讀書(shū)報(bào)告(組內(nèi))課件

南華大學(xué)心血管病研究所，動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室報(bào)告人:尹凱（博士研究生）導(dǎo)師：唐朝克（教授）TOLL樣受體適配蛋白MyD88偶聯(lián)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)與炎癥KASmoak,etal.CellMetabolism,Jun2010;11(6):493-502.（IF：17.35）報(bào)告人:尹凱（博士研究生）TOLL樣受體適配蛋白MyD881一、研究背景1、高密度脂蛋白（HDL）與心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）是其抗動(dòng)脈粥樣硬化（As）的關(guān)鍵機(jī)制。3、最新的研究顯示apoA-I/ABCA1途徑具有抗炎作用，將為As的防治提供新的思路。2、ApoA-I/ABCA1

途徑介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，是RCT的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是目前研究最多的領(lǐng)域。一、研究背景1、高密度脂蛋白（HDL）與心血管疾病的風(fēng)2二、ApoA-I/ABCA1途徑抗炎的可能機(jī)制Kaiyin,Duan-fangLiao,Chao-ketang.ABCA1:APossibleLinkBetweenInflammationAndReverseCholesterolTransport.MolMed,Sep2010;16(9-10):438-49.(IF:5.02)?二、ApoA-I/ABCA1途徑抗炎的可能機(jī)制Kaiyin3三、研究方法1、以脂多糖（LPS）處理的THP-1巨噬細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞模型，觀察apoA-I對(duì)TNFα表達(dá)的影響。2、采用核連綴試驗(yàn)觀察apoA-I對(duì)TNFα轉(zhuǎn)錄的影響。3、利用放線菌素D終止轉(zhuǎn)錄，觀察apoA-I對(duì)TNFαmRNA降解的影響

。4、利用SiRNA干擾等技術(shù)探討apoA-I促進(jìn)TNFαmRNA降解的分子機(jī)制

。三、研究方法1、以脂多糖（LPS）處理的THP-1巨噬4第一部分:ApoA-I通過(guò)轉(zhuǎn)錄后途徑調(diào)節(jié)TNFα表達(dá)四、研究結(jié)果第一部分:ApoA-I通過(guò)轉(zhuǎn)錄后途徑調(diào)節(jié)TNFα表達(dá)四、研5圖1.ApoA-I下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-α蛋白水平圖1.Western-blot檢測(cè)TNF-α的蛋白質(zhì)表達(dá)圖1.ApoA-I下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-α蛋白水平圖1.6圖2.核連綴實(shí)驗(yàn)顯示apoA-I對(duì)TNFα轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯影響圖2：核連綴轉(zhuǎn)錄分析檢測(cè)apoA-I對(duì)TNF-α轉(zhuǎn)錄的影響圖2.核連綴實(shí)驗(yàn)顯示apoA-I對(duì)TNFα轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯影響圖7圖3.ApoA-I顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-αmRNA水平圖3.熒光定量PCR檢測(cè)TNF-α的mRNA表達(dá)水平圖3.ApoA-I顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-αmRNA8圖4.ApoA-I促進(jìn)TNFαmRNA的降解圖4.放線菌素D（actD）終止轉(zhuǎn)錄，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)TNFα的mRNA水平。圖4.ApoA-I促進(jìn)TNFαmRNA的降解圖4.放線9圖5.含TNF-α3`UTR的CAT報(bào)告基因的構(gòu)建pCAT-controlpCAT-TNF-3`UTRpCAT-TNF-3`UTR-AREpCAT-TNF-3`UTR-AREmut圖5.構(gòu)建含TNF-α3`UTR不同序列的

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞。圖5.含TNF-α3`UTR的CAT報(bào)告基因的構(gòu)建pCA10圖6.ApoA-I通過(guò)TNFα3`UTRARE促進(jìn)mRNA降解圖6.ApoA-I通過(guò)TNFα3`UTRARE促進(jìn)mR11第二部分:ApoA-I通過(guò)TTP促進(jìn)TNFαmRNA降解四、研究結(jié)果第二部分:ApoA-I通過(guò)TTP促進(jìn)TNFαmRNA降解四12

圖1.ApoA-I上調(diào)Tristetraprolin(TTP)的表達(dá)

圖1.Western-blot檢測(cè)TTP的蛋白質(zhì)表達(dá)

圖1.ApoA-I上調(diào)Tristetraprolin(T13

圖2.TTPsiRNA抑制apoA-I對(duì)TNFα的下調(diào)作用

圖2A.Western-blot檢測(cè)TTP

SiRNA效果圖2B.TTPSiRNA抑制apoA1對(duì)TNFα的下調(diào)作用

AB

圖2.TTPsiRNA抑制apoA-I對(duì)TNFα的下調(diào)14圖3.TTPsiRNA抑制apoA-I對(duì)TNFαmRNA的降解圖3.PCR檢測(cè)TTPSiRNA對(duì)apoA1促進(jìn)TNF-αmRNA降解的影響圖3.TTPsiRNA抑制apoA-I對(duì)TNFαmRNA15第三部分:ApoA-I通過(guò)激活STAT3促進(jìn)TTP的表達(dá)四、研究結(jié)果第三部分:ApoA-I通過(guò)激活STAT3促進(jìn)TTP的表達(dá)四16圖1.ApoA-I激活THP-1細(xì)胞STAT3圖1A.Western-blot檢測(cè)apoA1對(duì)p-STAT3表達(dá)的影響圖1B.Western-blot檢測(cè)apoA1對(duì)核內(nèi)STAT3表達(dá)的影響AB圖1.ApoA-I激活THP-1細(xì)胞STAT3圖1A.W17圖2.阻斷STAT3抑制apoA-I對(duì)TTP的上調(diào)作用圖2A.Western-blot檢測(cè)AG490對(duì)核內(nèi)STAT3表達(dá)的抑制作用圖2B.Western-blot檢測(cè)AG490對(duì)apoA1促進(jìn)TTP表達(dá)的影響AB圖2.阻斷STAT3抑制apoA-I對(duì)TTP的上調(diào)作用圖218第四部分:ApoA-I通過(guò)ABCA1激活STAT3/TTP途徑四、研究結(jié)果第四部分:ApoA-I通過(guò)ABCA1激活STAT3/TTP19

圖1.ABCA1介導(dǎo)apoA-I對(duì)STAT3的激活作用

ABB圖1A.Western-blot檢測(cè)普羅布考對(duì)ABCA1表達(dá)的影響圖1B.Western-blot檢測(cè)普羅布考對(duì)apoA1作用下STAT3磷酸化的影響

圖1.ABCA1介導(dǎo)apoA-I對(duì)STAT3的激活作用

20圖2.阻斷ABCA1抑制apoA-I對(duì)TTP的上調(diào)作用圖2.Western-blot檢測(cè)普羅布考對(duì)apoA1作用下TTP表達(dá)的影響圖2.阻斷ABCA1抑制apoA-I對(duì)TTP的上調(diào)作用圖221

圖3.阻斷ABCA1抑制apoA-I對(duì)TNFαmRNA的降解

圖3.熒光定量PCR檢測(cè)普羅布考對(duì)apoA1促進(jìn)TNF-αmRNA降解的影響

圖3.阻斷ABCA1抑制apoA-I對(duì)TNFαmRNA的22五、討論TLR4五、討論TLR423六、結(jié)論1.ApoA-I通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)；2.ApoA-I促進(jìn)TTP表達(dá)，并通過(guò)TNF-α3`UTRARE促進(jìn)其

mRNA降解；ApoA-I通過(guò)激活STAT3促進(jìn)TTP表達(dá)，該效應(yīng)直接受ABCA1介導(dǎo)。六、結(jié)論1.ApoA-I通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式抑制LPS誘導(dǎo)24Anyquestion?Thankyou！Anyquestion?Thankyou！25南華大學(xué)心血管病研究所，動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室報(bào)告人:尹凱（博士研究生）導(dǎo)師：唐朝克（教授）TOLL樣受體適配蛋白MyD88偶聯(lián)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)與炎癥KASmoak,etal.CellMetabolism,Jun2010;11(6):493-502.（IF：17.35）報(bào)告人:尹凱（博士研究生）TOLL樣受體適配蛋白MyD8826一、研究背景1、高密度脂蛋白（HDL）與心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）是其抗動(dòng)脈粥樣硬化（As）的關(guān)鍵機(jī)制。3、最新的研究顯示apoA-I/ABCA1途徑具有抗炎作用，將為As的防治提供新的思路。2、ApoA-I/ABCA1

途徑介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，是RCT的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是目前研究最多的領(lǐng)域。一、研究背景1、高密度脂蛋白（HDL）與心血管疾病的風(fēng)27二、ApoA-I/ABCA1途徑抗炎的可能機(jī)制Kaiyin,Duan-fangLiao,Chao-ketang.ABCA1:APossibleLinkBetweenInflammationAndReverseCholesterolTransport.MolMed,Sep2010;16(9-10):438-49.(IF:5.02)?二、ApoA-I/ABCA1途徑抗炎的可能機(jī)制Kaiyin28三、研究方法1、以脂多糖（LPS）處理的THP-1巨噬細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞模型，觀察apoA-I對(duì)TNFα表達(dá)的影響。2、采用核連綴試驗(yàn)觀察apoA-I對(duì)TNFα轉(zhuǎn)錄的影響。3、利用放線菌素D終止轉(zhuǎn)錄，觀察apoA-I對(duì)TNFαmRNA降解的影響

。4、利用SiRNA干擾等技術(shù)探討apoA-I促進(jìn)TNFαmRNA降解的分子機(jī)制

。三、研究方法1、以脂多糖（LPS）處理的THP-1巨噬29第一部分:ApoA-I通過(guò)轉(zhuǎn)錄后途徑調(diào)節(jié)TNFα表達(dá)四、研究結(jié)果第一部分:ApoA-I通過(guò)轉(zhuǎn)錄后途徑調(diào)節(jié)TNFα表達(dá)四、研30圖1.ApoA-I下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-α蛋白水平圖1.Western-blot檢測(cè)TNF-α的蛋白質(zhì)表達(dá)圖1.ApoA-I下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-α蛋白水平圖1.31圖2.核連綴實(shí)驗(yàn)顯示apoA-I對(duì)TNFα轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯影響圖2：核連綴轉(zhuǎn)錄分析檢測(cè)apoA-I對(duì)TNF-α轉(zhuǎn)錄的影響圖2.核連綴實(shí)驗(yàn)顯示apoA-I對(duì)TNFα轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯影響圖32圖3.ApoA-I顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-αmRNA水平圖3.熒光定量PCR檢測(cè)TNF-α的mRNA表達(dá)水平圖3.ApoA-I顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-αmRNA33圖4.ApoA-I促進(jìn)TNFαmRNA的降解圖4.放線菌素D（actD）終止轉(zhuǎn)錄，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)TNFα的mRNA水平。圖4.ApoA-I促進(jìn)TNFαmRNA的降解圖4.放線34圖5.含TNF-α3`UTR的CAT報(bào)告基因的構(gòu)建pCAT-controlpCAT-TNF-3`UTRpCAT-TNF-3`UTR-AREpCAT-TNF-3`UTR-AREmut圖5.構(gòu)建含TNF-α3`UTR不同序列的

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞。圖5.含TNF-α3`UTR的CAT報(bào)告基因的構(gòu)建pCA35圖6.ApoA-I通過(guò)TNFα3`UTRARE促進(jìn)mRNA降解圖6.ApoA-I通過(guò)TNFα3`UTRARE促進(jìn)mR36第二部分:ApoA-I通過(guò)TTP促進(jìn)TNFαmRNA降解四、研究結(jié)果第二部分:ApoA-I通過(guò)TTP促進(jìn)TNFαmRNA降解四37

圖1.ApoA-I上調(diào)Tristetraprolin(TTP)的表達(dá)

圖1.Western-blot檢測(cè)TTP的蛋白質(zhì)表達(dá)

圖1.ApoA-I上調(diào)Tristetraprolin(T38

圖2.TTPsiRNA抑制apoA-I對(duì)TNFα的下調(diào)作用

圖2A.Western-blot檢測(cè)TTP

SiRNA效果圖2B.TTPSiRNA抑制apoA1對(duì)TNFα的下調(diào)作用

AB

圖2.TTPsiRNA抑制apoA-I對(duì)TNFα的下調(diào)39圖3.TTPsiRNA抑制apoA-I對(duì)TNFαmRNA的降解圖3.PCR檢測(cè)TTPSiRNA對(duì)apoA1促進(jìn)TNF-αmRNA降解的影響圖3.TTPsiRNA抑制apoA-I對(duì)TNFαmRNA40第三部分:ApoA-I通過(guò)激活STAT3促進(jìn)TTP的表達(dá)四、研究結(jié)果第三部分:ApoA-I通過(guò)激活STAT3促進(jìn)TTP的表達(dá)四41圖1.ApoA-I激活THP-1細(xì)胞STAT3圖1A.Western-blot檢測(cè)apoA1對(duì)p-STAT3表達(dá)的影響圖1B.Western-blot檢測(cè)apoA1對(duì)核內(nèi)STAT3表達(dá)的影響AB圖1.ApoA-I激活THP-1細(xì)胞STAT3圖1A.W42圖2.阻斷STAT3抑制apoA-I對(duì)TTP的上調(diào)作用圖2A.Western-blot檢測(cè)AG490對(duì)核內(nèi)STAT3表達(dá)的抑制作用圖2B.Western-blot檢測(cè)AG490對(duì)apoA1促進(jìn)TTP表達(dá)的影響AB圖2.阻斷STAT3抑制apoA-I對(duì)TTP的上調(diào)作用圖243第四部分:ApoA-I通過(guò)ABCA1激活STAT3/TTP途徑四、研究結(jié)果第四部分:ApoA-I通過(guò)ABCA1激活STAT3/TTP44

圖1.