫度、時間）作出相應(yīng)規(guī)定。靶核酸為DNA的標本，如在無菌條件下，則可以在室溫下運送，建議采集后8h之內(nèi)送至實驗室；靶核酸為RNA的標本，如在無菌條件下，可在室溫下運送，如為較長時間，則應(yīng)在加冰條件下運送，建議采集后4h之內(nèi)送至實驗室；所有標本采集后送至實驗室之前，所有臨床標本在采集后送至實驗室前，均應(yīng)放2－8℃臨時保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，標本采集后應(yīng)立即送檢。

ppt課件標本運送實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床標本的運送條標本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標本的保存對于核酸擴增測定的有效性極為重要（避免反復(fù)凍融）靶核酸為DNA的標本2-8℃保存1-3天，靶核酸為RNA的標本應(yīng)－20℃下保存－20℃下保存1個月－70℃以下可長期保存如為提取核酸后用于DNA擴增分析的樣本，可于TE緩沖液2-8℃下保存。用于RNA擴增分析的樣本，則應(yīng)于上述TE緩沖液中-70℃保存。

ppt課件標本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因標本接收標本接收建議在三個測定區(qū)之外接收的標本應(yīng)收集在原始容器中，不能接受從其他檢測如生化、免疫檢驗等分出來的標本，因其有較大的發(fā)生標本間污染的可能性ppt課件標本接收標本接收建議在三個測定區(qū)之外ppt課件標本處理

血清（漿）：應(yīng)1小時內(nèi)分離血清，抗凝后4小時內(nèi)分離血漿，然后轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管中保存。若血清分離不充分，可1500rpm離心5min。如甘油三酯含量超過6mmol/L或肉眼可見血清/血漿呈白色渾濁狀的標本，應(yīng)4℃13000rpm離心15min,吸取下層清亮血清或血漿轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管中保存泌尿生殖道分泌物一次性采樣管（含保養(yǎng)液）配套棉拭子（不含保養(yǎng)液）痰液結(jié)核分枝桿菌DNA檢測標本：用4%NaOH搖勻，室溫下放置30分鐘左右液化，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管，離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化時不能加熱，液化時間不能過長。非結(jié)核分枝桿菌DNA檢測標本：痰標本在室溫懸浮于滅菌生理鹽水中，充分震蕩混勻，促使大塊黏狀物下沉，取上清離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。切記不能用NaOH液化痰標本。

ppt課件標本處理血清（漿）：ppt課件實驗室儀器設(shè)備分冊建立儀器檔案定期維護保養(yǎng)定期校準或檢定（校準周期、校準單位、校準參數(shù)、合格的校準報告）使用前后清潔：75%乙醇擦拭,不得用次氯酸鈉溶液清潔，使用前后紫外線照射ppt課件實驗室儀器設(shè)備分冊建立儀器檔案ppt課件耗材、試劑耗材：帶濾芯或者高壓滅菌吸頭，EP管試劑盒的質(zhì)檢：包括外觀質(zhì)檢和性能質(zhì)檢選擇或更換試劑品牌：試劑性能評估更換試劑批號：評價核酸提取效率和擴增效率ppt課件耗材、試劑耗材：帶濾芯或者高壓滅菌吸頭，EP管ppt課件試劑質(zhì)檢設(shè)置空白對照、陰性對照、低值陽性對照試劑不合格

1)低值陽性對照和標準品均未檢出，或低值陽性對照未檢出而標準品檢出率大幅下降，表示試劑失效或檢測靈敏度大幅下降。

2)低值陽性對照未檢出，標準品檢測正常，提示樣品提取液存在問題。重復(fù)新舊提取液陽性對照實驗，確定提取液失效問題。

3)陰性對照有擴增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。

4)低值陽性對照檢出，標準品未檢出或擴增曲線明顯系統(tǒng)性CT值偏大5個循環(huán)以上，提示陽性標準品存在問題。試劑合格陰性對照無擴增、低值陽性質(zhì)控品檢出ppt課件試劑質(zhì)檢設(shè)置空白對照、陰性對照、低值陽性對照ppt課件質(zhì)控品來源及使用來源:第三方、試劑盒自帶、自備使用:1)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時，要確保所用溶劑的質(zhì)量；當溶劑為焦碳酸二乙酯（DEPC）水時，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進行，并避免接觸皮膚。因DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì).它可滅活各種蛋白質(zhì)，是RNA酶的強抑制物。

2)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時，所加溶劑的量要準確

3)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時應(yīng)輕輕搖勻，切忌劇烈振搖ppt課件質(zhì)控品來源及使用ppt課件質(zhì)控品設(shè)置、數(shù)量

定性檢測已知弱陽性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）：至少帶1份，監(jiān)測核酸提取和擴增檢測的有效性已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）：至少帶1份，判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染(實驗室的以前擴增產(chǎn)物的污染、標本間的交叉污染、強陽性標本氣溶膠經(jīng)加樣器導(dǎo)致污染、強陽性標本經(jīng)操作者手導(dǎo)致污染翻蓋離心管在較高溫度溫育時蓋子崩開、擴增反應(yīng)試劑的污染定量檢測已知高、中、低質(zhì)控品（基質(zhì)與待測標本相同）已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）ppt課件質(zhì)控品設(shè)置、數(shù)量定性檢測ppt課件質(zhì)控品位置室內(nèi)質(zhì)控品在擴增儀中的排列順序：不宜固定位置,盡可能監(jiān)測每一個孔擴增有效性板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對結(jié)果的錯誤解釋。ppt課件質(zhì)控品位置室內(nèi)質(zhì)控品在擴增儀中的排列順序：不宜固定位置,盡可質(zhì)控品均值建立暫定均值的建立：20d內(nèi)得到20個數(shù)值，或至少在5d內(nèi)，每天作不少于4次重復(fù)檢測獲得20個數(shù)值。對數(shù)據(jù)進行離群值檢驗（剔除超過3s外的數(shù)據(jù)），計算出均值，作為暫定均值。若使用定值質(zhì)控品，均值必須在實驗室內(nèi)使用自己現(xiàn)行的測定方法進行確定，質(zhì)控品說明書上的原有標定值只能作參考。常規(guī)均值的建立：以最初20個數(shù)據(jù)和三至五個月在控數(shù)據(jù)匯集的所有數(shù)據(jù)計算的累積平均數(shù)作為質(zhì)控品有效期內(nèi)的常規(guī)均值，并以此作為以后室內(nèi)質(zhì)控圖的均值。ppt課件質(zhì)控品均值建立暫定均值的建立：20d內(nèi)得到20個數(shù)值，或至少常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義符號定義12S

一個質(zhì)控測定值超出±2s控制限。13S

一個質(zhì)控測定值超出±3s控制限。22S

兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s或－2s控制限。R4S

同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的差值超出4s控制限。41S

四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或－1s控制限。10X

十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值的同一側(cè)。ppt課件常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義符號統(tǒng)計質(zhì)控方法Levey-Jennings質(zhì)控圖方法

Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法

ppt課件統(tǒng)計質(zhì)控方法Levey-Jennings質(zhì)控圖方法ppt課Levey-Jennings質(zhì)控圖方法根據(jù)常規(guī)條件下的變異（RCV）計算中的平均值和SD確定質(zhì)控線，一般以X±2S為告警限，X±3S為失控限，將所得質(zhì)控結(jié)果標在一張質(zhì)控圖上，簡單明了。但如果以X±2S為失控限，假失控概率太高，通常不能接受；以X±3S為失控限假失控概率低，但誤差檢出能力不強。ppt課件Levey-Jennings質(zhì)控圖方法根據(jù)常規(guī)條件下的變由12S，13S

，22S

，R4S

，41S

，10等規(guī)則組成，其中既有對隨機誤差檢出敏感的，也有對系統(tǒng)誤差敏感的。結(jié)合在一起，假失控和假告警概率低，誤差檢出能力增強，大大提高了失控的檢出率。在實踐中13s

、R4s規(guī)則常檢出隨機誤差，而22s

、41s和10x質(zhì)控規(guī)則檢出系統(tǒng)誤差。

Westgard多規(guī)則控制方法ppt課件由12S，13S，22S，R4S，41S，101)12S

為警告規(guī)則，不是失控規(guī)則。 若本批檢驗沒有出現(xiàn)控制結(jié)果超出控制線，表示本批結(jié)果沒有問題，在控，可以發(fā)出報告。 若本批檢驗有1個控制結(jié)果超出（不包括正好在限值線上的結(jié)果）2S控制線，表示本批結(jié)果可能有問題，符合12S規(guī)則。是一個警告，但不是失控。ppt課件1)12S為警告規(guī)則，不是失控規(guī)則。ppt課件12S12S規(guī)則示意圖ppt課件12S12S規(guī)則示意圖ppt課件

失控的表現(xiàn)如下：

2）13S

即這個控制值不僅超出2S控制線（符合12S規(guī)則），而且還超出了3S限值（符合13S規(guī)則）。這是在檢驗中很少發(fā)生的（概率約為0.3%），是一個檢出隨機誤差的失控規(guī)則。ppt課件 失控的表現(xiàn)如下：ppt課件13S失控規(guī)則13S失控規(guī)則示意圖ppt課件13S13S失控規(guī)則示意圖ppt課件3）22S

有兩種表現(xiàn)：l同批兩個控制品結(jié)果同方向超出2S限值?；蛲豢刂破愤B續(xù)兩批控制結(jié)果同方向超出2S限值。 屬系統(tǒng)誤差失控。ppt課件3）22S有兩種表現(xiàn)：ppt課件22S失控規(guī)則22S失控規(guī)則示意圖22S失控規(guī)則ppt課件22S22S失控規(guī)則示意圖22Sppt課件

4）R4S

在同一批中兩個控制結(jié)果差超出4S范圍，其中有一個超出了+2S限值，另一個超出了2S限值?；蚱渲幸粋€超出了＋1.5S，另一個超出了－2.5S限值屬隨機誤差過大，為失控。ppt課件

4）R4S在同一批中兩個控制結(jié)果差超出4S范圍，其R4S失控規(guī)則R4S失控規(guī)則示意圖ppt課件R4SR4S失控規(guī)則示意圖ppt課件5）41S

有兩種表現(xiàn)：包括出現(xiàn)警告在內(nèi)的這個超出2S的控制結(jié)果，這個控制品前3次結(jié)果均和這個控制結(jié)果在同方向超出+1S或1S范圍。l

包括出現(xiàn)警告在內(nèi)的這個超出2S的控制結(jié)果，這個控制品前1次結(jié)果，均同方向超出+1S或1S范圍；另一個控制品的這兩次結(jié)果也是同方向超出+1S或1S范圍。 屬系統(tǒng)誤差失控。ppt課件5）41S有兩種表現(xiàn)：ppt課件41S失控規(guī)則41S失控規(guī)則41S失控規(guī)則示意圖ppt課件41S41S41S失控規(guī)則示意圖ppt課件

6）10連同出現(xiàn)12S警告的這個結(jié)果，另外還有兩個控制品的結(jié)果，在前幾批及本批結(jié)果中，有連續(xù)10次在 的一側(cè)。 屬系統(tǒng)誤差失控。ppt課件6）10連同出現(xiàn)12S警告的這個結(jié)果，另外還有兩個控

失控規(guī)則示意圖失控規(guī)則ppt課件失控規(guī)則示意圖失控規(guī)則ppt課件失控原因分析—陽性質(zhì)控樣本常見的失控原因核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、標本中擴增抑制物的殘留等。儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標記效率和核酸提取試劑的效率等。ppt課件失控原因分析—陽性質(zhì)控樣本常見的失控原因核酸提取中的隨機誤差失控原因分析—陰性質(zhì)控樣本的失控原因擴增產(chǎn)物的“污染”

臨床標本的核酸提取過程中發(fā)生的標本間的交叉“污染”.ppt課件失控原因分析—陰性質(zhì)控樣本的失控原因擴增產(chǎn)物的“污染”pp避免基因擴增檢驗假陽性結(jié)果的措施嚴格的實驗室分區(qū)使用帶“濾芯”的吸頭設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標本同時處理）使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑臨床“假陽性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不宜做PCR檢測。ppt課件避免基因擴增檢驗假陽性結(jié)果的措施嚴格的實驗室分區(qū)ppt課件避免基因擴增檢驗假陰性結(jié)果的措施避免由于來自于標本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標本處理中的去垢劑、有機溶劑的抑制作用的措施：純化核酸；標本重復(fù)雙份測定；稀釋標本定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進行檢查和校準ppt課件避免基因擴增檢驗假陰性結(jié)果的措施避免由于來自于標本的血紅蛋白注意事項在PCR試劑準備區(qū)配置反應(yīng)混合液配制反應(yīng)體系時，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進行，不能用移液器吹打，反應(yīng)體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡分裝的試劑注意冷藏，防止酶試劑失活及有機大分子降解優(yōu)先選擇含UNG的試劑盒試劑經(jīng)充分溶解后混勻，離心后再開蓋，保持試劑均勻性擴增管、樣品處理管及吸頭等實驗用品，均需高壓滅菌標本處理應(yīng)在標本制備區(qū)指定的生物安全柜內(nèi)進行，實驗前應(yīng)打開風(fēng)機5-10min，待柜內(nèi)空氣凈化并氣流穩(wěn)定后再進行實驗操作為防止標本間交叉污染，在打開離心管前宜短暫離心ppt課件注意事項在PCR試劑準備區(qū)配置反應(yīng)混合液ppt課件注意事項如遇吸棄上清步驟的提取方法，離心時應(yīng)注意離心管的方向，吸棄上清時不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。標本處理嚴格按照試劑說明書進行操作，應(yīng)做到處理時間充分，保證標本中的DNA或RNA完全釋放；將提取的核酸加到反應(yīng)體系中后，應(yīng)將純化好的剩余核酸樣本凍存，以免在擴增檢測時出現(xiàn)意外需要重新檢測。在結(jié)果確定后再將這些樣本按生物污染廢棄物進行處理。擴增條件一致的不同檢測項目同時擴增時不得使用同一套標準品。擴增后的擴增管不能在擴增及產(chǎn)物分析區(qū)打開處理，應(yīng)用一次性手套包好遠離PCR實驗室的洗滌間消毒處理；工作結(jié)束后，必須立即對各工作區(qū)進行清潔ppt課件注意事項如遇吸棄上清步驟的提取方法，離心時應(yīng)注意離心管的方向結(jié)果判斷在判斷結(jié)果時，應(yīng)先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后再進行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結(jié)果分析的干擾?；€值（閾值）設(shè)定：遵從廠商規(guī)定ppt課件結(jié)果判斷在判斷結(jié)果時，應(yīng)先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后儀器基線設(shè)定在陰性對照線上與所有擴增曲線相交相交點在曲線的平滑區(qū)ppt課件儀器基線設(shè)定在陰性對照線上ppt課件實驗結(jié)果有效性判斷標準標準曲線平滑均勻，斜率、截距和相關(guān)系數(shù)等參數(shù)的數(shù)值允許變化范圍均應(yīng)在試劑制造商推薦的范圍內(nèi)。陰、陽室內(nèi)質(zhì)控檢測結(jié)果均處于在控狀態(tài)。以上幾項標準均達到要求后，當日實驗有效，可以發(fā)放報告。否則，本次實驗無效，全部標本應(yīng)重新檢測。ppt課件實驗結(jié)果有效性判斷標準標準曲線平滑均勻，斜率、截距和相關(guān)系數(shù)實驗灰區(qū)標本的處理定性測定中處于實驗灰區(qū)的標本應(yīng)重復(fù)檢測一次，灰區(qū)范圍的確定及結(jié)果報告應(yīng)遵從各試劑制造商推薦的要求。CT：38≤Ct值<40為檢測灰區(qū)，建議重復(fù)檢測2次。如果檢測結(jié)果至少1次為Ct<40判斷為陽性，否則判為陰性。ppt課件實驗灰區(qū)標本的處理定性測定中處于實驗灰區(qū)的標本應(yīng)重復(fù)檢測一次結(jié)果報告定性檢測定性檢測的結(jié)果報“陰性”或“陽性”。但由于目前國內(nèi)商品試劑盒的靈敏度多為500-1000IU/ml，在報告結(jié)果時應(yīng)告知臨床醫(yī)生方法的局限性。定量檢測

1）結(jié)果在檢測范圍內(nèi)，則按檢測的結(jié)果直接發(fā)報告。

2）樣本未出現(xiàn)擴增曲線，則報告為“低于檢測下限”，不能報告為“0”或“陰性”。如果低于檢測下限，但又有擴增曲線，則應(yīng)重新檢測，仍低于檢測下限，則報告為“低于檢測下限”。

3）結(jié)果高于檢測上限，則報告“高于檢測上限”，如果需要精確定量結(jié)果，則應(yīng)用陰性血清（漿）將樣本進行100-1000倍稀釋后再重新進行檢測，結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)；或?qū)⑻崛『蟮臉悠废♂屩辆€性范圍內(nèi)再檢測。ppt課件結(jié)果報告定性檢測定性檢測的結(jié)果報“陰性”或“陽性”。但由于結(jié)果解釋臨床可以肺結(jié)核患者痰涂片陰性，而TB菌PCR陽性或時陰時陽，可能患者為初起病間斷排菌且排菌量不大所致；或經(jīng)抗結(jié)核治療后，常有矛盾報告[培養(yǎng)（-）、PCR（+）較多]，因為只要有TB靶片段存在，PCR即可陽性，而測得陽性，不一定有活菌，加之病情與菌量不一定成正比。HBV（及HCV）感染在抗病毒治療過程中，可出現(xiàn)HBV-DNA(及HCV-RNA)陰轉(zhuǎn)情況，有時停藥后又轉(zhuǎn)陽。藥物是否能徹底清除病毒還要根據(jù)肝臟酶學(xué)、病毒血清學(xué)標志物及核酸結(jié)果綜合考慮，僅有核酸陰轉(zhuǎn)而其他指標不改變并不能證明臨床痊愈。另外，PCR檢測結(jié)果陰性并不能排除樣本含有病原體，只能說明含有的病原體濃度低于本試劑的檢測下限

ppt課件結(jié)果解釋臨床可以肺結(jié)核患者痰涂片陰性，而TB菌PCR陽性或時

謝謝ppt課件謝謝ppt課件PCR檢驗質(zhì)量控制主講人：姜銳ppt課件PCR檢驗質(zhì)量控制主講人：姜銳ppt課件實驗室設(shè)置要求四個區(qū)域（試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)）必須是互相獨立的各區(qū)間不能直通，應(yīng)有緩沖間應(yīng)有充分合理的空間、良好的照明、通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備(不能使用中央空調(diào))

標本制備區(qū)有生物安全柜、沖眼器除移動紫外燈外，各工作區(qū)域內(nèi)應(yīng)有固定于房頂?shù)淖贤鉄魝鬟f窗ppt課件實驗室設(shè)置要求四個區(qū)域（試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物傳遞窗傳遞窗ppt課件傳遞窗傳遞窗ppt課件

實驗室管理進入和使用實驗室各區(qū)域應(yīng)有明確的限制和控制，防止患者和其他非相關(guān)人員的隨意進出不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用ppt課件實驗室管理進入和使用實驗室各區(qū)域應(yīng)有明確的限制和控制，防止臨床基因擴增檢驗質(zhì)量控制分析前—患者準備、標本（采集、運送、驗收、保存）、醫(yī)生報告單申請分析中—樣本分樣、儀器、核酸提取、核酸擴增、產(chǎn)物分析、檢測的有效性判斷分析后—試驗報告、報告?zhèn)鬟f、結(jié)果的接收、結(jié)果的審核、結(jié)果解釋ppt課件臨床基因擴增檢驗質(zhì)量控制分析前—患者準備、標本（采集、運送、標本標本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響標本的類型和采集量采樣及運輸容器采樣質(zhì)量的評價標本采集中的防污染ppt課件標本標本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響ppt課件

標本采集時間1、血清（漿）：無特殊要求2、如用泌尿生殖道分泌物做CT項目：應(yīng)在抗生素應(yīng)用前或停藥兩周后采集標本，如不能停用抗生素，應(yīng)于下次抗生素應(yīng)用前采集3、如用痰做TB：應(yīng)在抗結(jié)核藥物應(yīng)用前或停藥兩周后采集標本，如不能停用抗結(jié)核藥物，應(yīng)于下次抗結(jié)核藥物應(yīng)用前采集。

ppt課件標本采集時間1、血清（漿）：無特殊要求ppt課件標本采集量標本的類型和采集量應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。血漿：HBV,HCV全血：EB生殖道分泌物：CT痰液，肺泡灌洗液：TBppt課件標本采集量標本的類型和采集量應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。ppt課件采樣容器采樣所用的抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對核酸擴增及檢測過程造成干擾。如全血、骨髓和血漿標本，用EDTA抗凝，不使用肝素，因其是Taq酶的強抑制劑，且在核酸提取過程中很難完全去除。

使用玻璃器皿，必須為密閉的、必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的RNase永久性失活。ppt課件采樣容器采樣所用的抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對核酸擴增及檢測過標本驗收、拒收血液標本：溶血、嚴重脂血等應(yīng)拒收泌尿生殖道分泌物：鏡下觀察到上皮細胞存在。痰液：鏡下觀察上皮細胞很少，一般<10個，白細胞一般>25個。ppt課件標本驗收、拒收血液標本：溶血、嚴重脂血等應(yīng)拒收ppt課件標本運送實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床標本的運送條件（溫度、時間）作出相應(yīng)規(guī)定。靶核酸為DNA的標本，如在無菌條件下，則可以在室溫下運送，建議采集后8h之內(nèi)送至實驗室；靶核酸為RNA的標本，如在無菌條件下，可在室溫下運送，如為較長時間，則應(yīng)在加冰條件下運送，建議采集后4h之內(nèi)送至實驗室；所有標本采集后送至實驗室之前，所有臨床標本在采集后送至實驗室前，均應(yīng)放2－8℃臨時保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，標本采集后應(yīng)立即送檢。

ppt課件標本運送實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床標本的運送條標本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標本的保存對于核酸擴增測定的有效性極為重要（避免反復(fù)凍融）靶核酸為DNA的標本2-8℃保存1-3天，靶核酸為RNA的標本應(yīng)－20℃下保存－20℃下保存1個月－70℃以下可長期保存如為提取核酸后用于DNA擴增分析的樣本，可于TE緩沖液2-8℃下保存。用于RNA擴增分析的樣本，則應(yīng)于上述TE緩沖液中-70℃保存。

ppt課件標本保存靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因標本接收標本接收建議在三個測定區(qū)之外接收的標本應(yīng)收集在原始容器中，不能接受從其他檢測如生化、免疫檢驗等分出來的標本，因其有較大的發(fā)生標本間污染的可能性ppt課件標本接收標本接收建議在三個測定區(qū)之外ppt課件標本處理

血清（漿）：應(yīng)1小時內(nèi)分離血清，抗凝后4小時內(nèi)分離血漿，然后轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管中保存。若血清分離不充分，可1500rpm離心5min。如甘油三酯含量超過6mmol/L或肉眼可見血清/血漿呈白色渾濁狀的標本，應(yīng)4℃13000rpm離心15min,吸取下層清亮血清或血漿轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管中保存泌尿生殖道分泌物一次性采樣管（含保養(yǎng)液）配套棉拭子（不含保養(yǎng)液）痰液結(jié)核分枝桿菌DNA檢測標本：用4%NaOH搖勻，室溫下放置30分鐘左右液化，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管，離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化時不能加熱，液化時間不能過長。非結(jié)核分枝桿菌DNA檢測標本：痰標本在室溫懸浮于滅菌生理鹽水中，充分震蕩混勻，促使大塊黏狀物下沉，取上清離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。切記不能用NaOH液化痰標本。

ppt課件標本處理血清（漿）：ppt課件實驗室儀器設(shè)備分冊建立儀器檔案定期維護保養(yǎng)定期校準或檢定（校準周期、校準單位、校準參數(shù)、合格的校準報告）使用前后清潔：75%乙醇擦拭,不得用次氯酸鈉溶液清潔，使用前后紫外線照射ppt課件實驗室儀器設(shè)備分冊建立儀器檔案ppt課件耗材、試劑耗材：帶濾芯或者高壓滅菌吸頭，EP管試劑盒的質(zhì)檢：包括外觀質(zhì)檢和性能質(zhì)檢選擇或更換試劑品牌：試劑性能評估更換試劑批號：評價核酸提取效率和擴增效率ppt課件耗材、試劑耗材：帶濾芯或者高壓滅菌吸頭，EP管ppt課件試劑質(zhì)檢設(shè)置空白對照、陰性對照、低值陽性對照試劑不合格

1)低值陽性對照和標準品均未檢出，或低值陽性對照未檢出而標準品檢出率大幅下降，表示試劑失效或檢測靈敏度大幅下降。

2)低值陽性對照未檢出，標準品檢測正常，提示樣品提取液存在問題。重復(fù)新舊提取液陽性對照實驗，確定提取液失效問題。

3)陰性對照有擴增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。

4)低值陽性對照檢出，標準品未檢出或擴增曲線明顯系統(tǒng)性CT值偏大5個循環(huán)以上，提示陽性標準品存在問題。試劑合格陰性對照無擴增、低值陽性質(zhì)控品檢出ppt課件試劑質(zhì)檢設(shè)置空白對照、陰性對照、低值陽性對照ppt課件質(zhì)控品來源及使用來源:第三方、試劑盒自帶、自備使用:1)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時，要確保所用溶劑的質(zhì)量；當溶劑為焦碳酸二乙酯（DEPC）水時，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進行，并避免接觸皮膚。因DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì).它可滅活各種蛋白質(zhì)，是RNA酶的強抑制物。

2)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時，所加溶劑的量要準確

3)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時應(yīng)輕輕搖勻，切忌劇烈振搖ppt課件質(zhì)控品來源及使用ppt課件質(zhì)控品設(shè)置、數(shù)量

定性檢測已知弱陽性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）：至少帶1份，監(jiān)測核酸提取和擴增檢測的有效性已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）：至少帶1份，判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染(實驗室的以前擴增產(chǎn)物的污染、標本間的交叉污染、強陽性標本氣溶膠經(jīng)加樣器導(dǎo)致污染、強陽性標本經(jīng)操作者手導(dǎo)致污染翻蓋離心管在較高溫度溫育時蓋子崩開、擴增反應(yīng)試劑的污染定量檢測已知高、中、低質(zhì)控品（基質(zhì)與待測標本相同）已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）ppt課件質(zhì)控品設(shè)置、數(shù)量定性檢測ppt課件質(zhì)控品位置室內(nèi)質(zhì)控品在擴增儀中的排列順序：不宜固定位置,盡可能監(jiān)測每一個孔擴增有效性板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對結(jié)果的錯誤解釋。ppt課件質(zhì)控品位置室內(nèi)質(zhì)控品在擴增儀中的排列順序：不宜固定位置,盡可質(zhì)控品均值建立暫定均值的建立：20d內(nèi)得到20個數(shù)值，或至少在5d內(nèi)，每天作不少于4次重復(fù)檢測獲得20個數(shù)值。對數(shù)據(jù)進行離群值檢驗（剔除超過3s外的數(shù)據(jù)），計算出均值，作為暫定均值。若使用定值質(zhì)控品，均值必須在實驗室內(nèi)使用自己現(xiàn)行的測定方法進行確定，質(zhì)控品說明書上的原有標定值只能作參考。常規(guī)均值的建立：以最初20個數(shù)據(jù)和三至五個月在控數(shù)據(jù)匯集的所有數(shù)據(jù)計算的累積平均數(shù)作為質(zhì)控品有效期內(nèi)的常規(guī)均值，并以此作為以后室內(nèi)質(zhì)控圖的均值。ppt課件質(zhì)控品均值建立暫定均值的建立：20d內(nèi)得到20個數(shù)值，或至少常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義符號定義12S

一個質(zhì)控測定值超出±2s控制限。13S

一個質(zhì)控測定值超出±3s控制限。22S

兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s或－2s控制限。R4S

同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的差值超出4s控制限。41S

四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或－1s控制限。10X

十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值的同一側(cè)。ppt課件常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義符號統(tǒng)計質(zhì)控方法Levey-Jennings質(zhì)控圖方法

Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法

ppt課件統(tǒng)計質(zhì)控方法Levey-Jennings質(zhì)控圖方法ppt課Levey-Jennings質(zhì)控圖方法根據(jù)常規(guī)條件下的變異（RCV）計算中的平均值和SD確定質(zhì)控線，一般以X±2S為告警限，X±3S為失控限，將所得質(zhì)控結(jié)果標在一張質(zhì)控圖上，簡單明了。但如果以X±2S為失控限，假失控概率太高，通常不能接受；以X±3S為失控限假失控概率低，但誤差檢出能力不強。ppt課件Levey-Jennings質(zhì)控圖方法根據(jù)常規(guī)條件下的變由12S，13S

，22S

，R4S

，41S

，10等規(guī)則組成，其中既有對隨機誤差檢出敏感的，也有對系統(tǒng)誤差敏感的。結(jié)合在一起，假失控和假告警概率低，誤差檢出能力增強，大大提高了失控的檢出率。在實踐中13s

、R4s規(guī)則常檢出隨機誤差，而22s

、41s和10x質(zhì)控規(guī)則檢出系統(tǒng)誤差。

Westgard多規(guī)則控制方法ppt課件由12S，13S，22S，R4S，41S，101)12S

為警告規(guī)則，不是失控規(guī)則。 若本批檢驗沒有出現(xiàn)控制結(jié)果超出控制線，表示本批結(jié)果沒有問題，在控，可以發(fā)出報告。 若本批檢驗有1個控制結(jié)果超出（不包括正好在限值線上的結(jié)果）2S控制線，表示本批結(jié)果可能有問題，符合12S規(guī)則。是一個警告，但不是失控。ppt課件1)12S為警告規(guī)則，不是失控規(guī)則。ppt課件12S12S規(guī)則示意圖ppt課件12S12S規(guī)則示意圖ppt課件

失控的表現(xiàn)如下：

2）13S

即這個控制值不僅超出2S控制線（符合12S規(guī)則），而且還超出了3S限值（符合13S規(guī)則）。這是在檢驗中很少發(fā)生的（概率約為0.3%），是一個檢出隨機誤差的失控規(guī)則。ppt課件 失控的表現(xiàn)如下：ppt課件13S失控規(guī)則13S失控規(guī)則示意圖ppt課件13S13S失控規(guī)則示意圖ppt課件3）22S

有兩種表現(xiàn)：l同批兩個控制品結(jié)果同方向超出2S限值。或同一控制品連續(xù)兩批控制結(jié)果同方向超出2S限值。 屬系統(tǒng)誤差失控。ppt課件3）22S有兩種表現(xiàn)：ppt課件22S失控規(guī)則22S失控規(guī)則示意圖22S失控規(guī)則ppt課件22S22S失控規(guī)則示意圖22Sppt課件

4）R4S

在同一批中兩個控制結(jié)果差超出4S范圍，其中有一個超出了+2S限值，另一個超出了2S限值?；蚱渲幸粋€超出了＋1.5S，另一個超出了－2.5S限值屬隨機誤差過大，為失控。ppt課件

4）R4S在同一批中兩個控制結(jié)果差超出4S范圍，其R4S失控規(guī)則R4S失控規(guī)則示意圖ppt課件R4SR4S失控規(guī)則示意圖ppt課件5）41S

有兩種表現(xiàn)：包括出現(xiàn)警告在內(nèi)的這個超出2S的控制結(jié)果，這個控制品前3次結(jié)果均和這個控制結(jié)果在同方向超出+1S或1S范圍。l

包括出現(xiàn)警告在內(nèi)的這個超出2S的控制結(jié)果，這個控制品前1次結(jié)果，均同方向超出+1S或1S范圍；另一個控制品的這兩次結(jié)果也是同方向超出+1S或1S范圍。 屬系統(tǒng)誤差失控。ppt課件5）41S有兩種表現(xiàn)：ppt課件41S失控規(guī)則41S失控規(guī)則41S失控規(guī)則示意圖ppt課件41S41S41S失控規(guī)則示意圖ppt課件

6）10連同出現(xiàn)12S警告的這個結(jié)果，另外還有兩個控制品的結(jié)果，在前幾批及本批結(jié)果中，有連續(xù)10次在 的一側(cè)。 屬系統(tǒng)誤差失控。ppt課件6）10連同出現(xiàn)12S警告的這個結(jié)果，另外還有兩個控

失控規(guī)則示意圖失控規(guī)則ppt課件失控規(guī)則示意圖失控規(guī)則ppt課件失控原因分析—陽性質(zhì)控樣本常見的失控原因核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、標本中擴增抑制物的殘留等。儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標記效率和核酸提取試劑的效率等。ppt課件失控原因分析—陽性質(zhì)控樣本常見的失控原因核酸提取中的隨機誤差失控原因分析—陰性質(zhì)控樣本的失控原因擴增產(chǎn)物的“污染”

臨床標本的核酸提取過程中發(fā)生的標本間的交叉“污染”.ppt課件失控原因分析—陰性質(zhì)控樣本的失控原因擴增產(chǎn)物的“污染”pp避免基因擴增檢驗假陽性結(jié)果的措施嚴格的實驗室分區(qū)使用帶“濾芯”的吸頭設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標本同時處理）使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑臨床“假陽性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不宜做PCR檢測。ppt課件避免基因擴增檢驗假陽性結(jié)果的措施嚴格的實驗室分區(qū)ppt課件避免基因擴增檢驗假陰性結(jié)果的措施避免由于來自于標本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標本處理中的去垢劑、有機溶劑的抑制作用的措施：純化核酸；標本重復(fù)雙份測定；稀釋標本定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進行檢查和校準ppt課件避免基因擴增檢驗假陰性結(jié)果的措施避免由于來自于標本的血紅蛋白注意事項在PCR試劑準備區(qū)配置反應(yīng)混合液配制反應(yīng)體系時，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進行，不能用移液器吹打，反應(yīng)體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡分裝的試劑注意冷藏，防止酶試劑失活及有機大分子降解優(yōu)先選擇含UNG的試劑盒試劑經(jīng)充分溶解后混勻，離心后再開蓋，保持試劑均勻性擴增管、樣品處理管及吸頭等實驗用品，均需高壓滅菌標本處理應(yīng)在標本制備區(qū)指定的生物安全柜內(nèi)進行，實驗前應(yīng)打開風(fēng)機5-10min，待柜內(nèi)空氣凈化