基因工程蛋白質(zhì)類(lèi)藥物課件

基因工程細(xì)胞因子類(lèi)藥物1基因工程肽類(lèi)激素藥物2重組溶血栓藥物3基因工程酶類(lèi)藥物4基因工程蛋白質(zhì)類(lèi)藥物重組可溶性受體和黏附分子5細(xì)胞因子是指機(jī)體細(xì)胞合成和分泌的小分子多肽類(lèi)因子，它們具有調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能和免疫功能，因而有可能利用基因工程技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，用于治療腫瘤、感染、免疫低下、造血功能障礙等疾病。目前已研制成功或正在研制的基因工程細(xì)胞因子類(lèi)藥物主要有促紅細(xì)胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CF)、干擾素（IFN）、白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子、生長(zhǎng)因子（GF）和凝血因子（F）等。一、基因工程細(xì)胞因子類(lèi)藥物基因重組人促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin,EPO）

EPO是最早發(fā)現(xiàn)并首先運(yùn)用于臨床的造血生長(zhǎng)因子，1985年成功表達(dá)了重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)。rhEPO成為當(dāng)前研究開(kāi)發(fā)最成功的基因工程藥物。EPO是一種主要由腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位合成分泌的多功能糖蛋白激素,是作用于紅系祖細(xì)胞的造血生長(zhǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元的許多功能也具有重要的調(diào)控作用。在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐漸向腎轉(zhuǎn)移，出生后主要由腎小管間質(zhì)細(xì)胞分泌。EPO的產(chǎn)生與機(jī)體供氧狀況有關(guān)，低氧可刺激EPO的產(chǎn)生。促細(xì)胞生成素的生物學(xué)作用EPO主要通過(guò)促進(jìn)骨髓中紅系祖細(xì)胞的存活、增殖和分化以調(diào)控紅細(xì)胞的生成。促進(jìn)系祖細(xì)胞的增殖、分化和成熟調(diào)控神經(jīng)元部分功能對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度也有明顯的調(diào)節(jié)作用人促紅細(xì)胞生成素基因重組天然的hEPO制品一般是從貧血病患者尿中提取的，所以藥源極為匱乏，不能滿(mǎn)足需要。因此，在20世紀(jì)80年代就開(kāi)始rhEPO的研究，從胎兒肝中克隆出hEPO基因,并研制成功rhEPO。1985年美國(guó)FDA批準(zhǔn)rhEPO作為治療腎性貧血的藥物。研制rhEPO的主要環(huán)節(jié)包括:獲得人促紅細(xì)胞生成素基因和建立重組人促紅細(xì)胞生成素的有效表達(dá)系統(tǒng)等。獲得EPO基因構(gòu)建基因組噬菌體文庫(kù)克隆EPO基因血細(xì)胞中提取基因組DNA→BamHⅠ酶切→回收酶切片段→插入噬菌體EMBL3載體中→構(gòu)建基因組噬菌體文庫(kù)→PCR方法從基因組模板中擴(kuò)增EPO基因片段為探針→篩選完整EPO基因的插入片段→克隆人工化學(xué)合成的方法獲得EPO基因：對(duì)部份氨基酸序列進(jìn)行修改利用PCR技術(shù)擴(kuò)增EPO基因：人胎肝中提取總mRNA→RT-PCR技術(shù)克隆hEPO基因重組人促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)系統(tǒng)為了獲得分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性與天然EPO相似的rhEPO，選用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、非洲綠猴腎細(xì)胞COS7表達(dá)系統(tǒng)、幼倉(cāng)鼠腎（BHK）細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。目前國(guó)內(nèi)外首選CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)用來(lái)表達(dá)生產(chǎn)rhEPO。CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能準(zhǔn)確進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后重組蛋白的加工修飾，表達(dá)的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性方面與天然蛋白十分接近。CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，而表達(dá)的外源產(chǎn)物是胞外分泌的，這樣便于產(chǎn)物的下游分離純化；在CHO細(xì)胞內(nèi)重組基因能高效擴(kuò)增和表達(dá)；CHO細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，且具有較高的耐受剪切和滲透壓能力，可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、乳腺表達(dá)系統(tǒng)重組人促紅細(xì)胞生成素治療的不良反應(yīng)rhEPO在治療各種因素所引起的貧血中療效是肯定的，并且長(zhǎng)期應(yīng)用無(wú)毒性、無(wú)器官功能障礙、無(wú)過(guò)敏反應(yīng)或抗體形成。但是也存在一些副作用，最常見(jiàn)的是血壓升高，有的疾病治療過(guò)程中還出現(xiàn)靜脈血栓形成、出現(xiàn)高鉀血癥、頭痛、水潴留等。應(yīng)該特別強(qiáng)調(diào)，雖然使用促紅細(xì)胞生成素能提高紅細(xì)胞的含量，可增強(qiáng)人體的機(jī)能，但長(zhǎng)時(shí)間或大劑量使用會(huì)產(chǎn)生上述嚴(yán)重的副作用，千萬(wàn)不要將此藥作為興奮劑。國(guó)際奧委會(huì)早在20世紀(jì)80年代就已宣布運(yùn)動(dòng)員禁用EPO來(lái)提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)。但是近年來(lái)仍有一些運(yùn)動(dòng)員濫用rhEPO，成為運(yùn)動(dòng)員中最為常用的興奮劑之一。

是對(duì)紅細(xì)胞的生成有增強(qiáng)作用的體液性因子。為分子量6-7萬(wàn)的糖蛋白，糖的含量多，已證明血和尿中都有它的存在。未分化的干細(xì)胞分化成紅細(xì)胞系干細(xì)胞（erythropoietinresponsivecell），促紅細(xì)胞生成素在此發(fā)揮作用，使之變?yōu)榍俺杉t細(xì)胞。對(duì)進(jìn)一步再成熟為成紅血細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞，血紅蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促進(jìn)作用。一般在貧血和低氧狀態(tài)時(shí)，根據(jù)身體組織對(duì)氧的需要，促紅細(xì)胞生成素的供給量將增加，但在腎臟貧血時(shí)其含量則非常低。其生成器官和機(jī)制雖尚未清楚，可是作為某腎臟因子（renalerythropoieticfactor）與血漿的基質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生腎小球的說(shuō)法是有力的。此外，起著相當(dāng)于促紅細(xì)胞生成素作用的因子中，促進(jìn)白細(xì)胞生成的有colonystimulatingfactor，促進(jìn)血小板生成的為促血小板生成素，包括促紅細(xì)胞生成素在內(nèi)，統(tǒng)稱(chēng)為造血促進(jìn)因子。市場(chǎng)前景紅細(xì)胞生成素，超級(jí)“重磅炸彈”基因藥物1985年科學(xué)家應(yīng)用基因重組技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室獲得重組人EPO（rhEPO），1989年安進(jìn)（Amgen）公司的第一個(gè)基因重組藥物Epogen獲得FDA的批準(zhǔn)，適應(yīng)癥為慢性腎功能衰竭導(dǎo)致的貧血、惡性腫瘤或化療導(dǎo)致的貧血、失血后貧血等，其市場(chǎng)表現(xiàn)不俗，1999年銷(xiāo)售值達(dá)到17.6億美元，2000年19.6億美元，2002年22.6億美元，2003年24.4億美元，成為名副其實(shí)的“重磅炸彈”基因藥物。安進(jìn)（Amgen）開(kāi)發(fā)的用于治療惡性貧血癥的第二代促紅細(xì)胞生成素新產(chǎn)品Arnesp2001年得到FDA的批準(zhǔn)，Arnesp2002年初正式上市。Arnesp是一種“高糖基化”促紅素產(chǎn)品，其促進(jìn)紅細(xì)胞生成的能力大大優(yōu)于第一代EPO（促紅細(xì)胞生成素）產(chǎn)品。第一年上市即大獲全勝，贏得開(kāi)們紅，Aranesp2002年全年銷(xiāo)售額為4.2億美元，2003年全年銷(xiāo)售額為15.4億美元。估計(jì)在今后3年內(nèi)，Arnesp將創(chuàng)造10億~15億美元的市場(chǎng)銷(xiāo)售額并奪取現(xiàn)有EPO生產(chǎn)商的部分市場(chǎng)，其市場(chǎng)前景不可估量。2001年，EPO（包括Arnesp）的全球銷(xiāo)售額達(dá)21.1億美元，2002年達(dá)26.8億美元，2003年全世界EPO的年銷(xiāo)售額超過(guò)50億美元。創(chuàng)下生物工程藥品單個(gè)品種之最，是當(dāng)今最成功的基因工程藥物。強(qiáng)生（Johnson&Johnson）公司的促紅細(xì)胞生成素Procrit/Eprex更是表現(xiàn)不俗，2001年銷(xiāo)售額34.42億美元，2002年銷(xiāo)售額42.69億美元，2003年銷(xiāo)售收入達(dá)到39.84億美元。目前，國(guó)內(nèi)已有10多家單位獲準(zhǔn)生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素。沈陽(yáng)三生和上海麒麟鯤鵬（中國(guó)）生物藥業(yè)的產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)醫(yī)院的銷(xiāo)售額獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷，2001年EPO的國(guó)內(nèi)醫(yī)院銷(xiāo)售總額約為47449萬(wàn)元，2002年為49508萬(wàn)元，2003年上半年為28606萬(wàn)元。估計(jì)國(guó)內(nèi)的年市場(chǎng)容量在20到30億元左右，但目前年銷(xiāo)售額只有區(qū)區(qū)5億元左右。長(zhǎng)效紅細(xì)胞生成素1EPO融合蛋白2其他促紅細(xì)胞生成素3新型促紅細(xì)胞生成素長(zhǎng)效紅細(xì)胞生成素新紅細(xì)胞生成刺激蛋白(NESP)：是美國(guó)Amgen公司研制的長(zhǎng)效EPO制劑,于2001年6月底獲得歐洲藥物評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn),用于慢性腎衰引起的貧血。NESP是一種高糖基化rhEPO類(lèi)似物,也是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床的新型促紅細(xì)胞生成素,具有rhEPO相似的作用機(jī)制即刺激紅系造血。NESP含5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)及比rhEPO高2倍的唾液酸殘基,在一級(jí)結(jié)構(gòu)中多了5個(gè)氨基酸和N端另外2個(gè)糖基化位點(diǎn),從而達(dá)到較大的代謝穩(wěn)定性和3倍于rhEPO的半衰期(36h,rhEPO為4～8h),可減少給藥次數(shù)。其副作用與EPO相同。迄今為止尚未檢測(cè)出NESP抗體。NESP是一種安全、