乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測

乙型肝炎病毒核苷(酸)類似物耐藥的監(jiān)測

繆曉輝2009.5一、HBV耐藥的有關定義二、各種耐藥檢測技術的評價三、需要重視的幾個問題一、HBV耐藥的有關定義

病毒學突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化學突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐藥（genotypicresistance）HBV表型耐藥（phenotypicresistance）臨床耐藥（clinicalresistance）HBV耐藥的有關定義

病毒學突破（virologicbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA水平與最低值相比上升或超過1個log10（10倍）。HBV耐藥的有關定義

病毒反跳（viralrebound）指核苷類藥物治療過程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治療前水平。

HBV耐藥的有關定義

生化學突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平一度復常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標很多，但是在此僅指ALT。HBV耐藥的有關定義

HBV基因型耐藥（genotypicresistance）指HBV基因組中的某些位點發(fā)生改變，導致這種藥物對HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐藥性有直接因果關系，通過這些變異位點的檢測可判斷HBV有無耐藥性。HBV耐藥的有關定義

HBV表型耐藥（phenotypicresistance）通過體外細胞培養(yǎng)方法，直接測定HBV對某種藥物的敏感性，或者在體外直接測定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來評估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐藥IC50

＞10倍:耐藥HBV耐藥的有關定義

臨床耐藥（clinicalresistance）指臨床出現(xiàn)病毒復制不能被抑制，或HBV復制一度被抑制后又出現(xiàn)HBVDNA反跳，同時伴有ALT升高，或肝炎復發(fā)的其他臨床證據(jù)。二、各種耐藥檢測技術及評價病毒學反跳或突破的監(jiān)測HBV基因型耐藥監(jiān)測HBV表型耐藥檢測臨床耐藥監(jiān)測病毒學學反跳跳或突突破的的監(jiān)測測基于對對血清清HBVDNA載載量的的動態(tài)態(tài)監(jiān)測測需重視視以下下三點點：1.HBVDNA載載量檢檢測手手段的的敏感感性2.檢檢測技技術的的可靠靠性和和穩(wěn)定定性3.監(jiān)監(jiān)測的的間隔隔時間間HBV基因因型耐耐藥監(jiān)監(jiān)測時機非必須須不主張張常規(guī)規(guī)、廣廣泛應應用基因型型耐藥藥相關關變異異的命命名基因型型耐藥藥相關關變異異在在HBV多多聚酶酶序列列中的的位置置HBV基因因型耐耐藥的的主要要技術術堿基序序列分分析法法直接測測序克隆測測序聚合酶酶鏈式式反應應及限限制性性片段段長度度多態(tài)態(tài)性技技術(PCR-RFLP)反向雜雜交分分析技技術（（INNO—LiPA））基因芯芯片技技術實時熒熒光定定量PCR技術術探針定定點突突變PCR技術術引物末末端堿堿基定定點突突變擴擴增技技術熔解曲曲線法法基質輔輔助激激光解解吸電電離飛飛行時時間質質譜(MALDI-TOFMS)直接測測序法法末端終止法化學裂解法DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進行延伸反應，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產生一簇各種長度的短鏈，經過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標記，計算機自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應用廣泛。不需酶促反應，可以對寡核苷酸測序。①簡便、快速、準確可靠。②安全、無放射性污染。③模板用量大大減少。④測序能力增強。HBVYMDD變變異直直接測測序結結果圖圖譜直接DNA測序序的局局限性性1.設備貴貴、技技術高高、耗耗材、、費時時。2.必必須有有充足足目的的基因因片段段。3.突突變株株比例例小于于20%時時，由由于競競爭抑抑制作作用不不能被被擴增增。直接測測序法法檢測測HBVYMDD變異異1.JPG克隆測測序法法克隆測測序法法優(yōu)點：：1.有有助于于發(fā)現(xiàn)現(xiàn)混合合株并并可大大致確確定不不同序序列毒毒株之間的的相對對比。。2.提提高了了檢測測的靈靈敏度度。局限性性：1.技技術難難度較較高。。2.檢檢測周周期更更長。。3.檢檢測的的費用用大大大增加加。堿基變變異可可能導導致：：①原原有位位點消消失②產產生新新的位位點③識識別位位點移移位利用錯錯配引引物使使PCR產產物中中產生生特特異異的酶酶切位位點結果:酶酶切切片段段長、、短變變化和和多、、少變變化聚合酶鏈式式反應及限限制性片段段長度多態(tài)態(tài)性技術(PCR-RFLP)限制性內切切核酸酶的的作用它們能識別別DNA的的特異序列列，并在識識別序列內內或其旁切切割雙鏈DNA。如如：NdeI限制酶的識識別序列和和切割位點點：CATATGGTATACNlaIll限制酶的識識別序列和和切割位點點：CATGNNNGTACNNNPCR-RFLP檢檢測測HBVYMDD變異異PCR錯配配引引物物設設計計PCR-RFLP檢檢測測HBVYMDD變異異PCR-RFLP檢檢測測HBVYMDD變異PCR-RFLP技術術的評價價優(yōu)點：簡單、廣廣泛易開開展。缺點：1.限制制性內切切酶種類類有限。。2.錯配配引物將將導致退退火溫度度降低、、非特異異條帶增增多。3.引物非非完全匹配配，可能導導致擴增效效率降低、、檢測敏感的下降降。反向雜交分分析技術（（INNO—LiPA）INNO——LiPA診斷HBVYMDD變異異DNA芯片片技術BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysisDNA芯片片技術診斷斷HBVYMDD變異DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。JKoreanMedSci2004;19:541-546.DNA芯片片技術優(yōu)點局局限性大通量技技術和設設備的要求求高快速檢檢測成成本高靈敏度高可平行檢測測實時熒光定定量PCR在基因變變異中的應應用探針定點突突變PCR技術Taqman-MGB探針引物末端堿堿基定點突突變擴增技技術高分辨熔解解曲線法Taqman-MGB探針定定點突變PCR技術術Taqman-MGB探針技技術檢測YMDD變異HBVDNA>105copies/mlW:M=1:1HBVDNA>105copies/mlW:M=10:1HBVDNA<105copies/mlW:M=10:1：W：M探針定點突突變PCR技術優(yōu)點不不足靈敏度高需要相對較較貴的熒光光PCR儀儀特異性好需要多條熒熒光探針，，成本高費時短影響因素多多，存在一一定誤判引物末端堿堿基定點突突變擴增技技術引物末端堿堿基定點突突變擴增技技術

檢測測YMDD變異熔解曲線法法檢測YMDD變異異特異性探針針，其Tm值不同溶解曲線分分析基質輔助激激光解吸電電離飛行時時間質譜(MALDI-TOFMS)原理MALDI-TOFMS檢檢測

HBVYMDD變異異的原理酶切分子量量.JPG基質輔助激激光解吸電電離飛行時時間質譜(MALDI-TOFMS)優(yōu)點：高靈敏度、、準確度、、分辨率能發(fā)現(xiàn)相對對比例小于于1%的變變異株。局限性：設備昂貴，，目前國內內難以用于于臨床檢測測。HBV耐藥藥不同檢測測技術的比比較AdvancesinMolecularDiagnosisofHBVInfectionandDrugResistance。。Int.J.Med.Sci.20052(1)：8-161Sensitivityherereferstothelowestlevel(%)atwhichanassaycandetectmixturesofmutantandwild-typevirus.2Informationcontentisconsideredasameasureofatest’sabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.3Updateabilityassessestheeaseatwhichatestcanbedaptedtoincorporatethedetectionofanewmutation.na,notapplicable.nd,notdetermined.HBV表型型耐藥檢測測有兩種途徑徑：1.細胞外外HBV聚聚合酶活性性分析。2.細胞藥藥物敏感性性實驗。細胞外HBV聚合酶酶活性分析析目前常用的的研究HBV聚合酶酶活性模型型是將HBV基因組組插入桿狀狀病毒載體體，繼而轉轉染昆蟲細細胞而表達達HBV顆顆粒，應用用親和層析析法純化HBV顆粒粒后，在細細胞外評價價藥物對聚聚合酶活性性的影響。。細胞外HBV聚合酶酶活性分析析細胞藥物敏敏感性實驗驗該方法類似似于細菌藥藥物敏感試試驗。目前前多采用病病毒載體將將含有被檢檢測的含HBV變異異位點的全全基因組導導入肝細胞胞源性細胞胞株，然后后將各種濃濃度的核苷苷類藥物加加入培養(yǎng)液液，經過一一定時間培培養(yǎng)后檢測測細胞上清清中的HBVDNA含量。。細胞藥物敏敏感性實驗驗細胞藥物敏敏感性實驗驗該技術在操操作上非常常繁瑣，目目前僅限于于研究之需需，主要用用于藥物開開發(fā)研究，，尚不能用用于常規(guī)臨臨床分析。。臨床耐藥監(jiān)監(jiān)測YMDD變變異前后病病毒載量和和ALT的的變化HBVMDD變異異與病毒學學突破判斷臨床耐耐藥時的建建議1.結合合核苷類藥藥物的應用用史、起始始病毒載量量、是否合合并其他肝肝病等。2.注意甄甄別依從性性不良。3.結合基基因變異位位點。三、需要重重視的幾個個問題慎重對待天天然耐藥的的結論。不要過分依依基因型耐耐藥檢測技技術。正確對待基基因分型技技術。YMDD自自然變異的的幾組數(shù)據(jù)據(jù)AkarsuM等等采用InnoLipa法法檢測71例未經抗抗病毒的成成年慢性乙乙肝攜帶者者，結果有有13例檢檢測到YMDD變異異株。LeeCZ等采用用引物末端端堿基定點點突變擴增增技術對28例拉米米夫定治療療前的CHB患者血血清進行了了YMDD變異毒株株檢測，發(fā)發(fā)現(xiàn)有16例（57.1%））存在YMDD自然然變異毒株株。日本Kobayashi等檢檢測18例例無癥狀HBV攜帶帶者,發(fā)現(xiàn)現(xiàn)5例YMDD變異異,占27.78%。本實驗室關關于YMDD自