第二章微生物常規(guī)鑒定技術詳解演示文稿

第二章微生物常規(guī)鑒定技術詳解演示文稿第一頁，共九十頁。（優(yōu)選）第二章微生物常規(guī)鑒定技術第二頁，共九十頁。一、概述（一）、什么是生化試驗?

指通過利用生物化學的方法來測定微生物的代謝產物、代謝方式和條件等來鑒別細菌的類別、屬種的試驗。第三頁，共九十頁。（二）檢驗細菌的生化試驗范圍1、糖（醇）類代謝試驗2、氨基酸和蛋白質代謝試驗3、有機酸鹽和銨鹽的利用試驗4、呼吸酶類試驗5、毒性酶類試驗第四頁，共九十頁。（三）生化試驗的方法在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑,經接種、培養(yǎng)后,觀察培養(yǎng)基的PH值變化。在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細菌代謝產物所生成的顏色反應。根據酶作用的反應特性，測定酶的存在。根據細菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細菌的生長情況。第五頁，共九十頁。（四）生化試驗的注意事項1、待檢菌應是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18~24h。2、待檢菌應是純種培養(yǎng)物。3、遵守觀察反應的時間。觀察結果的時間，多為24或48小時。4、應做必要的對照試驗。5、提高陽性檢出率，至少挑取2~3待檢的疑似菌落分別進行試驗。第六頁，共九十頁。二、糖醇類代謝試驗（一）糖醇類發(fā)酵試驗（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗（三）V-P試驗（四）甲基紅（MethylRed）試驗MR第七頁，共九十頁。（一）糖醇類發(fā)酵試驗1.原理：不同的細菌對各種糖醇的分解能力及所產生的代謝產物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解1~2種糖醇，有的分解糖醇能產酸產氣，有的分解糖醇只產酸不產氣，根據這些特點，可鑒別細菌。第八頁，共九十頁。常用的糖醇單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖、蕈糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇第九頁，共九十頁。2、試驗方法：用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于糖發(fā)酵管中，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。置36±1.0℃

培養(yǎng)1~3天，每天觀察結果。第十頁，共九十頁。3、結果觀察和記錄記錄：產酸不產氣，陽性，以“+”表示產酸產氣，陽性，以“⊕”表示不產酸產氣，陰性，以“-”表示第十一頁，共九十頁。氣泡導管氣泡氣泡陽性陽性陰性培養(yǎng)基變?yōu)辄S色培養(yǎng)基未變色、無氣泡產生第十二頁，共九十頁。（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗

1、原理：細菌對葡萄糖的分解，分為氧化型和發(fā)酵型。氧化型細菌在有氧的條件下才能分解葡萄糖，無氧的條件下不能分解葡萄糖；發(fā)酵型細菌在有氧無氧條件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的細菌稱為產堿型。根據糖管的色澤變化可鑒別細菌。第十三頁，共九十頁。

2、方法取待檢菌，以穿刺法接種于兩管葡萄糖半固體培養(yǎng)基上，在其中一管加入一層（約1Cm）滅菌的液體石蠟以隔絕空氣，在37℃培養(yǎng)2~4h天，每天觀察結果。第十四頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄封油管未封油管發(fā)酵型產酸（黃色）產酸（黃色）氧化型不產酸（綠色）產酸（黃色）產堿型不產酸（綠色）不產酸（綠色）第十五頁，共九十頁。（三）V-P試驗1、原理：某些細菌能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸經縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為雙乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，雙乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。第十六頁，共九十頁。2、試驗方法（1）奧梅拉（O’Meara）法（2）貝立脫（Barritt）氏法（3）快速法

第十七頁，共九十頁。奧梅拉法：

將試驗菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)48h，每1ml培養(yǎng)液加奧梅拉O’Meara試劑0.1ml，搖動試管1~2min，靜置于37℃恒溫箱4h，或在48~50℃水浴放置2h后判定結果。第十八頁，共九十頁。

3、結果觀察與記錄（1）發(fā)酵管出現紅色者，為陽性，記V-P+（2）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記V-P-第十九頁，共九十頁。（四）甲基紅試驗（MR）1、原理細菌分解葡萄糖產生丙酮酸后，由于代謝的途徑不同，有的細菌可使丙酮酸轉化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅色，為甲基紅試驗陽性；有的細菌使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類中性產物，培養(yǎng)液pH＞5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，為甲基紅試驗陰性。第二十頁，共九十頁。

2、試驗方法：挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃或30℃（以30℃較好）培養(yǎng)3~5天，從第48h起，每日取培養(yǎng)液1ml，加入甲基紅指示劑1~2滴，立即觀察結果。第二十一頁，共九十頁。MR-VP試驗原理及照片V-P第二十二頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱陽性，記MR+；（2）呈橘黃色或黃色為陰性，記MR-，迄至發(fā)現陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，即可判定結果MR+MR-第二十三頁，共九十頁。復習題1、什么是生化試驗?2、做生化試驗要注意哪些事項？3、簡述糖醇類發(fā)酵試驗的原理，寫出其試驗方法和結果的記錄5、簡述甲基紅試驗（MR）的原理，寫出其試驗方法和結果的記錄第二十四頁，共九十頁。（一）靛基質（吲哚）試驗（二）H2S試驗（三）尿素酶試驗（四）氨基酸脫羧酶試驗（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗

(六)明膠（Gelatin）液化試驗三、氨基酸和蛋白質代謝試驗第二十五頁，共九十頁。（一）靛基質試驗1、原理：某些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質（吲哚）。吲哚與對二甲氨基苯甲醛結合，可形成紅色化合物，即玫瑰吲哚，以此鑒別細菌。第二十六頁，共九十頁。

2、試驗方法：所用試劑:（1）柯凡克(Kovacs)試劑;或（2）歐—波試劑第二十七頁，共九十頁。

將待檢菌小量接種于培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)24~48h時后，加入柯凡克試劑數滴，輕搖試管，呈紅色者為陽性。或沿試管壁緩慢加入歐-波試劑約0.5ml覆蓋液面，兩液接觸處呈現玫瑰紅色者，為陽性反應，無紅色者為陰性反應。第二十八頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄呈現玫瑰紅色，為陽性反應，記+

無紅色者，為陰性反應，記-靛基質+第二十九頁，共九十頁。（二）硫化氫（H2S）試驗1、原理：某些細菌可分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸或含硫化合物，產生硫化氫，硫化氫遇鉛鹽或鐵鹽可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鑒別細菌。第三十頁，共九十頁。2、試驗方法：

挑取待檢菌，用穿刺接種法接種于三糖鐵培養(yǎng)上，于36±1℃培養(yǎng)24~48h，觀察結果。第三十一頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽性，記+培養(yǎng)基底部無黑色，為陰性，記-第三十二頁，共九十頁。（三）尿素酶試驗1、原理：某些細菌能產生尿素酶，將尿素分解產生氨，氨使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈粉紅色，培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽性。以此鑒別細菌。

第三十三頁，共九十頁。2、試驗方法：

挑取大量培養(yǎng)18~24h的待試菌，濃密涂布接種于尿素瓊脂斜面上，不要到達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2、4和24h分別觀察一次結果，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽性，顏色不變者為陰性。如陰性應繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定。第三十四頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄培養(yǎng)基變呈粉紅色，為陽性，記+培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記-陽性第三十五頁，共九十頁。（四）氨基酸脫羧酶試驗1、原理：某些細菌能產生氨基酸脫羧酶,可使賴氨酸、鳥氨酸生產脫羧作用,生成胺類物質和CO2。胺類物質使培養(yǎng)基呈堿性變紫色，為陽性,如呈黃色為陰性，以此鑒別細菌。第三十六頁，共九十頁。2、試驗方法取待檢菌，分別接種于含有氨基酸的培養(yǎng)基內和不含氨基酸的對照培養(yǎng)基內，在36±1℃培養(yǎng)1~4天（指示劑為溴甲酚紫），每天觀察結果。第三十七頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄試驗管呈紫色，對照管呈黃色，為陽性，記+試驗管、對照管都呈黃色，為陰性，記-。第三十八頁，共九十頁。試驗管對照管陽性+陰性-對照管變黃試驗管變黃第三十九頁，共九十頁。陽性反應試驗管顏色變化過程紫色→黃色→紫色原理：對照管呈黃色，說明有細菌生長。在培養(yǎng)的早期（10~12h），細菌發(fā)酵葡萄糖產酸使培養(yǎng)液PH下降，指示劑溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，以后由于氨基酸脫羧生成胺，PH又回升至堿性，指示劑顯紫色。第四十頁，共九十頁。陽性反應試驗管顏色變化過程：紫色→黃色→紫色第四十一頁，共九十頁。（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗1、原理：某些細菌可產生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸與氯化鐵作用生成綠色化合物，以此鑒別細菌。第四十二頁，共九十頁。2、試驗方法從待檢菌瓊脂斜面上挑取大量培養(yǎng)物，接種于苯丙氨酸培養(yǎng)基上，在36±1℃培養(yǎng)18~24h后，加入氯化鐵溶液4~5滴，轉動試管，使試劑與菌苔表面充分接觸，立即觀察結果。第四十三頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄試驗管立即出現綠色，為陽性，記+無色為陰性，記-。加氯化鐵試劑出現綠色+第四十四頁，共九十頁。（六）明膠液化試驗

1、原理有些細菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進一步將多肽水解為氨基酸，明膠失去凝膠性質，使培養(yǎng)基由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。第四十五頁，共九十頁。2、試驗方法挑取培養(yǎng)18~24h的待試菌，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。另取一支未接種的培養(yǎng)基一同培養(yǎng)作對照，每天取出兩支試管，放入冰箱放置20~30min后，再觀察結果。第四十六頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄明膠液化，為陽性，+。明膠凝固，為陰性，-。第四十七頁，共九十頁。復習題1、簡述靛基質試驗的原理，寫出其試驗方法、結果的記錄和注意事項2、簡述硫化氫試驗的原理，寫出其試驗結果的記錄和注意事項3、簡述尿素酶試驗的原理，寫出其試驗方法、結果的記錄4、簡述氨基酸脫羧酶試驗的原理，寫出結果的記錄、陽性反應試驗管顏色變化過程和原理第四十八頁，共九十頁。四、有機酸鹽和銨鹽的利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗丙二酸鹽利用試驗第四十九頁，共九十頁。（一）枸櫞酸鹽利用試驗

1、原理：某些細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，分解枸櫞(檸檬)酸鹽生成碳酸鹽；同時分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑溴麝香草酚藍由淡綠轉為深藍色，為陽性。第五十頁，共九十頁。2、試驗方法挑取待檢菌，在西蒙枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上密集劃線接種，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天觀察結果。第五十一頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{色或深藍色，為陽性，記+；無菌苔生長，培養(yǎng)基斜面仍為綠色者，為陰性，記-陽性+第五十二頁，共九十頁。（二）丙二酸鹽利用試驗1.原理:

某些細菌可以利用培養(yǎng)基中的丙二酸鹽作為唯一碳源,丙二酸鹽被分解成碳酸鈉,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,培養(yǎng)基由草綠色變成藍色，為陽性，以此鑒別細菌。第五十三頁，共九十頁。2、試驗方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，接種于丙二酸鈉培養(yǎng)基上，于36±1℃培養(yǎng)48h，觀察結果。第五十四頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄培養(yǎng)基由草綠色變成藍色,為陽性,記+;培養(yǎng)基無顏色變化,為陰性,記-第五十五頁，共九十頁。五、呼吸酶類試驗過氧化氫酶試驗硝酸鹽還原試驗氰化鉀試驗第五十六頁，共九十頁。（一）過氧化氫酶試驗1.原理：某些細菌可分泌過氧化氫酶，加入過氧化氫后，可將過氧化氫分解生成水和氧氣，產生氣泡，即為陽性反應。第五十七頁，共九十頁。2、試驗方法挑取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻片上（或試管），滴加3%過氧化氫液數滴，或在瓊脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過氧化氫液，立即觀察結果。第五十八頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄產生氣泡者，為陽性，記+不產生氣泡者，為陰性，記-第五十九頁，共九十頁。（二）硝酸鹽還原試驗1、原理：某些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，在酸性條件下，亞硝酸鹽可生成亞硝酸，亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再與α-萘胺作用，生成紅色的化合物，呈紅色反應，為陽性反應。第六十頁，共九十頁。試劑A、對氨基苯磺酸試劑B、α-萘胺試劑第六十一頁，共九十頁。2、試驗方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基上接種，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天取2mL培養(yǎng)液,加入A、B試劑的等量混合物各二滴混勻，立即觀察結果。第六十二頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄呈現紅色，為陽性，記+若無紅色出現，為陰性，記-第六十三頁，共九十頁。（四）氰化鉀試驗1.原理：氰化鉀是細菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細菌的生長,但有的細菌在一定濃度的氰化鉀存在時仍能生長,以此鑒別細菌.第六十四頁，共九十頁。2、試驗方法取培養(yǎng)20～24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌落1環(huán)，接種至對照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內，立即以橡膠塞塞緊，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察結果。第六十五頁，共九十頁。3、結果觀察與記錄對照管有菌生長，試驗管有菌生長為陽性，記+。對照管有菌生長，試驗管無菌生長為陰性。記-。第六十六頁，共九十頁。六、毒性酶類試驗溶血試驗卵磷脂酶試驗血漿凝固酶試驗第六十七頁，共九十頁。（一）溶血試驗1、原理：某些細菌在代謝過程中能產生溶血素，可使人或動物的紅細胞發(fā)生溶解，不同的細菌有不同的溶血反應，借此可鑒別細菌。第六十八頁，共九十頁。2、試驗方法有二種：平板法試管法第六十九頁，共九十頁。平板法將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察結果。第七十頁，共九十頁。溶血試驗的溶血類型及現象（1）α（甲型）溶血:菌落周圍出現較窄的半透明的草綠色溶血環(huán)。（2）β（乙型）溶血:菌落周圍出現較寬的透明溶血環(huán)。（3）γ（-丙型）溶血:菌落周圍無溶血環(huán)。第七十一頁，共九十頁。甲型（α-）溶血乙型（β-）溶血丙型（γ-）溶血第七十二頁，共九十頁。（二）血漿凝固酶試驗1、原理：致病性葡萄球菌能產生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，附著在細菌的表面，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現象,為陽性。第七十三頁，共九十頁。2、試驗方法（1）玻片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔（人）血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5min內,如血漿內出現團塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁，則為陽性;如兩者呈均勻混濁，無凝則為陰性。第七十四頁，共九十頁。有凝塊均勻混濁血漿生理鹽水血漿凝固酶試驗第七十五頁，共九十頁。（2）試管法取滅菌小試管3支，各加入血漿0.5ml，1支加入被檢菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液（或濃菌懸液）0.5ml；其余2支作對照管，1支加入金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液0.5ml作陽性對照;另1支加入營養(yǎng)肉湯或0.9％氯化鈉溶0.5ml作空白對照。將3管同時放37℃溫箱或水浴中培養(yǎng)，每0.5h觀察一次，4h內無凝固現象者，觀察直至24小時。第七十六頁，共九十頁。陽性反應陰性反應不凝固少量、零散凝固明顯的塊狀凝固巨大塊凝固完全凝固，倒置不流動第七十七頁，共九十頁。3、試管法的結果觀察與記錄空白對照管的血漿流動自如，陽性對照管血漿凝固，試驗管血漿凝固者為陽性；均無凝固則為陰性。第七十八頁，共九十頁。七、三糖鐵（TSI）試驗第七十九頁，共九十頁。1、三糖鐵試驗的原理如果細菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產酸或產酸產氣，培養(yǎng)基全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質，生成堿性產物，故使斜面最后為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃色。如果細菌又能分解含硫化合物，產生硫化氫，培養(yǎng)基底部變黑。第八十頁，共九十頁。2、試驗方法以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結果。第八十一頁，共九十頁。制好的培養(yǎng)基對照管斜面紅色，底面黃色培養(yǎng)基全黃色斜面、底部黃色，并產生H2S斜面紅色，底部黃色，產生H2S底面黃色，并產生CO2第八十二頁，共九十頁。思考題提問：志賀氏菌都能分解葡萄糖，產酸不產氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產生H2S