教學(xué)第2節(jié)核酸的分離純化課件

第二節(jié)核酸的分離純化第二節(jié)核酸的分離純化1主要內(nèi)容

前言1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性1.2.防止核酸的生物降解2分離提取核酸的主要步驟2.1細(xì)胞的破碎2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除2.3核酸的沉淀2.4核酸的濃度測定2.5核酸的保存主要內(nèi)容前言2

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。前言Home核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是31核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性1.1.1意義：遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，—級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。1.1.2分離核酸原則：

1）溫度不要過高；

2）控制pH值范圍(pH值5-9);

3）保持一定離子強(qiáng)度;

4）減少物理因素對核酸的機(jī)械剪切力.Home1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性41.2防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。1.2防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能51.2.1DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；(2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。1.2.1DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：61.2.2RNA酶（RNAase)抑制劑RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。(1)皂土（bentonite）作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。1.2.2RNA酶（RNAase)抑制劑R7(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。

作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。

使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA時，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）劇毒。(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOO8（3)肝素（4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復(fù)合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)Home（3)肝素Home9(1)高速組織搗碎機(jī)搗碎(2)玻璃勻漿器勻漿(3)超聲波處理法(4)液氮研磨法(5)化學(xué)處理法(SDS、LDS，吐溫80等）(6)生化法（溶菌酶、纖維素酶等）Home2.1細(xì)胞的破碎(1)高速組織搗碎機(jī)搗碎Home2.1細(xì)胞的破碎102.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除112.2.1加入濃鹽溶液（如NaCl）核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；2.2.2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；

2.2.1加入濃鹽溶液（如NaCl）122.2.3酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。2.2.3酚/氯仿抽提13

(1）使用注意酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。(2）安全操作酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時應(yīng)戴手套。使用酚時應(yīng)注意Home(1）使用注意使用酚時應(yīng)注意Home142.3核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。2.3核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。152.3.1核酸沉淀的鹽類及濃度

當(dāng)核酸溶液的pH值大于4時，核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài)，它與1價或2價陽離子形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶解，也不會被有機(jī)溶劑變性。2.3.1核酸沉淀的鹽類及濃度當(dāng)核酸溶液的pH162.3.2有機(jī)沉淀劑

（1）乙醇優(yōu)點：

對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。缺點：

需要量大，一般要求低溫操作。2.3.2有機(jī)沉淀劑（1）乙醇17（2）異丙醇優(yōu)點：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。（2）異丙醇優(yōu)點：18（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點：19（4）精胺

精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。

原理是：精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開，達(dá)到純化DNA的目的。（4）精胺精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。202.3.3核酸沉淀的溫度和時間一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進(jìn)行。低溫長時間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達(dá)到實驗要求。Home2.3.3核酸沉淀的溫度和時間一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低212.4核酸的濃度測定2.4.1紫外分光光度法測DNA和RNA的含量

前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于0.25μg/ml。

結(jié)論：在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。2.4核酸的濃度測定2.4.1紫外分光光度法測DN22紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟a．吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。b．分光光度計先用一定量的水校正零點。c．測定待測樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。d．計算濃度。

雙鏈DNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數(shù)×50/1000；RNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數(shù)×40/1000。e．分析純度。紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟a．吸取一定量的DNA23A：測DNA：

純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260m／OD230應(yīng)大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。2)小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。測定結(jié)果分析A：測DNA：測定結(jié)果分析24B：測RNA純的RNA樣品其OD260／OD280應(yīng)介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0。1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染；2）比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。B：測RNA252.4.2溴乙錠熒光法測定核酸的含量

原理：DNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對照，可比較出被測DNA溶液濃度。

注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。Home2.4.2溴乙錠熒光法測定核酸的含量原理：DNA、RN262.5核酸的保存(1)對DNA

①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②長期保存樣品中可加入1滴氯仿。(2)對RNA

①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;

②長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;

③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。Home2.5核酸的保存(1)對DNAHome27第二節(jié)核酸的分離純化第二節(jié)核酸的分離純化28主要內(nèi)容

前言1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性1.2.防止核酸的生物降解2分離提取核酸的主要步驟2.1細(xì)胞的破碎2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除2.3核酸的沉淀2.4核酸的濃度測定2.5核酸的保存主要內(nèi)容前言29

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。前言Home核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是301核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性1.1.1意義：遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，—級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。1.1.2分離核酸原則：

1）溫度不要過高；

2）控制pH值范圍(pH值5-9);

3）保持一定離子強(qiáng)度;

4）減少物理因素對核酸的機(jī)械剪切力.Home1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性311.2防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。1.2防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能321.2.1DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；(2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。1.2.1DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：331.2.2RNA酶（RNAase)抑制劑RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。(1)皂土（bentonite）作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。1.2.2RNA酶（RNAase)抑制劑R34(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。

作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。

使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA時，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）劇毒。(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOO35（3)肝素（4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復(fù)合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)Home（3)肝素Home36(1)高速組織搗碎機(jī)搗碎(2)玻璃勻漿器勻漿(3)超聲波處理法(4)液氮研磨法(5)化學(xué)處理法(SDS、LDS，吐溫80等）(6)生化法（溶菌酶、纖維素酶等）Home2.1細(xì)胞的破碎(1)高速組織搗碎機(jī)搗碎Home2.1細(xì)胞的破碎372.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除382.2.1加入濃鹽溶液（如NaCl）核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；2.2.2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；

2.2.1加入濃鹽溶液（如NaCl）392.2.3酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。2.2.3酚/氯仿抽提40

(1）使用注意酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。(2）安全操作酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時應(yīng)戴手套。使用酚時應(yīng)注意Home(1）使用注意使用酚時應(yīng)注意Home412.3核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。2.3核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。422.3.1核酸沉淀的鹽類及濃度

當(dāng)核酸溶液的pH值大于4時，核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài)，它與1價或2價陽離子形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶解，也不會被有機(jī)溶劑變性。2.3.1核酸沉淀的鹽類及濃度當(dāng)核酸溶液的pH432.3.2有機(jī)沉淀劑

（1）乙醇優(yōu)點：

對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。缺點：

需要量大，一般要求低溫操作。2.3.2有機(jī)沉淀劑（1）乙醇44（2）異丙醇優(yōu)點：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。（2）異丙醇優(yōu)點：45（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點：46（4）精胺

精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。

原理是：精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開，達(dá)到純化DNA的目的。（4）精胺精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。472.3.3核酸沉淀的溫度和時間一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進(jìn)行。低溫長時間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達(dá)到實驗要求。Home2.3.3核酸沉淀的溫度和時間一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低482.4核酸的濃度測定2.4.1紫外分光光度法測DNA和RNA的含量

前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于0.25μg/ml。

結(jié)論：在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。2.4核酸的濃度測定2.4.1紫外分光光度法測DN49紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟a．吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。b．分光光度計先用一定量的水校正零點。c．測定待測樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。d．計算濃度。

雙鏈DNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數(shù)×50/1000；RNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋