酶工程第十節(jié)酶與現(xiàn)代生命科學(xué)

關(guān)于酶工程第十節(jié)酶與現(xiàn)代生命科學(xué)第1頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

一、酶是分子生物學(xué)研究的重要工具

酶是分子生物學(xué)研究的重要工具。特別是限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)提供了特異剪切DNA的工具,促進(jìn)了DNA重組技術(shù)誕生,推動了基因工程發(fā)展,成為分子生物學(xué)研究的不可缺少的工具.

HindⅡ的識別序列和切割位點(diǎn)

↓

5’---GTPyPUAC–-3’

3’---CAPUPyTG–-5’

↑

第2頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

限制性內(nèi)切酶在基因工程中的應(yīng)用

基因工程（geneticengineering），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術(shù)。它是根據(jù)人們預(yù)先設(shè)想，采用酶學(xué)的方法，將目的基因（所需要的基因）重組到一個適宜的載體上組成重組子，再將重組子轉(zhuǎn)化到適當(dāng)受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增表達(dá)，以達(dá)到改造生物細(xì)胞的目的的技術(shù)?；蚬こ痰恼麄€過程由工程菌（細(xì)胞）的設(shè)計構(gòu)建和基因產(chǎn)物的生產(chǎn)兩大部分組成。前者主要在實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行，其單元操作過程如下：第3頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六第4頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

基因工程的單元操作過程如下：（1）從供體細(xì)胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA（包括外源基因或目的基因）和載體分子切開。（2）用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子上，形成DNA重組分子。（3）借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中。（4）短時間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子或使其整含到受體細(xì)胞的基因組中。（5）篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞。

第5頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

關(guān)于限制性內(nèi)切酶

Restrictionendonueleases

限制性核酸內(nèi)切酶簡稱限制性內(nèi)切酶，是一類能識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列并具有專一切割位點(diǎn)的脫氧核糖核酸水解酶。主要存在于細(xì)菌、霉菌中，至今已分離到1000種以上，搞清識別序列的有300種以上。第6頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

有關(guān)限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)的幾個重要實(shí)驗(yàn)

50年代初，Luria和Human在研究T4噬菌體感染作用、Bertani和Weigle在研究和P2噬菌體與宿主細(xì)胞關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌內(nèi)限制與修飾現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌內(nèi)存在限制修飾系統(tǒng)，在這兩個系統(tǒng)中包括限制酶和修飾酶。限制酶能識別并降解與自身無關(guān)的外源DNA，而修飾酶則可通過甲基化修飾自身DNA，免被限制酶降解。

第7頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六Bertani和Weigle大腸桿菌噬菌體感染實(shí)驗(yàn)

Bertani和Weigle在探索和P2噬菌體與宿主細(xì)胞關(guān)系時，均提出了噬菌體感染大腸桿菌后，宿主細(xì)胞對入侵的噬菌體DNA表現(xiàn)有特異的限制作用。?CEcoli.CEcoli.CEcoli.K12大量繁殖受到抑制第8頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六Meselson和Yuan實(shí)驗(yàn)

噬菌體

?K12和

?C的DNA分別與由K12菌體制備的細(xì)胞抽提物保溫，并藉蔗糖密度梯度離心觀察兩種DNA沉降速度的變化。?K12DNA?CDNA加入K12菌體制備的細(xì)胞抽提物蔗糖密度梯度離心第9頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

實(shí)驗(yàn)表明，這種限制的本質(zhì)是宿主細(xì)胞K12中存在有能使外來DNA(?CDNA)有限降解的核酸水解酶。

此后，又進(jìn)一步證實(shí)了大腸桿菌K12中的修飾體系即為甲基化酶，該酶修飾了

?K12DNA上的特異部位，使其不被限制體系的酶切割。結(jié)論表明：第10頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六1965年阿爾伯首次從理論上提出了生物體內(nèi)存在著一種具有切割基因功能的限制性內(nèi)切酶。并于1968年成功分離出I型限制性內(nèi)切酶與修飾酶。證實(shí)在細(xì)菌內(nèi)存在兩種不同功能但又相關(guān)的酶。1970年史密斯從流感噬血桿菌d株中分離出了II型限制性內(nèi)切酶；同年內(nèi)森斯使用該酶降解獼猴腫瘤病毒SV40的DNA，首次完成了對基因的切割，排列了酶切圖譜。從此成為分子克隆技術(shù)中不可缺少的工具酶，推動了基因工程的發(fā)展。1978年，上述三人因?qū)ο拗菩詢?nèi)切酶的貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎。第11頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六阿爾伯(1929～)瑞士微生物遺傳學(xué)家

H.O.史密斯(1931～)美國分子生物學(xué)家、遺傳學(xué)家

內(nèi)森斯(1928～)美國微生物遺傳學(xué)家

第12頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

限制性內(nèi)切酶命名規(guī)則

限制酶的命名從其來源微生物的拉丁名中摘取，即由其屬名的第一個字母(大寫)與種名的第一、二兩個字母(小寫)組成酶的基本命名，若酶的產(chǎn)生菌有株系之分，則有4個或4個以上拉丁字母組成，其第四個字母之后表示株系。如EcoRI來源于Echerichia.coli

RY13BamHI來源于B.amyloliquefaciens第13頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六HindIIHaemophilus(屬名)Influenzae(種名)d(株系)羅馬數(shù)字限制性內(nèi)切酶命名舉例第14頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

限制性內(nèi)切酶分類已發(fā)現(xiàn)的限制酶可以分為三類或稱作三型：I、II、III型。他們在酶反應(yīng)中所需要的輔因子和切割DNA的位點(diǎn)都不相同，而且酶蛋白分子的大小和組成上也有差別。第15頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

類別反應(yīng)必須因子專一性

活性I型S-腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+識別部位和切點(diǎn)不同，無特定切割位點(diǎn)內(nèi)切甲基化II型Mg2+切斷識別部位或其附近的特定部位只有限制酶活性III型ATP，Mg2+識別部位和切點(diǎn)不同，但切斷特定部位內(nèi)切甲基化限制性內(nèi)切酶分類第16頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六第17頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

二、

II型限制性內(nèi)切酶的特性

II型限制酶的識別特異性

回文識別序列

II型限制酶的識別序列大多是具有雙重對稱結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu),或稱回文序列

(PalindromicSequence)第18頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

非典型回文識別序列

回文識別序列被一至幾個其他核苷酸（N）所間隔，得到的是非典型的雙軸對稱性序列。

BglI

GCCNNNNNGGCMstII

CCTNAGG第19頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

非回文識別序列

也有些限制酶識別序列非回文結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在距識別序列5至13個bp處。5’GACGCNNNNN

3’3’CTGCGNNNNNNNNNN

5’例：HgnI

GACGC第20頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

有些限制酶可識別多重序列。如：HindII，識別序列為GTPyPuAC，可識別三種序列。GTPyPuACGTCAACGTCGACGTTAACGTTGAC嘌呤（Purine）嘧啶（Pyrimidine）類似的內(nèi)切酶還有AccI、AvaI、BanI、HaeI等，它們的特異性低于單一識別序列的酶。第21頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

識別序列的長度與剪切頻率

大部分II型限制性內(nèi)切酶的識別序列長度為4-8個核苷酸。識別長度決定了剪切DNA的頻率（1/4n，n為識別的長度）。識別長度愈長，則切點(diǎn)少、產(chǎn)生片段少而長度長，酶特異性高。第22頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六限制酶的切割特異性和酶切片段的末端結(jié)構(gòu)

切割位點(diǎn)專一作為工具酶的限制性內(nèi)切酶有固定的切割位點(diǎn)；產(chǎn)物具有特定的末端結(jié)構(gòu)當(dāng)一個DNA分子被限制酶切開后形成兩個末端，全部產(chǎn)物具有相同的末端結(jié)構(gòu)。即一種限制性內(nèi)切酶切割任何DNA只產(chǎn)生一種固定形式的末端結(jié)構(gòu)，在DNA連接酶的作用下，磷酸二酯鍵可以修復(fù)而成為一個重組的DNA分子；而不同限制酶則形成不同末端結(jié)構(gòu)。5’-G3’-CTTAA

+AATTC-3’G-5’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

DNA連接酶5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’第23頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

任何一種限制酶切割DNA鏈時，總是水解核苷酸

3’、5’-磷酸雙酯鍵的3’位磷酸酯鍵，使產(chǎn)物的5’端帶磷酸單酯基團(tuán)，而3’為游離羥基。由于切割位點(diǎn)不同，所有的限制酶可產(chǎn)生兩類末端結(jié)構(gòu)

①平末端（BluntEnd）指酶切片段為齊頭末端結(jié)構(gòu)。②粘性末端（CohesiveEnd）酶切后DNA片段末端帶有

1-4個核苷酸殘基長度的單鏈結(jié)構(gòu)，而片段兩端突出的單鏈具有互補(bǔ)的序列。粘性末端又可分為5‘-粘性末端與

3’-粘性末端。

5’

NOH3’

5’PO4N3’第24頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六第25頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六粘性末端3’-粘性末端5’-粘性末端平末端5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’EcoRI

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’第26頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

有沒有例外？（1）相同的限制性內(nèi)切酶不總是產(chǎn)生匹配的片段A）含多重識別序列的限制酶

如

HindII在順序GTPyPuAC

剪切，可產(chǎn)生3種不同類型片段，互相連接的可能性為1/3。B）含非典型識別序列的限制酶如EcoNI在順序CCTNNNNNAGC剪切，N可以是任何核苷酸，由于N的隨意性，往往會產(chǎn)生不廣泛匹配的片段。C）在次理想條件下，限制酶表現(xiàn)出星狀活性，影響正常匹配。第27頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

（2）不同的限制性內(nèi)切酶有時可以產(chǎn)生匹配的片段

例：BamHIGGATCC BclITGATCA BglIIAGATCT

這類能產(chǎn)生相同粘性末端而識別特異性不同的限制酶稱作同尾限制酶（Isocaudarner）。同尾限制酶產(chǎn)生的DNA片段可借DNA連接酶互相重組，但新產(chǎn)生的雜合序列將不再被原有的限制酶所識別。

5’-G

GATCT-3’

DNA

5’-GGATCT-3’

3’-CCTAG

A-5’

連接酶

3’-CCTAGA-5’

(BamHI片段)(BglII片段)(產(chǎn)生雜合識別序列)第28頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

酶反應(yīng)條件

按手冊或商品說明書反應(yīng)緩沖液：根據(jù)不同酶使用高、中或低鹽緩沖液。常用的緩沖液選擇Tris-Hcl

。同時還要加入Mgcl2

和2-巰基乙醇。反應(yīng)溫度：一般限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)溫度是37○c。酶活性單位：1個酶活性單位是指一種酶在其最適宜的反應(yīng)條件下，1小時使1μgλ噬菌體DNA

底物完全水解的酶量。但由于許多因素可影響內(nèi)切酶的水解反應(yīng)和用量，實(shí)際用量需比所需用量多加一倍左右。第29頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

第二活性

在次理想條件下,一些限制性內(nèi)切酶的特異型會被降低,只有部分正常識別位置被識別,此稱為第二活性（SecondaryActivity），也稱星號活性（StarActivity），加以“*”表示，如EcoRI*。酶的第二活性將引起底物DNA鏈上切口增多，酶解片斷變小，造成特異性降低。例：理想條件下（PH=7.5）EcoRIGAATTC

次理想條件下（PH=8.5）EcoRI*AATT次理想條件：通常包括不適合的離子強(qiáng)度、過高的PH、二價金屬離子的替換、較高的甘油濃度等。第30頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

限制酶的保質(zhì)期

一般是在檢定日以后的一年內(nèi)，但幾乎所有的限制酶在超過保質(zhì)期后都不會急劇失活,因此購入后即使是經(jīng)過長時間保存的酶,也完全可以使用，但這些酶在使用前最好再測一次活性。另外，保存酶時即便讓其凍結(jié)，大部分酶也不會急劇失活。第31頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六EcoRI第32頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六PstI第33頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六SmaIreturn第34頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

研究酶的理化性質(zhì)及其作用原理，對于闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律具有十分重要的意義（包括酶的結(jié)構(gòu)功能、酶與代謝調(diào)節(jié)、酶與生物的生長、發(fā)育、進(jìn)化、疾病等）。

從酶分子水平去探討酶與生命活動、與代謝調(diào)節(jié)、與疾病、生長發(fā)育等等的關(guān)系，對闡明某些生命活動的本質(zhì)和規(guī)律，無疑也具有十分重要的意義。

二、酶是生命科學(xué)研究的重要對象第35頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

同功酶同工酶(isoenzyme)是指催化的化學(xué)反應(yīng)相同，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶,存在于生物的同一種屬或同一個體的不同組織、甚至同一組織或細(xì)胞中。目前已發(fā)現(xiàn)有150多種酶具有同工酶，如6-磷酸葡萄糖脫氫酶、乳酸脫氫酶、酸性和堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸磷酸激酶、核糖核酸酶、過氧化酶和膽堿酯酶等。其中，發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的是乳酸脫氫酶（LDH）同工酶.第36頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六例：LDH同工酶的兩種亞基以不同比例組成五種四聚體：LDH1(H4)、LDH2(H3M)、LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)和LDH5(M4)。

DogfishLDHM4結(jié)構(gòu)圖

第37頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

同功酶與物種進(jìn)化

同工酶是生物進(jìn)化過程中為適應(yīng)愈趨復(fù)雜的代謝而引起的一種分子進(jìn)化，以適應(yīng)不同組織或不同細(xì)胞器在代謝上的不同需要.

同功酶在各器官和組織中的分布不同。這樣就可以根據(jù)同工酶酶譜差異并配合其它方法從分子水平探討物種進(jìn)化、遺傳變異等一些生命現(xiàn)象。第38頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

在正常情況下血清中同功酶譜是相對穩(wěn)定的。當(dāng)某一組織或器官發(fā)生病變時，就有某種特殊的同工酶釋放出來，引起血清中同功酶活性的改變。對病人及正常人同工酶電泳圖譜進(jìn)行比較，有助于上述器官疾病的診斷。

在臨床上已應(yīng)用同工酶做診斷指標(biāo),例如:

冠心病及冠狀動脈血栓引起的心肌受損者血清中LDH(H4)及LDH2(MH3)含量增高;

而肝細(xì)胞受損患者血清中LDH5(M4)增高。第39頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

同功酶與其它

同工酶的研究不僅在臨床血液病、腫瘤及其它疾病的診斷方面占有重要地位，而且在分子遺傳學(xué)、物種鑒定、法庭取證、親子鑒定、優(yōu)生優(yōu)育等領(lǐng)域中也具有廣闊的應(yīng)用前景。

第40頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

腫瘤的酶異常

腫瘤酶異常原因：1、腫瘤過多或過少產(chǎn)生酶2、腫瘤阻塞了酶通過的導(dǎo)管系統(tǒng)3、腫瘤誘導(dǎo)酶產(chǎn)生4、細(xì)胞通透性改變使可溶性酶進(jìn)入血液循環(huán)

第41頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

臨床診斷還沒有單一指標(biāo)可確診癌，所以酶測定可作為一種輔助手段，如：測定血清淀粉酶——胰腺癌酸性磷酸酶——前列腺癌亮氨酸氨肽酶、硫酸酯酶、乳酸脫氫酶等同工酶譜變化———肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌。第42頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六端粒酶

端粒、端粒酶與腫瘤發(fā)生的關(guān)系是近年來腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。有研究表明,端粒酶在85%～95%的惡性腫瘤組織中有陽性表達(dá),而在正常體細(xì)胞則一般為陰性。因此端粒酶抑制劑的研究為惡性腫瘤的早期診斷、預(yù)后估計及基因治療開辟了一個新的途徑。第43頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六

端粒(telomere)

真核細(xì)胞染色體末端以TTAGGG6個堿基序列重復(fù)組成的DNA結(jié)構(gòu)人體細(xì)胞染色體端粒長度約為5～15Kb,其功能在于保護(hù)染色體免受核酶降解,防止斷端融合重排或降解。如果端粒長度縮短到極限如4Kb以下時,細(xì)胞則會喪失分裂增殖能力而發(fā)生凋亡,該過程稱為監(jiān)控點(diǎn)激活(checkpointactivation)。端粒縮短被認(rèn)為是正常細(xì)胞分裂與老化的分子信號,端粒被稱為細(xì)胞壽命的“分裂鐘”。第44頁，共51頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)9分，星期六端粒的保護(hù)機(jī)制

在真核細(xì)胞,端粒DNA的富G鏈較富C鏈超出約12～16bp,形成3′端的突出單鏈結(jié)構(gòu),而端粒蛋白質(zhì)能夠特異地識別這一突出區(qū)域并與之結(jié)合,再通過進(jìn)一步的折疊、盤曲,從而形成染色體末端