常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication常用分子生物學(xué)技術(shù)的第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&BlottingTechnology第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularH核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理核酸分子雜交(nucleicacidhybridiza復(fù)性RNADNA復(fù)性RNADNA（一）印漬技術(shù)

Blotting

首先由EdwenSouthern在1975年提出。Blotting即“印漬”，指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印漬）到固定化介質(zhì)是病加以檢測(cè)分析的技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于DNA、RNA、和蛋白質(zhì)的檢測(cè)

（一）印漬技術(shù)

Blotting首先由EdwenSou探針技術(shù)

probe將一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料對(duì)它的末端或全鏈進(jìn)行進(jìn)行標(biāo)記，稱(chēng)為“探針”然后用于分子雜交，雜交后通過(guò)放射自顯影、熒光檢測(cè)或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來(lái)

探針技術(shù)

probe將一小段已知序列的核酸片段用放射性同位二、印漬技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用DNA印跡技術(shù)SouthernblottingRNA印跡技術(shù)Northernblotting蛋白質(zhì)印跡技術(shù)Westernblotting斑點(diǎn)印跡Dotblotting原位雜交insituhybridizationDNA點(diǎn)陣DNAarrayDNA芯片技術(shù)DNAchip二、印漬技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用DNA印跡技術(shù)Sout（一）DNA印跡技術(shù)

Southernblotting

又稱(chēng)為Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，主要用于基因組DNA的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測(cè)等，亦可用于分析重組質(zhì)粒和噬菌體。在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。（一）DNA印跡技術(shù)

Southernblotting基本方法將DNA標(biāo)本用限制性?xún)?nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段；經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過(guò)毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定，凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過(guò)程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小?；痉椒▽NA標(biāo)本用限制性?xún)?nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分PaperTowelsSouthernBlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿無(wú)水乙醇離心PaperTowelsSouthernBlottingt（二）RNA印漬技術(shù)

Northernblotting又稱(chēng)為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。（二）RNA印漬技術(shù)

Northernblotting又（三）蛋白質(zhì)印漬技術(shù)

Westernblotting又稱(chēng)為Western雜交，或免疫印漬技術(shù)，即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。應(yīng)用：用于檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。

（三）蛋白質(zhì)印漬技術(shù)

Westernblotting又稱(chēng)為三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)斑點(diǎn)印跡

Dotblotting斑點(diǎn)雜交法是不經(jīng)過(guò)電泳，而將被檢標(biāo)本直接點(diǎn)到膜上，烘烤固定，用于雜交。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。斑點(diǎn)印跡

Dotblotting斑點(diǎn)雜交法是不經(jīng)過(guò)電泳，而原位雜交

insituhybridization即組織原位雜交，指組織切片或細(xì)胞涂片直接用于雜交分析。先經(jīng)適當(dāng)處理，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。原位雜交

insituhybridization即組織原第二節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction第二節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)

PolymerasePCR技術(shù)

polymerasechainreactionPCR即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過(guò)變性-延伸-復(fù)性的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍的一種操作技術(shù)。理論上可在2小時(shí)內(nèi)將一個(gè)DNA分子擴(kuò)增到106-109倍，從而大大提高對(duì)其進(jìn)行分析研究的速度。PCR技術(shù)

polymerasechainreacti5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55一、基本工作原理5Primer15Primer2Cycle2CycCycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。Cycle35555555555模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分模板DNA二、PCR體系基本組成成分三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性延伸退火四、PCR的主要用途（一）目的基因的克隆

PCR技術(shù)是迅速獲得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接從組織和細(xì)胞的mRNA獲得已知目的基因片段；利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板，獲得已知的目的基因；利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得具有同源性的DNA片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中隨機(jī)獲得目的基因。

四、PCR的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因的體外突變

采用隨意設(shè)計(jì)的引物，在體外對(duì)基因進(jìn)行嵌合、缺失、點(diǎn)突變等改造。（三）DNA和RNA的微量分析

由于PCR技術(shù)具有高度敏感性，故可用于微量DNA和RNA的分析檢測(cè)。

（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析（二）基因的體外突變?nèi)追N重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理第三節(jié)

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis第三節(jié)

核酸序列分析

Nucleic核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbe一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法)基本原理基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個(gè)或2個(gè)堿基處發(fā)生專(zhuān)一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個(gè)斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標(biāo)記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法)基本原理基于某

化學(xué)裂解法的示意圖化學(xué)裂解法的示意圖二、DNA鏈末端合成終止法二、DNA鏈末端合成終止法目錄目錄三、DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過(guò)四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。三、DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例目錄DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例目錄基因文庫(kù)

GeneLibrary第四節(jié)基因文庫(kù)

GeneLibrary第四節(jié)基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)

基因文庫(kù)(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體?；蚪MDNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定

CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第五節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定

CloningandIdent克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候選基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functional定義從對(duì)一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆應(yīng)用生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。定義（一）功能性克隆應(yīng)用克隆方式

①利用特異性抗體篩選表達(dá)型cDNA文庫(kù)；②根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選cDNA文庫(kù)。

功能互補(bǔ)試驗(yàn)(functionalcomplementationassay)利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。

克隆方式功能互補(bǔ)試驗(yàn)(functionalcomple（二）定位克隆定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作①遺傳學(xué)分析(確定致病基因染色體定位)交換分析、連鎖不平衡分析②分子生物學(xué)分析染色體異常(缺失、易位等)分析、基因文庫(kù)的篩選與基因克?。ǘ┒ㄎ豢寺《x系統(tǒng)的定位克隆工作（三）非定位候選基因克隆策略由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對(duì)各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測(cè)出候選致病基因。（三）非定位候選基因克隆策略由于基因組作圖的完成和分子病理（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們第六節(jié)

遺傳修飾動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第六節(jié)

遺傳修飾動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用TheEstab轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。

轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)——目的基因的受體動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件核轉(zhuǎn)移技術(shù)

即動(dòng)物整體克隆技術(shù)，將動(dòng)物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)核轉(zhuǎn)移技術(shù)二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)基因剔除技術(shù)也稱(chēng)基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)基因剔除技術(shù)三、基因剔除技術(shù)四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動(dòng)物模型①單基因決定疾病模型

基因剔除獲得性突變(gain-of-functionmutation)②多基因決定疾病模型四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動(dòng)物模型第七節(jié)

生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnology第七節(jié)

BiologicalChipTechnoDNA芯片(DNAchip)cDNA芯片(cDNAchip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上

。一、基因芯片基因芯片(genechip)DNA芯片(DNAchip)一、基因芯片基因芯片(gen常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件DNA微陣列DNA是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)?shù)诎斯?jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

ResearchTechnologyofInteractionofProtein第八節(jié)ResearchTechnologyofIn蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過(guò)相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開(kāi)蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過(guò)相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各酵母雙雜交各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選等等常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)酵母雙雜交常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)一、酵母雙雜交技術(shù)的基本原理一、酵母雙雜交技術(shù)的基本原理

二、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用（一）分析已知蛋白之間的相互作用（二）對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析（三）分析未知蛋白相互作用（四）繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜（五）在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用

二、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用（一）分析已知蛋白之間的相互作用常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication常用分子生物學(xué)技術(shù)的第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&BlottingTechnology第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularH核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理核酸分子雜交(nucleicacidhybridiza復(fù)性RNADNA復(fù)性RNADNA（一）印漬技術(shù)

Blotting

首先由EdwenSouthern在1975年提出。Blotting即“印漬”，指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印漬）到固定化介質(zhì)是病加以檢測(cè)分析的技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于DNA、RNA、和蛋白質(zhì)的檢測(cè)

（一）印漬技術(shù)

Blotting首先由EdwenSou探針技術(shù)

probe將一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料對(duì)它的末端或全鏈進(jìn)行進(jìn)行標(biāo)記，稱(chēng)為“探針”然后用于分子雜交，雜交后通過(guò)放射自顯影、熒光檢測(cè)或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來(lái)

探針技術(shù)

probe將一小段已知序列的核酸片段用放射性同位二、印漬技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用DNA印跡技術(shù)SouthernblottingRNA印跡技術(shù)Northernblotting蛋白質(zhì)印跡技術(shù)Westernblotting斑點(diǎn)印跡Dotblotting原位雜交insituhybridizationDNA點(diǎn)陣DNAarrayDNA芯片技術(shù)DNAchip二、印漬技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用DNA印跡技術(shù)Sout（一）DNA印跡技術(shù)

Southernblotting

又稱(chēng)為Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，主要用于基因組DNA的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測(cè)等，亦可用于分析重組質(zhì)粒和噬菌體。在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。（一）DNA印跡技術(shù)

Southernblotting基本方法將DNA標(biāo)本用限制性?xún)?nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段；經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過(guò)毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定，凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過(guò)程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小?；痉椒▽NA標(biāo)本用限制性?xún)?nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分PaperTowelsSouthernBlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿無(wú)水乙醇離心PaperTowelsSouthernBlottingt（二）RNA印漬技術(shù)

Northernblotting又稱(chēng)為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。（二）RNA印漬技術(shù)

Northernblotting又（三）蛋白質(zhì)印漬技術(shù)

Westernblotting又稱(chēng)為Western雜交，或免疫印漬技術(shù)，即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。應(yīng)用：用于檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。

（三）蛋白質(zhì)印漬技術(shù)

Westernblotting又稱(chēng)為三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)斑點(diǎn)印跡

Dotblotting斑點(diǎn)雜交法是不經(jīng)過(guò)電泳，而將被檢標(biāo)本直接點(diǎn)到膜上，烘烤固定，用于雜交。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。斑點(diǎn)印跡

Dotblotting斑點(diǎn)雜交法是不經(jīng)過(guò)電泳，而原位雜交

insituhybridization即組織原位雜交，指組織切片或細(xì)胞涂片直接用于雜交分析。先經(jīng)適當(dāng)處理，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。原位雜交

insituhybridization即組織原第二節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction第二節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)

PolymerasePCR技術(shù)

polymerasechainreactionPCR即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過(guò)變性-延伸-復(fù)性的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍的一種操作技術(shù)。理論上可在2小時(shí)內(nèi)將一個(gè)DNA分子擴(kuò)增到106-109倍，從而大大提高對(duì)其進(jìn)行分析研究的速度。PCR技術(shù)

polymerasechainreacti5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

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5TemplateDNA55

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55一、基本工作原理5Primer15Primer2Cycle2CycCycle355

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525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。Cycle35555555555模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分模板DNA二、PCR體系基本組成成分三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性延伸退火四、PCR的主要用途（一）目的基因的克隆

PCR技術(shù)是迅速獲得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接從組織和細(xì)胞的mRNA獲得已知目的基因片段；利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板，獲得已知的目的基因；利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得具有同源性的DNA片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中隨機(jī)獲得目的基因。

四、PCR的主要用途（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變

采用隨意設(shè)計(jì)的引物，在體外對(duì)基因進(jìn)行嵌合、缺失、點(diǎn)突變等改造。（三）DNA和RNA的微量分析

由于PCR技術(shù)具有高度敏感性，故可用于微量DNA和RNA的分析檢測(cè)。

（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析（二）基因的體外突變?nèi)?、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理第三節(jié)

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis第三節(jié)

核酸序列分析

Nucleic核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbe一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法)基本原理基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個(gè)或2個(gè)堿基處發(fā)生專(zhuān)一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個(gè)斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標(biāo)記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法)基本原理基于某

化學(xué)裂解法的示意圖化學(xué)裂解法的示意圖二、DNA鏈末端合成終止法二、DNA鏈末端合成終止法目錄目錄三、DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過(guò)四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。三、DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例目錄DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例目錄基因文庫(kù)

GeneLibrary第四節(jié)基因文庫(kù)

GeneLibrary第四節(jié)基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)

基因文庫(kù)(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體?；蚪MDNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定

CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第五節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定

CloningandIdent克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候選基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functional定義從對(duì)一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆應(yīng)用生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。定義（一）功能性克隆應(yīng)用克隆方式

①利用特異性抗體篩選表達(dá)型cDNA文庫(kù)；②根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選cDNA文庫(kù)。

功能互補(bǔ)試驗(yàn)(functionalcomplementationassay)利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。

克隆方式功能互補(bǔ)試驗(yàn)(functionalcomple（二）定位克隆定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作①遺傳學(xué)分析(確定致病基因染色體定位)交換分析、連鎖不平衡分析②分子生物學(xué)分析染色體異常(缺失、易位等)分析、基因文庫(kù)的篩選與基因克?。ǘ┒ㄎ豢寺《x系統(tǒng)的定位克隆工作（三）非定位候選基因克隆策略由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對(duì)各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測(cè)出候選致病基因。（三）非定位候選基因克隆策略由于基因組作圖的完成和分子病理（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們第六節(jié)

遺傳修飾動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedA