丙二醛檢測(cè)試劑盒(TBA微板法)

丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(TBA微板法)簡(jiǎn)介：動(dòng)物或植物細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激(oxidativestress)時(shí)，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是一種生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物，一些脂肪酸氧化后逐漸分解為一系列包括MDA在內(nèi)的復(fù)雜化合物，此時(shí)通過(guò)檢測(cè)MDA的水平即可檢測(cè)脂質(zhì)氧化的水平，因此MDA的測(cè)定被廣泛用作脂質(zhì)氧化的指標(biāo)。生物體內(nèi)的一些其它生化反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生MDA，例如thromboxanesynthase也可以催化產(chǎn)生，但只要在測(cè)定時(shí)設(shè)置適當(dāng)對(duì)照即可觀(guān)察到脂質(zhì)氧化水平的變化。丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(TBA微板法，MDAAssayKit)又稱(chēng)脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒，是采用一種基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid,TBA)反應(yīng)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物的顯色反應(yīng)，隨后通過(guò)比色法用于對(duì)血漿、血清、尿液、動(dòng)植物組織或細(xì)胞裂解液中MDA進(jìn)行定量檢測(cè)，廣泛用于脂質(zhì)氧化(lipidperoxidation)水平檢測(cè)，特別適用于微量樣本的檢測(cè)。丙二醛在較高溫度及酸性環(huán)境中可與TBA發(fā)生反應(yīng)，形成紅色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在處有最大吸收，據(jù)此可以通過(guò)比色法進(jìn)行檢測(cè)。另外，MDA-TBA加合物也可以在被激發(fā)產(chǎn)生最大發(fā)射波長(zhǎng)，據(jù)此也可以進(jìn)行熒光檢測(cè)。本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。組成：編號(hào)TO1011100T40mg5mlStorage名稱(chēng)試劑(A):TBA試劑(B):TBA稀釋液試劑(C):抗氧化劑試劑(D):MDA標(biāo)準(zhǔn)品(1mmol/L)使用說(shuō)明書(shū)RT避光RT避光0.5ml0.2ml1份4℃-20℃避光自備材料：1、生理鹽水或PBS2、96孔板或離心管、小試管或3、酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)4、水浴鍋或恒溫箱5、離心機(jī)操作步驟(僅供參考)：1、樣本處理：①血清、血漿、尿液、腦脊液樣本：從待測(cè)樣本中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，直接檢測(cè)，如超過(guò)線(xiàn)性范圍，用生理鹽水稀釋后檢測(cè)。②組織、細(xì)胞等樣本：組織或細(xì)胞可以使用PBS或LeageneWestern及IP細(xì)胞裂解液等進(jìn)行勻漿或裂解。勻漿或裂解組織時(shí)，組織重量占勻漿液或裂解液的比例應(yīng)適當(dāng)；對(duì)于細(xì)胞，每106個(gè)細(xì)胞使用l裂解液或勻漿液。勻漿或裂解后，離心，取上清用于后續(xù)測(cè)定。勻漿或裂解等樣品制備步驟宜進(jìn)行操作。樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以便于后續(xù)計(jì)算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的MDA含量。本試劑盒對(duì)于樣品中的常見(jiàn)化學(xué)成分的兼容性參考下表：試劑類(lèi)別緩沖液化學(xué)成分是否干擾HEPES(100mM)否Borate(50mM)Phosphate(100mM)Tris(25mM)否否否去垢劑CHAPS(≤1%)否否TritonX-100(≤1%)Tween20(≤1%)抑制劑/螯合劑EDTA(≤1mM)EGTA(≤1mM)Antipain(≤100μg/ml)Chymostatin(≤10μg/ml)Leupeptin(≤10μg/ml)Trypsin(≤10μg/ml)其他否否PMSF(≤200μM)否否否否否否Glycerol(≤10%)是否Sucrose(250mM)2、TBA工作液的配制：稱(chēng)取適量TBA，用TBA稀釋液配制成濃度為0的TBA工作液。例如取TBA用TBA稀釋液配制，最終濃度即為的TBA工作液。TBA工作液需完全溶解后再使用，可以加熱到促溶，并可通過(guò)反復(fù)劇烈Vortex促溶。配制好的TBA工作液4℃避光保存，至少3－4個(gè)月內(nèi)有效。3、MDA檢測(cè)工作液的配制：臨檢測(cè)前，根據(jù)待測(cè)定的樣品數(shù)(含對(duì)照)，參考下表新鮮配制適量的MDA檢測(cè)工作液。檢測(cè)次數(shù)TBA工作液抗氧化劑1次50μl3μl10次500μl30μl20次1000μl60μlMDA檢測(cè)液總體積150μl203μl1500μl2030μl3000μl4060μl4、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取適量標(biāo)準(zhǔn)品用恰當(dāng)溶液稀釋至1、2、5、10、20、50μM(如果進(jìn)行簡(jiǎn)易快速檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品直接稀釋10μM)。注意：待測(cè)樣品為血清、血漿時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品宜用生理鹽水稀釋?zhuān)淮郎y(cè)樣品由勻漿液、裂解液、PBS獲得時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品宜用相同溶液稀釋。其原則是保證空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管具有可比性。配制好的MDA標(biāo)準(zhǔn)品4℃避光保存，至少3－4個(gè)月內(nèi)有效。5、樣品測(cè)定:在離心管或其它適當(dāng)容器內(nèi)加入勻漿液、裂解液、PBS、生理鹽水等適當(dāng)溶液作為空白對(duì)照(注意：待測(cè)樣品為血清、血漿時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品宜用生理鹽水稀釋?zhuān)淮郎y(cè)樣品由勻漿液、裂解液、PBS獲得時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品宜用相同溶液稀釋。其原則是保證空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管具有可比性)。加入上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(如果進(jìn)行簡(jiǎn)易快速檢測(cè)，直接加入濃度為10μM的標(biāo)準(zhǔn)品)，加入樣品用于測(cè)定；隨后加入MDA檢測(cè)工作液?？蓞⒖枷卤碓O(shè)置檢測(cè)反應(yīng)體系，依次加入試劑：加入物質(zhì)(μl)空白管標(biāo)準(zhǔn)管－測(cè)定管－勻漿液、裂解液、PBS、生理鹽水100等標(biāo)準(zhǔn)品－－100－－待測(cè)樣品MDA檢測(cè)工作液100200200200混勻,加蓋，水浴煮沸，加熱時(shí)務(wù)必注意避免液體暴沸濺出。如果使用加熱塊(Heatblock)進(jìn)行加熱注意用重物壓緊離心管蓋；如果使用沸水浴，則需使用可把蓋子鎖死的離心管或螺旋蓋離心管，或用Parafilm封住離心管口，用針頭刺一小孔。最方便和準(zhǔn)確的加熱方法是使用帶有熱蓋并可以加熱的金屬浴或者PCR儀。水浴或流水冷卻至室溫，離心。取上清，蒸餾水調(diào)零，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值，如果不方便測(cè)定吸光度，也可以測(cè)定之間的吸光度。計(jì)算：對(duì)于血漿、血清或尿液等樣品可以直接根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn))計(jì)算；如果進(jìn)行簡(jiǎn)易快速檢測(cè)，直接以10μM標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行計(jì)算)獲得MDA的摩爾濃度，對(duì)于細(xì)胞、或組織樣品，計(jì)算出樣品溶液中的MDA含量后，可以通過(guò)單位重量的蛋白含量或組織重量等來(lái)表示最初樣品中的MDA含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg組織。簡(jiǎn)易快速血清、血漿、尿液等液體樣品中MDA含量計(jì)算公式：MDA濃度(μmol/L)=(OD測(cè)定-OD空白)/(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白)×10簡(jiǎn)易快速細(xì)胞、組織樣品中MDA含量計(jì)算公式：MDA濃度(μmol//mg)=(OD測(cè)定-OD空白)/(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白)×10//蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/ml)式中：OD測(cè)定=待測(cè)樣品的吸光度值OD標(biāo)準(zhǔn)=標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值OD空白=空白對(duì)照的吸光度值參考區(qū)間：健康成年人血清MDA：9.58±2.15μmol/L健康成年人血漿MDA：7.31±1.27μmol/L注意事項(xiàng)：1、上述低溫試劑避免反復(fù)凍融，以免失效或效率下降。2、參考取樣量：血清、血漿、尿液?。坏兔芏戎鞍讘乙喝?；食用油??；肝臟、心肌、肌肉等，取勻漿。3、測(cè)定樣品吸光度值較低時(shí)，可將水浴延長(zhǎng)，但應(yīng)同時(shí)延長(zhǎng)，以免造成批間差異。4、待測(cè)樣本如不能