章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交演示文稿

章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交演示文稿第一頁(yè)，共五十一頁(yè)。（優(yōu)選）第九章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交第二頁(yè)，共五十一頁(yè)。二、原生質(zhì)體的分離1.材料的選取

根、莖、葉、花、果實(shí)、種子及愈傷組織和懸浮細(xì)胞等都可作為分離原生質(zhì)體的材料。但要獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體，應(yīng)選用生長(zhǎng)旺盛、生命力強(qiáng)的組織。材料的生理狀態(tài)是原生質(zhì)體質(zhì)量的決定因素之一，實(shí)踐證明水肥條件、生長(zhǎng)季節(jié)、植物年齡、光照等都顯著影響原生質(zhì)體的獲得和活力。用懸浮細(xì)胞為材料時(shí)應(yīng)每隔3-5天繼代一次，使細(xì)胞處于旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)。一般在繼代后的第三天分離原生質(zhì)體。用葉片作材料時(shí)，一般選用剛展開(kāi)的幼嫩葉片。此外植物生長(zhǎng)的濕度、溫度等條件對(duì)原生質(zhì)體的分離效果也的明顯的影響。如生長(zhǎng)在相對(duì)濕度為70%，溫度為26度的蕓苔葉片只能得到少量不能持續(xù)分裂的原生質(zhì)體，而在相對(duì)濕度為40-45%，溫度為19-21度條件下生長(zhǎng)的葉片可得到理想的原生質(zhì)體。第三頁(yè)，共五十一頁(yè)。

植物細(xì)胞壁是由纖維素（25%~50%）、半纖維素（50%左右）、果膠質(zhì)（5%）組成。因此常用三種相應(yīng)的酶來(lái)降解細(xì)胞壁。一般認(rèn)為纖維素酶和果膠酶是必需的，有些材料要加半纖維素酶。商品酶制劑常含有雜質(zhì)，對(duì)原生質(zhì)體有不良影響，有時(shí)要純化。常用的方法是將酶液在4oC下過(guò)Bio-GelP6或SephadexG-25。2、酶的種類(lèi)第四頁(yè)，共五十一頁(yè)。常用的商品酶制劑：纖維素酶類(lèi)（主要來(lái)源于綠色木霉）

纖維素酶EA-867（中國(guó)）(Tricodermaviride)CellulaseOnzukaR-10（Japan）CellulaseOnzukaRS（Japan）Cellulase（Sigma）Cellulysin（USA）

果膠酶類(lèi)（主要來(lái)源于黑曲霉）

PectolyaseY23（Japan）MacerozymeR-10（Japan）Macerozyme（Japan）Pectinase（Sigma）Pectinal（USA）第五頁(yè)，共五十一頁(yè)。

如果溶液的滲透壓和細(xì)胞內(nèi)的滲透壓不同，原生質(zhì)體有可能被漲破或收縮。因此在酶液、洗滌液和培養(yǎng)液中滲透壓應(yīng)和原生質(zhì)體內(nèi)的相等或略大一些。廣泛使用的滲透壓調(diào)節(jié)劑是山梨醇和甘露醇，此外還有蔗糖、葡萄糖、和麥芽糖，濃度約在0.40~0.80mol/L。加入CaCl2、KH2PO4等能夠提高原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性，增加完整原生質(zhì)體的數(shù)目和活力。3、滲透壓的調(diào)控第六頁(yè)，共五十一頁(yè)。4、原生質(zhì)體的游離（1）材料的預(yù)處理：有些材料經(jīng)預(yù)處理后可提高原生質(zhì)體分裂的頻率，如暗處理、預(yù)培養(yǎng)、低溫處理等。（2）

材料的滅菌：除試管苗、培養(yǎng)細(xì)胞等外，材料要進(jìn)行表面滅菌。

（3）酶解處理：酶的選擇因材料而異，愈傷和懸浮細(xì)胞用活性較強(qiáng)的酶，且酶的濃度也要大一些；葉片等材料酶濃度可小一些。pH值一般調(diào)在5.6~5.8，酶解處理一般靜止暗中進(jìn)行，懸浮細(xì)胞和愈傷組織則要置搖床低速振蕩。酶解時(shí)間5~24h，溫度一般為250C。第七頁(yè)，共五十一頁(yè)。滅菌試劑濃度（%）去除時(shí)間（min）效果次氯酸鈉2易5~30很好次氯酸鈣9~10易5~30很好過(guò)氧化氫10~12最易5~15好二氯化汞0.1~1.0較難5~15最好乙醇70~75易5~30秒好

常用的滅菌試劑第八頁(yè)，共五十一頁(yè)。

5、原生質(zhì)體收集與純化

通常用過(guò)濾和離心相結(jié)合的方法收集與純化。（1）

原生質(zhì)體混合液過(guò)篩（40~100m），除去未消化的細(xì)胞團(tuán)、篩管、導(dǎo)管等雜質(zhì)。（2）濾液離心沉淀原生質(zhì)體。（3）沉淀重新懸浮，再離心，重復(fù)洗三次。（4）用培養(yǎng)基清洗一次，最后用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)原生質(zhì)體的濃度（104~106/ml）進(jìn)行培養(yǎng)。第九頁(yè)，共五十一頁(yè)。

（1）細(xì)胞壁染色法：

熒光增白劑——細(xì)胞壁染色劑，既可以鑒定細(xì)胞壁是否除凈，也可檢查原生質(zhì)體細(xì)胞壁的再生情況。染色后在熒光顯微鏡下觀察（360~440nm），染料與細(xì)胞壁形成顯眼的綠色熒光，無(wú)細(xì)胞壁處則無(wú)熒光反應(yīng)，略帶紅色。6、原生質(zhì)體的活力鑒定第十頁(yè)，共五十一頁(yè)。

（2）原生質(zhì)體活力的測(cè)定：

有多種方法，如觀察細(xì)胞質(zhì)環(huán)流、Evans藍(lán)活性染料染色、測(cè)熒光素雙醋酸酯（FDA）染色、測(cè)定原生質(zhì)體光合活性等。一般常用的方法是FDA染色，F(xiàn)DA本身無(wú)熒光，進(jìn)入原生質(zhì)體，在原生質(zhì)體中受酯酶的分解而產(chǎn)生有熒光的極性熒光物質(zhì)，積累在有活力的原生質(zhì)內(nèi)，便產(chǎn)生熒光。無(wú)活力的原生質(zhì)不能分解FDA，也就無(wú)熒光產(chǎn)生。第十一頁(yè)，共五十一頁(yè)。

矮牽牛（Petuniahybrida）葉片原生質(zhì)體分離的具體操作過(guò)程：

（1）取幼嫩葉片，用自來(lái)水洗凈，無(wú)離子水中浸泡1~2小時(shí)，無(wú)菌條件下在70%乙醇中浸泡兩秒鐘，0.1%升汞中浸泡分鐘，無(wú)菌水洗滌葉片（3~5次）。（2）

滅菌后撕去葉片的下表皮，平放于盛有酶液的培養(yǎng)皿中。酶液的組成為：2%纖維素酶（75-343，上海生化所東風(fēng)試劑廠）；0.5mol甘露醇，pH5.6，使用前用04.5m微孔濾膜抽濾滅菌。（3）酶液處理：260C度，約3小時(shí)，將懸浮有原生質(zhì)體的酶液200目鎳絲網(wǎng)過(guò)濾，離心（500rpm，3~5min），棄去酶液。收集原生質(zhì)體，用0.5mol甘露醇洗一次（離心），再用液體培養(yǎng)基洗一次，最后添加培養(yǎng)基，制成密度為1~2104/ml的原生質(zhì)體懸浮液。（原生質(zhì)體呈球形，葉綠體分布均勻，呈亮綠色。）

第十二頁(yè)，共五十一頁(yè)。

原生質(zhì)體經(jīng)分離純化后，在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件才能正常生長(zhǎng)發(fā)育，最后再生成完整植株。由于沒(méi)有細(xì)胞壁，原生質(zhì)體對(duì)環(huán)境的刺激更敏感，培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)方法的變化都會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)部生理、生化變化。三、植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)第十三頁(yè)，共五十一頁(yè)。1、原生質(zhì)體培養(yǎng)基

原生質(zhì)體培養(yǎng)基一般是在組織、細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)而制成。如常用的KM8P培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，NT培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)改進(jìn)而成。（1）滲透壓穩(wěn)定劑：常用的是甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等。這些物質(zhì)既保持培養(yǎng)基的滲透濃度，同時(shí)也是原生質(zhì)體生長(zhǎng)的碳源。第十四頁(yè)，共五十一頁(yè)。

（2）無(wú)機(jī)鹽：是培養(yǎng)基的主要成分，分大量的微量元素兩部分。大量元素中影響最大的是Ca2+和NH4+。

較高的Ca2+濃度能提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，同樣也有利于原生質(zhì)體的生長(zhǎng)發(fā)育。因此常用大量元素減半的MS培養(yǎng)基時(shí)，Ca2+濃度不降低；

高濃度NH4+

對(duì)原生質(zhì)體生長(zhǎng)發(fā)育不利，很多原生質(zhì)體培養(yǎng)采用除去銨鹽而用有機(jī)氮做氮源的方法。其他如有機(jī)營(yíng)養(yǎng)、激素等在組織、細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上根據(jù)培養(yǎng)要求適當(dāng)改進(jìn)。第十五頁(yè)，共五十一頁(yè)。

（1）

液體培養(yǎng)法：

培養(yǎng)基中不加固化劑，原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中。常用的有液體淺層培養(yǎng)法、微滴培養(yǎng)法。

液體淺層培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)便，對(duì)原生質(zhì)體傷害小，且便于添加培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，是廣泛應(yīng)用的方法之一；

2、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法第十六頁(yè)，共五十一頁(yè)。

微滴培養(yǎng)法是將懸有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液用滴管以0.1ml左右的小滴接種到無(wú)菌清潔干燥培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿封口防止干燥和污染（如果把培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)則成為懸滴培養(yǎng)）。該法的優(yōu)點(diǎn)是在一個(gè)培養(yǎng)皿中可做很多種培養(yǎng)基的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，且其中一滴發(fā)生污染不會(huì)殃及整個(gè)實(shí)驗(yàn)；缺點(diǎn)是原生質(zhì)體分布不均勻（集中在中央），且易蒸發(fā)干燥。

第十七頁(yè)，共五十一頁(yè)。

（2）固體培養(yǎng)法：

該法是將懸浮在液體培養(yǎng)基中的原生質(zhì)體與熱融的含瓊脂（0.6%）的培養(yǎng)基等量混合，冷卻后原生質(zhì)體包埋在瓊脂培養(yǎng)基中。由于原生質(zhì)體被機(jī)械地彼此分開(kāi)并固定了位置，因而避免了細(xì)胞間有害代謝產(chǎn)物的相互影響，且便于定點(diǎn)觀察，追蹤單個(gè)細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。第十八頁(yè)，共五十一頁(yè)。

（3）固液結(jié)合培養(yǎng)法：

即在培養(yǎng)皿的底部先鋪一層固體培養(yǎng)基（含或不含原生質(zhì)體），再在其上進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)。這樣固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分可緩慢向液體中釋放，以補(bǔ)充培養(yǎng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的消耗，也可吸收培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)更為有利。

用上述各方法，一般培養(yǎng)1~2d原生質(zhì)體體積顯著增大，2~3d即可形成新的細(xì)胞壁，3~7天后開(kāi)始分裂，15d左右形成小的細(xì)胞團(tuán)(20~40個(gè)細(xì)胞)，30~40d發(fā)育成肉眼可見(jiàn)的小愈傷組織。第十九頁(yè)，共五十一頁(yè)。

當(dāng)愈傷組織直徑為1~2mm時(shí)，可將其轉(zhuǎn)移到固體分化培養(yǎng)基上，一般是先誘導(dǎo)芽分化，再誘導(dǎo)根分化。小愈傷組織在固體分化培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，約30d后直徑可達(dá)礎(chǔ)0.5cm，同時(shí)愈組織變綠（不同來(lái)源的材料表現(xiàn)不一），進(jìn)一步誘導(dǎo)分化形成綠芽。然后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上或不含任何激素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化形成根，再生完整植株。第二十頁(yè)，共五十一頁(yè)。3.原生質(zhì)體的培養(yǎng)的技術(shù)流程

原生質(zhì)體可按Bergmann的細(xì)胞植板法用瓊脂平板進(jìn)行培養(yǎng)。如下圖所示。

第二十一頁(yè)，共五十一頁(yè)。第二十二頁(yè)，共五十一頁(yè)。4.植物原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株實(shí)例玉米小偃麥棉花第二十三頁(yè)，共五十一頁(yè)。玉米原生質(zhì)體植株再生1、從胚性愈傷組織分離的原生質(zhì)體。2、培養(yǎng)4天后再生細(xì)胞進(jìn)行第一次分裂。3、培養(yǎng)約三星期的小愈傷組織。4、分化的胚芽鞘。5、分化的小植株。第二十四頁(yè)，共五十一頁(yè)。小偃麥原生質(zhì)體植株再生第二十五頁(yè)，共五十一頁(yè)。棉花原生質(zhì)體植株再生第二十六頁(yè)，共五十一頁(yè)。

1、體細(xì)胞雜交的概念

凡是兩個(gè)細(xì)胞或原生質(zhì)體融合成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為細(xì)胞雜交（cellhybridization）。原生質(zhì)體可從體細(xì)胞和性細(xì)胞獲得，但植物細(xì)胞雜交都用來(lái)自葉肉、根尖、莖端、髓部等組織的體細(xì)胞原生質(zhì)體作為雜交親本，故常稱(chēng)之為體細(xì)胞雜交（somatichybridization）。

四、植物體細(xì)胞雜交第二十七頁(yè)，共五十一頁(yè)。

通俗地說(shuō)，細(xì)胞雜交（或融合）就是兩個(gè)不同種的活細(xì)胞緊密接觸在一起，使接觸部位的細(xì)胞膜發(fā)生融化，這樣兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器互相交流，最后完全合并成一個(gè)細(xì)胞。通過(guò)科學(xué)的培養(yǎng)技術(shù)，這個(gè)細(xì)胞有可能發(fā)育成完整的生物體，即原來(lái)兩個(gè)細(xì)胞所屬的物種的雜種后代。所形成的雜種后代有可能兼有兩個(gè)親本的一些優(yōu)良性狀，因而對(duì)改良品種，提高農(nóng)、林、牧業(yè)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。第二十八頁(yè)，共五十一頁(yè)。起源細(xì)胞細(xì)胞壁降解親本原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合聚集、粘連胞質(zhì)融合異核體核融合胞壁再生雜種細(xì)胞培養(yǎng)選擇雜種愈傷組織誘導(dǎo)分化雜種植株2、植物細(xì)胞雜交程序第二十九頁(yè)，共五十一頁(yè)。

3.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)包括以下三個(gè)環(huán)節(jié)：

誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合；選擇融合體或雜種細(xì)胞；雜種細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定。

第三十頁(yè)，共五十一頁(yè)。

（1）誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合

誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合是體細(xì)胞雜交的基本技術(shù)環(huán)節(jié)，常用的方法有化學(xué)方法和電融合方法。

1）化學(xué)方法：

化學(xué)方法最早是用硝酸鈣溶液作融合劑，但由于它本身對(duì)細(xì)胞有毒，且誘導(dǎo)融合的頻率不高。目前最常用的化學(xué)融合劑是聚乙二醇（PEG）。第三十一頁(yè)，共五十一頁(yè)。PEG毒性低，且沒(méi)有種、屬、科間的特異性，只要掌握好試劑的分子量、濃度、處理時(shí)間和操作技術(shù)，可得到較高的誘導(dǎo)融合率（一般在10%以上），且誘導(dǎo)的融合體在合適的培養(yǎng)條件下可再生植株。其缺點(diǎn)是易形成多融合體。在PEG溶液中加入融合促進(jìn)劑如刀豆球蛋白A、15%的二甲基亞砜、鏈霉蛋白酶、精胺、亞精胺等，都能明顯提高融合頻率。

第三十二頁(yè)，共五十一頁(yè)。

PEG溶液加到混合原生質(zhì)體懸液中，引起原生質(zhì)體凝集，但PEG誘導(dǎo)融合的機(jī)理目前還不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，將商品PEG純化后就完全失去了誘導(dǎo)融合的能力，但并不影響原生質(zhì)體的凝集。對(duì)純化除去的雜質(zhì)經(jīng)鑒定是一些抗氧化劑，如-生育酚（Ve）和其它酚類(lèi)衍生物。如把純化的PEG與低分子量的脂肪酸結(jié)合應(yīng)用，融合頻率比商品PEG高15~20倍。第三十三頁(yè)，共五十一頁(yè)。

常用的PEG和高pH高Ca相結(jié)合誘導(dǎo)融合的具體操作程序：

混合雙親原生質(zhì)體懸液，吸一小滴懸液于小培養(yǎng)皿中，5~15min后原生質(zhì)體沉到底面形成薄層；每一小滴懸液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG溶液的組成：2難度ml溶液（內(nèi)含0.1mol葡萄糖、10.5mmolCaCI2、0.7molKH2PO4，KOH調(diào)節(jié)pH到5.5）加1gPEG-1560（或4000、6000，其它濃度）

250C保溫15~45min

第三十四頁(yè)，共五十一頁(yè)。

用0.5ml高pH高Ca溶液稀釋?zhuān)?0mmolCaCl2、0.3mol葡萄糖、50mmol甘氨酸、1000ml蒸餾水，NaOH調(diào)pH到10.5）.

15min后加另一滴（約0.5ml）高pH高Ca溶液；

15min后用1~2ml原生質(zhì)體培養(yǎng)基稀釋?zhuān)挥每偭繛?0ml培養(yǎng)基洗滌5次；

在0.5ml左右原生質(zhì)體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第三十五頁(yè)，共五十一頁(yè)。

該技術(shù)從建立（1979）以來(lái)發(fā)展很快。電融合需要有特制的融合儀和融合板，原生質(zhì)體放在板上的兩電極之間。先給兩極通以交變電流，使原生質(zhì)體沿電場(chǎng)方向呈串珠狀排列，接著給以瞬間高強(qiáng)度電脈沖，使原生質(zhì)體膜局部損傷而導(dǎo)致融合。處理時(shí)原生質(zhì)體的適宜密度、CaCI2的濃度、

變電流的強(qiáng)度、電脈沖的大小、脈沖期寬度與間隔都影響融合的頻率。

2）電融合法：第三十六頁(yè)，共五十一頁(yè)。

兩親本原生質(zhì)體融合后形成異核體，進(jìn)行有絲分裂過(guò)程中發(fā)生核融合，形成雜種細(xì)胞：親合的雜種細(xì)胞；部分親合的雜種細(xì)胞；胞質(zhì)雜種；異核質(zhì)雜種；如何將雜種細(xì)胞與未融合的、同源融合的親本細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，是體細(xì)胞雜交技術(shù)的以一重要環(huán)節(jié)。

（2）異核體或雜種細(xì)胞的選擇第三十七頁(yè)，共五十一頁(yè)。類(lèi)型細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)物1234A，BA，B（少量）A（少量），BA（或B）A（或B）A，BA，BA，BA，BA（或B）親和的雜種細(xì)胞部分親和的雜種細(xì)胞胞質(zhì)雜種胞質(zhì)雜種異核質(zhì)雜種第三十八頁(yè)，共五十一頁(yè)。1）利用生長(zhǎng)特性的差異進(jìn)行選擇：

植物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基成分的要求與反應(yīng)不同可作為選擇的依據(jù)。

如粉藍(lán)煙草和朗氏煙草的原生質(zhì)都需要外源激素，但它們間的雜種細(xì)胞能產(chǎn)生內(nèi)源激素，用無(wú)激素的培養(yǎng)基就可將雜種細(xì)胞選出來(lái)；又如曼陀羅與煙草的雜種細(xì)胞愈傷組織比兩親本的愈傷組織生長(zhǎng)得快，這種生長(zhǎng)速度上的差異也可作為選擇的依據(jù)。第三十九頁(yè)，共五十一頁(yè)。

原生質(zhì)體再生植株的能力作為選擇的依據(jù)。

在種內(nèi)、種間、屬間的體細(xì)胞雜交實(shí)驗(yàn)中，只要親本一方能再生植株，雜種細(xì)胞就能再生植株。因而可將原生質(zhì)體的再生能力看作顯性性狀，用來(lái)淘汰無(wú)再生能力的一方親本。再與其它方法相結(jié)合，將能再生的一方親本淘汰，選擇出雜種植株。

第四十頁(yè)，共五十一頁(yè)。

通過(guò)人為的方法導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)基的生長(zhǎng)差異進(jìn)行選擇。

用不同的生化抑制劑處理親本原生質(zhì)體，使其代謝機(jī)能受阻，不能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。如碘乙酸酯處理使原生質(zhì)體核失活，羅達(dá)明6G能抑制氧化磷酸化過(guò)程，這些處理都能使原生質(zhì)體在培養(yǎng)基上不能分裂，而融合后產(chǎn)生的雜種細(xì)胞，由于重建了必要的代謝支路，能在培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)可將其選擇出來(lái)。這是最為簡(jiǎn)便且廣泛應(yīng)用的選擇方法。第四十一頁(yè)，共五十一頁(yè)。

突變細(xì)胞互補(bǔ)選擇是研究的較多的一種選擇方法，包括葉綠素缺失互補(bǔ)、營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)和抗性互補(bǔ)。前兩種為隱性性狀，后一種為顯性性狀，其互補(bǔ)的原理是一致的。

2）利用突變細(xì)胞系互補(bǔ)的方法選擇：第四十二頁(yè)，共五十一頁(yè)。選擇系統(tǒng)原則自養(yǎng)互補(bǔ)白化互補(bǔ)抗性互補(bǔ)自養(yǎng)aB+自養(yǎng)Ab自養(yǎng)AaBb白化aB+白化Ab綠色AaBb抗aB+抗Ab雙抗AaBb第四十三頁(yè)，共五十一頁(yè)。

當(dāng)非等位隱基因控制的兩個(gè)突變細(xì)胞融合后，由于每一親本細(xì)胞貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常的等位基因，糾正了親本對(duì)方的缺陷，使雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。當(dāng)兩個(gè)抗性系的原生質(zhì)體融合時(shí)，每個(gè)親本的藥物敏感性分別被親本對(duì)方的抗性所掩蓋，因而兩個(gè)單抗的親本細(xì)胞融合后產(chǎn)生雙抗的雜種細(xì)胞，用相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基就將雜種細(xì)胞選擇出來(lái)。

第四十四頁(yè)，共五十一頁(yè)。

人們已建立了通用雜交親本。通過(guò)有性雜交將硝酸還原酶缺陷的突變體與抗鏈霉素突變體綜合在一個(gè)突變系中，建立了同時(shí)具有顯、隱性突變的煙草雙突變體。它可以與任何一個(gè)無(wú)選擇標(biāo)記的原生質(zhì)體融合，利用親本對(duì)方對(duì)鏈霉素敏感及雙突變體特殊的營(yíng)養(yǎng)要求（還原氮），很容易用選擇培養(yǎng)基將雜種細(xì)胞選擇出來(lái)。第四十五頁(yè)，共五十一頁(yè)。

目前構(gòu)建的雙突變體的隱性性狀都是硝酸還原酶