上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件

第五章DNA及基因組第五章1BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2007:

HumanGeneticVariation

21DECEMBER2007SCIENCEBREAKTHROUGHOFTHEYEAR2007:2BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2008:

ReprogrammingCells

iPS(inducedpluripotentstemcell)Runners-Up:

DirectViewsofExoplanets

TheDNAofCancerNewClassofHigh-TSuperconductors

Proteinfloppingandfolding

SplittingWater

BeginningofLife,theMovieColorCodedFat

ComputingtheBasics

DNAontheCheap

BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2008:3拓展伽馬射線天空脫落酸受體（abscisicacid,ABA）發(fā)現(xiàn)模擬磁單極子長壽健康

科學家揭示月球存在冰基因治療回來了

石墨烯研究取得新進展哈勃重生第一臺X射線激光器閃亮登場BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2009:

Ardipithecusramidus

（始祖地猿）

Runners-Up:

拓展伽馬射線天空BREAKTHROUGHOFTHEY42010年科研熱點

IPS細胞

宇宙射線眼

外顯子組研究生物化學戰(zhàn)勝癌癥？

人類太空飛行

2010年科研熱點IPS細胞5一、核酸研究簡史第一階段：核酸的發(fā)現(xiàn)第二階段：發(fā)現(xiàn)核酸是遺傳物質第三階段：為分子生物學奠定基礎的時期第四階段：分子生物學高速發(fā)展時期第一節(jié)DNA的結構與功能一、核酸研究簡史第一階段：核酸的發(fā)現(xiàn)第二階段：發(fā)現(xiàn)核酸61889年R.Altman從動物細胞與酵母菌中制備了核酸

1869年F.Miescher從膿細胞中得到核質“Nuclein”第一階段：核酸的發(fā)現(xiàn)1894年A.Kossel和A.Neumann從胸腺中提取核酸1889年R.Altman從動物細胞與酵母1869年71930年正式提出核酸分為兩大類：核糖核酸（RNA）脫氧核糖核酸（DNA）1904年Hammars證明核酸中的糖是戊糖.1909年Levene和Jacobs鑒定核酸中的糖是D-核糖.1912年Levene認為核酸由4種核苷酸組成1929年Levene和Jacobs確定胸腺核苷酸中的糖是2-脫氧-D-核糖

1930年正式提出核酸分為兩大類：1904年Hammar8第二階段：發(fā)現(xiàn)核酸是遺傳物質1944年Avery等揭示了DNA是細菌的遺傳物質有莢膜的光滑型肺炎球菌（S型）致病無莢膜的粗糙型肺炎球菌（R型）不致病第二階段：發(fā)現(xiàn)核酸是遺傳物質1944年Avery等揭示了9

R型菌R型菌R型菌+＋＋S型菌DNAS型菌DNAS型菌DNA（經蛋白酶水解）（經核酸酶水解）↓↓↓部分克隆變?yōu)椴糠挚寺∽優(yōu)椴荒茏優(yōu)镾型菌S型菌S型菌R型菌R型菌101952年HersheyChase通過噬菌體感染細菌的實驗表明病毒的遺傳物質是DNA。1952年Hershey111953年J.D.Watson和F.Crick建立了DNA雙螺旋結構模型

第三階段：為分子生物學奠定基礎的時期1953年J.D.Watson和F.Crick建立第121958年*Kornberg等發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶(DNApolymerase)

*

Meselson等提出半保留復制，闡明DNA復制的機理*Crick提出了遺傳信息傳遞的中心法則1958年*Kornberg等發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶*C131965年中國科學家人工合成牛胰島素1970年Temin等發(fā)現(xiàn)了從RNA→DNA反轉錄現(xiàn)象，使中心法則更完善1961年以后Jacob、Nirenberg和Monod等取得三個有意義的進展：1)證實了mRNA攜帶著DNA到蛋白質合成機制所需要的信息2)發(fā)現(xiàn)了遺傳密碼3)發(fā)現(xiàn)了蛋白質依靠tRNA和核糖體的幫助翻譯1965年中國科學家人工合成牛胰島素1970年Temin14遺傳信息傳遞的中心法則

（centraldogma）DNAmRNA轉錄多肽鏈翻譯蛋白質翻譯后加工DNA復制逆轉錄RNA復制遺傳信息傳遞的中心法則

（centraldogma）DNA15第四階段：分子生物學高速發(fā)展時期1.1971年限制性內切酶發(fā)現(xiàn)，DNA的分離成為可能第四階段：分子生物學高速發(fā)展時期1.1971年限制性內162.直讀核苷酸序列方法(1975年Sanger發(fā)明)2.直讀核苷酸序列方法173.DNA體外重組技術(1972年Berg發(fā)明)

3.DNA體外重組技術181982年中國科學家人工合成酵母丙氨酸t(yī)RNA1985年Mullis建立PCR技術1981年T.Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA前體的自我拼接,稱為ribozyme.

1982年中國科學家人工合成酵母1985年Mulli19人類科學史上的三大工程人類基因組計劃曼哈頓原子計劃阿波羅登月計劃

1990年美國正式啟動人類基因組計劃。(humangenomeproject,HGP)

人類科學史上的三大工程人類基因組計劃曼哈頓原子計劃阿波羅登201999年7月我國得到完成人類3號染色體短臂上一個約30Mb區(qū)域的測序任務，該區(qū)域約占人類整個基因組的1%，簡稱1%項目。提前兩年于2001年8月26日,繪制完成“中國卷”，贏得了國際科學界的贊譽。

上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件212003年4月美、英、日、法、德、中等國政府首腦聯(lián)名發(fā)表《六國政府首腦關于完成人類基因組序列圖的聯(lián)合聲明》。2003年4月221997年英國愛丁堡羅斯林研究所首次育成克隆羊。

1997年英國愛丁堡羅斯林研究所首次23水稻基因組（RiceGenome）2001年10月，中科院、科技部和國家計委聯(lián)合向全世界宣布，中國率先完成水稻（秈稻）基因組工作“框架圖”的繪制2002年4月5日，在Science雜志上以封面文章的形式發(fā)表。水稻基因組（RiceGenome）2001年10月，24**后基因組計劃（post-genomeproject）

又稱為功能基因組學（functionalgenomics）**蛋白質組（proteome）計劃又稱為蛋白質組學（proteomics）**后基因組計劃（post-genomeproject）25**隨著許多新的RNA功能陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，2000年各國科學家提出了RNA組的研究，稱為RNA組學（RNomics）**生物信息學(bioinformatics)**系統(tǒng)生物學(systemsbiology)**隨著許多新的RNA功能陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，26二、DNA研究的臨床應用1.疾病發(fā)病機理的研究1）遺傳性疾病

基因變異或基因缺陷是疾病發(fā)生的根本原因如:鐮刀狀紅細胞性貧血的致病因素是由于珠蛋白第6位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

二、DNA研究的臨床應用27

如：心血管疾病Ⅲ型高脂蛋白血癥的形成主要是由于ApoE基因中第112位和第158位的G和C發(fā)生變異，蛋白質肽鏈上原來Arg變成Cys，失去與ApoE受體結合的能力，使血脂升高

28

2）腫瘤癌基因激活和抑癌基因失活→分化受阻→腫瘤細胞（永生型）如：上世紀70年代發(fā)現(xiàn)了癌基因（H-ras)與抑癌基因(Rb)。

2）腫瘤29

2.

疾病的基因診斷DNA診斷：*快速DNA點雜交*限制性內切酶酶譜分析法*DNA限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP）*聚合酶鏈反應（PCR）產前診斷、植床前診斷

2.

疾病的基因診斷產前診斷、植床前診斷30

ABKb123123Kb8.3hcs-L

6.7hcs-B5.8hcs-A3.8hGH-N3.0hGH-V1.2hHG-V25.021.817.914.8單純性生長激素缺乏癥(IGHD)(isolatedgrowthhormonedeficience)圖中A為BamHI酶解片段與hGHcDNA探針雜交放射自顯影圖B為HindIⅢ酶解片段與hGHcDNA探針雜交放射自顯影圖1為正常人.2為IGHD患者.3為雜合子DNA

hcs為人絨毛膜促乳素.hGH為人生長激素A31父親母親孩子…GTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGT……GTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGT……GTCGTACGTGACACACACACACACACACACACAGTACGATACGT……GTCGTACGTGACACACACACACACACACAGTACGATACGT……GTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGT……GTCGTACGTGACACACACACACACACACAGTACGATACGT…父親母親孩子46bp42bp40bp42bp42bp46bp40bp42bp40bpPCR結果的凝膠電泳：圖：某個CA2核苷酸重復的微衛(wèi)星在一個家系中的PCR檢測結果示意圖短串聯(lián)重復(shorttandemrepeat,STR)多態(tài)性分析父親母親孩子…GTCGTACGTGACACACACACACA323.

疾病的預防與基因治療1）采用基因工程產生疫苗藥物2）基因治療3.

疾病的預防與基因治療33世界首例癌癥疫苗由美國Merck公司研制，專門針對人乳頭狀瘤病毒（HPV）的疫苗——“加德西”（Gardasil），2006年6月8日獲得美國FDA的上市批準。這是世界上第一個，也是惟一一個獲準上市的用來預防由HPV

6、11、16和18型引起的宮頸癌和生殖器官癌前病變的癌癥疫苗，保護率超過95%。

該癌癥疫苗的推出，將是人類首次真正嘗試通過疫苗將一種癌癥徹底消除。

德國科學家拉爾德·楚爾·豪森2008年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎世界首例癌癥疫苗由美國Merck公司研制，專門針對人乳頭狀瘤34構件分子—核苷酸nucleotide核苷nucleoside

磷酸phosphate

堿基bases戊糖pentose

嘧啶pyrimidine

嘌呤purine

核糖ribose

脫氧核糖deoxyribose三、核酸的結構核酸（多核苷酸Polynucleotide)（一）分子組成構件分子—核苷酸nucleotide核苷nucleoside351.含氮有機堿（1）嘧啶堿：胞嘧啶Cytosine

胸腺嘧啶Thymine

尿嘧啶Uracil（2）嘌呤堿：腺嘌呤Adenine鳥嘌呤Guanine

1.含氮有機堿36上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件37堿基上有修飾：核苷的大寫字母前加上代表修飾基團的小寫字母右上方寫明堿基的第幾位

m2G表示2-N-甲基鳥苷

位置

m3227G表示N2，N2，7-三甲鳥苷

數量

S4U表示4-硫代尿嘧啶甲基(3)稀有堿基堿基上有修飾：m2G表示2-N-甲基鳥苷38R苷R苷392.戊糖2.戊糖40順式腺苷反式腺苷3.核苷：C-N糖苷鍵

嘌呤堿N9嘧啶堿N1戊糖C1順式腺苷反式腺苷3.核苷：C-N糖苷鍵嘌呤堿N9戊糖C141**順式和反式構象的定義:相對于糖的一部分,堿基沿糖苷鍵C’-N(對于嘧啶是N1,對嘌呤是N9)?？梢圆扇?種主要的取向,順式和反式構象。**順式和反式構象的定義:42假尿苷51’假尿苷51’434.

核苷酸4.核苷酸441’2’3’4’5’1’2’3’4’5’45上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件465’3’環(huán)核苷酸cAMP、cGMP

表示磷酸與3’、5’核苷羥基相接

5’3’環(huán)核苷酸47（二）、游離核苷酸的功能ATP、GTP、UTP、CTP參于代謝5FU（5－氟尿嘧啶）抗癌藥物6MP（6－巰基嘌呤）抗癌藥物5’-碘脫氧尿苷治療病毒性心肌炎AZT抗AIDS病毒（Azidothymidine疊氮基胸苷）cAMP、cGMP第二信使

（二）、游離核苷酸的功能48（三）DNA的一級結構1.DNA的一級結構是指脫氧核苷酸（堿基）在DNA分子中的排列順序2.DNA分子中脫氧核苷酸的連接方式

3’，5’磷酸二酯鍵3.直線形DNA有二個末端：5’磷酸末端3’羥基末端

（三）DNA的一級結構49

A.分子結構式B．線條式C．字母式

A.分子結構式501)端粒DNA的結構

真核生物線性染色體末端的DNA序列,稱為端粒。端粒DNA序列相當保守，端粒DNA的3’末端是由數百個串聯(lián)的重復序列，長5-10kb。重復序列由G-T豐富的6個核苷酸組成。人:5’-AGGGTTAGGGTT-------3’

4.端粒（telomere）DNA結構與功能

1)端粒DNA的結構4.端粒（telomere）51熒光原位雜交顯示端粒和端粒序列熒光原位雜交顯示端粒和端粒序列52端粒的重復序列是由端粒酶（telomerase）合成后添加到染色體末端。端粒酶是一種核糖核蛋白復合物，具有逆轉錄酶的性質，以物種專一的內在RNA為模板，把合成的DNA添加到染色體的3‘端。端粒起到細胞分裂計時器的作用，核苷酸復制和基因DNA每復制一次，端粒減少50-100bp，正常體細胞染色體缺乏端粒酶活性，故隨細胞分裂而變短，細胞隨之衰老。人的生殖細胞，部分干細胞染色體，腫瘤細胞和永生細胞系具有端粒酶活性。端粒的重復序列是由端粒酶（telomerase）合成后添加到53上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件54

2）端粒DNA的功能a保證線性DNA的完整復制b維持染色體的穩(wěn)定c決定細胞的壽命2）端粒DNA的功能552009諾貝爾生理學或醫(yī)學獎------

端粒酶（telomerase）ElizabethBlackburnJackSzostakCarolGreider2009諾貝爾生理學或醫(yī)學獎------

561)DNA分子十分巨大，最小的DNA分子也包含有幾千bp，分子量在106以上。人類基因組含有約3.1647×109bp。5.DNA的一級結構特點1)DNA分子十分巨大，最小的DNA分子5.DNA的一57上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件58

2)每一物種DNA都具有其特有的堿基組成3)有些堿基常被甲基修飾，稱為甲基化(methylation)2)每一物種DNA都具有其特有的堿基3)有些堿基常被甲基59(1)細菌DNA甲基化①各種細菌都具有一定的甲基化模式，在DNA分子中平均1%的堿基被甲基化。②甲基化最多的是腺嘌呤和胞嘧啶(1)細菌DNA甲基化①各種細菌都具有一定的甲基化模式60③細菌DNA甲基化作用的生物學意義a.影響DNA的構象,影響蛋白質與DNA的相互作用,以調節(jié)DNA復制、轉錄、修復、重組和包裝的過程。如：發(fā)生在-GATC-的腺嘌呤，于DNA復制產生的錯誤堿基修復中起作用b.多發(fā)生于內切酶酶切位點，防止噬菌體入侵，是一種細菌自身保護機制。

③細菌DNA甲基化作用的生物學意義61(2)真核細胞的DNA甲基化①真核細胞DNA中胞嘧啶甲基化最多，約5%,甲基化為5-甲基胞嘧啶，大多數甲基化發(fā)生在CpG重復序列中。②真核細胞中甲基化酶與去甲基化酶成雙成對存在，都對CpG二核苷酸序列有特異性，使甲基化與去甲基化成為可逆的生物學過程。(2)真核細胞的DNA甲基化62③多種基因的啟動子區(qū)和第一外顯子（60％）富含CpG，稱為CpG島，通常為非甲基化狀態(tài)。散在的CpG則為甲基化的。④DNA甲基化通常抑制基因表達，與人類發(fā)育和腫瘤疾病關系密切。

③多種基因的啟動子區(qū)和第一外顯子（60％）63

**CpG島：在基因的末端通常存在一些富含雙核苷酸“CG”的區(qū)域，稱為“CpG島”

①通過分析5-甲基胞嘧啶在真核細胞基因組中的分布,發(fā)現(xiàn)CpG島的存在，這些區(qū)域是非甲基化的，通常為1-2kb，絕大多數在基因的5’末端。

**CpG島：在基因的末端通常存在一些富含64②在人類基因組內，存在有近3萬個CpG島；在大多數染色體上，平均每100萬堿基含有5～15個CpG島，這些CpG島不僅是基因的一種標志，而且還參與基因表達的調控和影響染色質的結構。

②在人類基因組內，存在有近3萬個CpG島；65

6.DNA的一級結構的測定1)雙脫氧末端終止法――Sanger法

2)化學法――Maxan-Gilbert法6.DNA的一級結構的測定66Sanger雙脫氧末端終止法測序的基本原理Sanger雙脫氧末端終止法測序的基本原理67Maxan-Gilbert化學法測序基本原理Maxan-Gilbert化學法測序基本原理68DNA自動序列測定的基本原理DNA自動序列測定的基本原理69第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快70第二步：熒光檢測第二步：熒光檢測71DNA全自動分析儀：ABIPrism?

3700型全自動遺傳分析儀安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)型號：MegaBACE500/1000/4000

DNA全自動分析儀：ABIPrism?3700型全自動遺72（四）DNA的二級結構Dr.CrickDr.Watson（四）DNA的二級結構Dr.Crick731.DNA雙螺旋結構的提出Watson和Crick在1953年提出了著名的DNA雙螺旋結構模型。這個模型不僅解釋了DNA的理化性質，而且將結構與功能聯(lián)系起來，大大推動了分子生物學的發(fā)展。

1.DNA雙螺旋結構的提出74**雙螺旋提出的根據1)DNA纖維晶體的x-衍射研究1952年Wilkins等2)Chargaff的堿基分析A＝TG＝CA＋T／G＋C的比值不同來源DNA是不同的3)

堿基和核苷酸的結晶學資料上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件75

Chargaff原則（1）不同種生物DNA分子中的核苷酸排列順序不同

（有種族特異性）（2）同種生物不同組織器官細胞中DNA分子的核苷酸排列順序相同

(無組織器官特異性)（3）某一特定生物，其DNA堿基組成恒定（4）任何生物DNA堿基組成都符合

A=T，G=C，A+G=T+CChargaff原則76上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件77a.DNA雙鏈反向平行

b.堿基配對

*A＝TG≡C*堿基是一個平面環(huán)分子。堿基平面垂直于螺旋軸*相鄰堿基相距0.34nm，每10個堿基旋轉1圈，雙螺旋螺距為3.4nm，相鄰兩個堿基正好相差3602.DNA的雙螺旋結構的特點：1)B型DNA結構

a.DNA雙鏈反向平行2.DNA的雙螺旋78上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件79

堿基配對結構基堿基配對結構基80c．在DNA雙螺旋分子上交替存在著大溝和小溝蛋白質通過大溝和小溝識別堿基序列的特異性，其中大溝對于的識別、結合尤為重要。c．在DNA雙螺旋分子上交替存在著81d．維持雙螺旋的力量氫鍵堿基堆積力（basestackingforce）堿基平面疊在一起，存在VanderWaals力堿基疏水性，在雙螺旋內部形成疏水的力量

離子鍵d．維持雙螺旋的力量823.DNA的右手螺旋和左手螺旋*DNA構象與核苷酸順序堿基組成有關并取決于環(huán)境條件（鹽類、相對濕度）

*主要構象類型：右手螺旋：A、B、C、D、E、T型DNA左手螺旋：Z型DNA3.DNA的右手螺旋和左手螺旋83濕度和鹽類對DNA構象的影響多核苷酸鹽類相對濕度％構象類型Na+75ANa+92BLi+44CLi+66BT2噬菌體DNANa+60TDNA－RNA雜合鏈Na+33－92A天然RNA（逆轉錄病毒）Na+高達92ANa+43ZNa+高達92ALi+81B天然DNAPoly(dG-dC)濕度和鹽類對DNA構象的影響多核苷酸鹽類相對濕度％構象類型N84上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件85

右手螺旋1）B型生理條件下最普遍的形式2）A型RNA雙螺旋及DNA－RNA雜交鏈（空間位阻小，有利于轉錄）3）C型線粒體DNA及一些病毒4）D型、E型存在于噬菌體等生物中

右手螺旋86

3.左手螺旋Z型DNA1)發(fā)現(xiàn):1979年A.Rich等人工合成六聚體d（CGCGCG）單晶進行X－射線衍射分析，數據表明是Z型骨架,左手雙螺旋DNA

2)Z－DNA的結構特點:每個螺旋由12個堿基對構成，螺距4.46nm，直徑1.8nm

3.左手螺旋Z型DNA87上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件88

b.脫氧胞苷的堿基取反式構象，脫氧鳥苷的堿基是順式。在Z－DNA中G－C交替而出現(xiàn)順式和反式構象交替。使糖-磷酸的主鏈的走向呈“之”字型，這

樣Z-DNA主鏈呈鋸齒狀（Zig-Zag）走向。

c.大溝消失，小溝變深

b.脫氧胞苷的堿基取反式構象89

d.體內存在的Z-DNA序列特點:(1)DNA序列必須是嘌呤嘧啶交替排列如：CGCGCGGCGCGC(2)序列中必須有5-甲基胞嘧啶的存在

d.體內存在的Z-DNA序列特點:90E.與Z-DNA結合的特殊蛋白質F．Z-DNA有利于DNA的負超螺旋打開G．抗Z-DNA抗體E.與Z-DNA結合的特殊蛋白質913）Z-DNA的功能：①基因表達有關Z-DNA抗體常常緊密地結合在染色體的疏松部位,增強轉錄活性的位點。

3）Z-DNA的功能：92②基因調控Hochschild等報道,一旦發(fā)現(xiàn)細菌調控蛋白緊密結合于它的調控位點,就通過RNA聚合酶來激活相關基因的表達,Z-DNA可能參與識別調控蛋白質。

②基因調控93③基因重組Willia等做的黑粉菌實驗指出,Z-DNA在基因重組中起非常重要的過渡作用.在黑粉菌中有一種rec1酶能使染色體第一次配對后互相交換片段,在配對時由rec1酶使Z-DNA的雙鏈產生,并且這種酶與Z-DNA親和力比B-DNA高75倍,Z-DNA與rec1酶緊密結合是這一時期的主要特征.③基因重組94④疾病治療與新藥開發(fā)Kim等研究表明,一種關鍵的痘病毒蛋白E3L蛋白(已知該蛋白是病毒摧毀動物細胞的防御系統(tǒng)所必需的)是通過Z-DNA結合、干擾防御系統(tǒng)的運行來行使功能的。E3L是牛痘的致病蛋白質之一，通過修飾該蛋白質的活躍位點可以使其喪失功能。④疾病治療與新藥開發(fā)95表2右手螺旋與左手螺旋DNA分子的比較__________________________________________________項目A-DNAB-DNAZ-DNA__________________________________________________螺旋方向右旋右旋左旋每轉1圈堿基數1110．412螺旋直徑2.55nm2.37nm1.84nm螺距2.46nm3.32nm4.56nm堿基平面的傾角19olo9o大溝窄，很深寬，較深平小溝很寬，淺窄，較深很窄,深__________________________________________________表2右手螺旋與左手螺旋DNA分子的比較964.三螺旋DNA（HDNA）三螺旋DNA（triple-helicalDNA)三鏈DNA（triplestrandsofDNA)是一條DNA鏈在DNA的大溝與DNA雙螺旋中的一條DNA鏈以氫鍵相結合形成的三股螺旋結構。

4.三螺旋DNA（HDNA）97上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件981）三螺旋DNA結構：（1）三螺旋DNA是在DNA雙螺旋結構的基礎上形成的，三鏈區(qū)的三鏈均為同型嘌呤（homopurineHPU）或同型嘧啶(homopyrimidineHPY）1）三螺旋DNA結構：99

（2）

根據三條鏈組成及相對位置又可分為

Pu-Pu-Py（偏堿性介質中穩(wěn)定）Py-Pu-Py（偏酸性介質中穩(wěn)定）（3）

鏈中的堿基配對方式兩個堿基符合Watson-Crick堿基配對“-”，另個堿基按Hoogsteen模型“·”即T·A-TC＋·G-C

(第三位上的“C”必須質子化)A·A-T

（2）根據三條鏈組成及相對位置又可分為（3）鏈中100上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件101嘧啶核苷酸嘌呤核苷酸(a)嘧啶-嘌呤-嘧啶三螺旋DNA序列(b)三螺旋DNA結構示意圖ab嘧啶核苷酸嘌呤核苷酸(a)嘧啶-嘌呤-嘧啶三螺旋DNA序列a1022）生物學意義及應用：(1)三螺旋DNA結構常位于DNA一些重要的部位。如復制的起始點或終點，轉錄的調控區(qū)或調節(jié)蛋白結合位點以及DNA重組位點，提示與這些功能相關。(2)豐富了DNA結構學說2）生物學意義及應用：103b.用寡聚DNA片段封閉轉錄因子結合點關閉有害基因活病毒基因。（抗腫瘤，病毒，寄生蟲等）(3)基因治療中的應用

a.單鏈DNA片段可攜帶切割劑（核酸內切酶，EDTA-Fe等）攜帶至DNA的特定位點，選擇性切斷DNA。b.用寡聚DNA片段封閉轉錄因子結合(3)1045.四螺旋DNA1)發(fā)現(xiàn)在真核染色體末端含有一個富含G的單鏈DNA尾巴，它在體內的超螺旋應力作用下，可自身回折形成HoogsteenG-G堿基對。兩個DNA分子或染色體分子可彼此連接起來形成一個局部的四螺旋結構。5.四螺旋DNA105上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件1062)四螺旋DNA的結構*四螺旋結構由多個G-四堿基體形成右手螺旋，每圈含13個四堿基體DNA。

*在四堿基體中，四條鏈以對稱和反對稱構象交替存在。2)四螺旋DNA的結構*在四堿基107上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件1083)可能的生物學意義兩個DNA分子或染色體分子可彼此連接起來形成一個局部的四螺旋結構,這種結構可能起著穩(wěn)定染色體的作用

3)可能的生物學意義109（五）DNA超螺旋結構（三級結構）1.DNA三級結構就是指雙螺旋DNA鏈進一步扭曲、盤旋形成超螺旋結構。

*超螺旋：負超螺旋（negativesupercoil）正超螺旋(positivesupercoil)（五）DNA超螺旋結構（三級結構）110

2.生物體的閉環(huán)DNA都以超螺旋形式存在,如質粒、病毒、線粒體的DNA

2.生物體的閉環(huán)DNA都以超螺旋形式111（六）真核生物染色體DNA真核生物DNA分子呈線狀，其超螺旋結構不同于上述環(huán)狀DNA。它們主要存在于染色體，以核小體的形式再進一步盤繞折疊。（六）真核生物染色體DNA真核生物DNA分子呈線狀，112*核小體Nucleosome1）核小體核心：組蛋白Histone八聚體

（H2A,H2B,H3,H4各兩分子）

1.75圈DNA超螺旋（146bp）2）連接區(qū)：組蛋白H1和20-80bpDNA雙螺旋*核小體Nucleosome113上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件114DNA（2nm）核小體鏈（11nm，每個核小體200bp）纖絲（30nm，每圈6個核小體）突環(huán)（150nm，每個突環(huán)大約75000bp）玫瑰花結（300nm，6個突環(huán)）螺旋圈（700nm，每圈30個玫瑰花）染色體（1400nm，每個染色體含10個玫瑰花200bp）真核生物染色體DNA組裝DNA核小體鏈（11nm，每個核小體200bp）纖絲（3115DNA的質量、長度和濃度計算方法1.長度0.34×bp=（nm)2.分子質量660×bp=（dal)

3.濃度50×OD260nm=μg/ml

(光徑為1cm)DNA的質量、長度和濃度計算方法116(七)DNA的變性、復性和雜交1.變性（denaturation)1）概念：當DNA的二級結構和三級結構受到物理化學等因素的破壞而解體，其一級結構核苷酸間共價鍵并不斷裂，使配對堿基間氫鍵斷裂，有序的螺旋解離成無序單鏈的過程稱為變性。(七)DNA的變性、復性和雜交117**引起變性的因素：常見的有加熱、酸、堿、乙醇、丙酮、尿素、甲酰胺等作用，**引起變性的因素：1182)變性過程中DNA物化性質發(fā)生改變①

增色效應(hyperchromiceffect)②浮力密度↑③黏度↓④旋光度變小⑤沉淀速度↑2)變性過程中DNA物化性質發(fā)生改變1193）DNA的熔解曲線(meltingcurve)①熔解溫度（meltingtemperature,Tm）通常將50%DNA分子變性時的溫度稱為熔解溫度。**一般DNA在生理條件下Tm在85-95oC之間

3）DNA的熔解曲線(meltingcurve120DNA的熔解曲線DNA的熔解曲線121(2)影響Tm的因素

Ⅰ.DNA的堿基組成（G＋C）％↑Tm↑（G＋C）％每增加1,Tm線性增加0.41℃（G＋C）％為40％，Tm為87℃（G＋C）％為60％，Tm為95℃(2)影響Tm的因素122Ⅱ.介質中的離子強度鹽濃度↑Tm↑,變性過程跨越的溫度范圍更狹窄,如單價離子濃度增加10倍,Tm增加約16.6℃

Ⅳ.變性劑50％甲酰胺可使Tm降低30℃Ⅲ.DNA的均一性Ⅱ.介質中的離子強度Ⅳ.變性劑Ⅲ.DNA的均一性123離子強度對Tm的影響離子強度對Tm的影響1242.復性(renaturation)(1)概念：變性的兩條DNA單鏈在合適條件下，可按原來的堿基配對再結合在一起，形成雙螺旋結構。

*退火（annealing）:加熱變性的DNA分子在溫度緩慢降低時可恢復到原來正常DNA的結構,這個復性過程又稱“退火”2.復性(renaturation)*退火（ann125上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件126圖3-26DNA熱變性過程的兩種冷卻過程示意圖圖3-26DNA熱變性過程的兩種冷卻過程示意圖127(2)影響DNA復性因素

1）DNA序列簡單序列復性快

2）DNA濃度濃度高復性快

3）DNA片段大小小片段DNA易于復性

(2)影響DNA復性因素1284）溫度復性最佳溫度為Tm-25℃（一般為60℃，50％甲酰胺存在最佳溫度42℃）

5）溶液中離子濃度鹽濃度需在0.4mol／L以上4）溫度1293.雜交（hybridization）1)概念:不同來源但具有同源性的兩條DNA或RNA單鏈，按堿基配對的原則結合，這一過程為雜交，可以是

DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA之間進行。

3.雜交（hybridization）130上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件1312)核酸分子雜交常用的技術

①Southern印跡分析法1975年英國科學家Southern首先提出并利用此方法檢查基因組DNA的特異序列。②Northern印跡分析法根據Southern法的基本原理，分析檢測RNA。2)核酸分子雜交常用的技術②Northern印跡分析法132③斑點雜交④細胞原位雜交⑤菌落或噬菌斑原位雜交3).分子雜交的探針

①

概念:探針是分子雜交的必要工具，它是帶有某種標記的一段堿基序列，與待測基因序列的DNA或RNA或寡聚核苷酸互補。

③斑點雜交3).分子雜交的探針133②探針的標記ⅰ）放射性同位素標記如用32P、35S、3Hⅱ）非放射性標記主要有生物素標記、地高辛標記②探針的標記134上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件135第五章DNA及基因組第五章136BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2007:

HumanGeneticVariation

21DECEMBER2007SCIENCEBREAKTHROUGHOFTHEYEAR2007:137BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2008:

ReprogrammingCells

iPS(inducedpluripotentstemcell)Runners-Up:

DirectViewsofExoplanets

TheDNAofCancerNewClassofHigh-TSuperconductors

Proteinfloppingandfolding

SplittingWater

BeginningofLife,theMovieColorCodedFat

ComputingtheBasics

DNAontheCheap

BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2008:138拓展伽馬射線天空脫落酸受體（abscisicacid,ABA）發(fā)現(xiàn)模擬磁單極子長壽健康

科學家揭示月球存在冰基因治療回來了

石墨烯研究取得新進展哈勃重生第一臺X射線激光器閃亮登場BREAKTHROUGHOFTHEYEAR2009:

Ardipithecusramidus

（始祖地猿）

Runners-Up:

拓展伽馬射線天空BREAKTHROUGHOFTHEY1392010年科研熱點

IPS細胞

宇宙射線眼

外顯子組研究生物化學戰(zhàn)勝癌癥？

人類太空飛行

2010年科研熱點IPS細胞140一、核酸研究簡史第一階段：核酸的發(fā)現(xiàn)第二階段：發(fā)現(xiàn)核酸是遺傳物質第三階段：為分子生物學奠定基礎的時期第四階段：分子生物學高速發(fā)展時期第一節(jié)DNA的結構與功能一、核酸研究簡史第一階段：核酸的發(fā)現(xiàn)第二階段：發(fā)現(xiàn)核酸1411889年R.Altman從動物細胞與酵母菌中制備了核酸

1869年F.Miescher從膿細胞中得到核質“Nuclein”第一階段：核酸的發(fā)現(xiàn)1894年A.Kossel和A.Neumann從胸腺中提取核酸1889年R.Altman從動物細胞與酵母1869年1421930年正式提出核酸分為兩大類：核糖核酸（RNA）脫氧核糖核酸（DNA）1904年Hammars證明核酸中的糖是戊糖.1909年Levene和Jacobs鑒定核酸中的糖是D-核糖.1912年Levene認為核酸由4種核苷酸組成1929年Levene和Jacobs確定胸腺核苷酸中的糖是2-脫氧-D-核糖

1930年正式提出核酸分為兩大類：1904年Hammar143第二階段：發(fā)現(xiàn)核酸是遺傳物質1944年Avery等揭示了DNA是細菌的遺傳物質有莢膜的光滑型肺炎球菌（S型）致病無莢膜的粗糙型肺炎球菌（R型）不致病第二階段：發(fā)現(xiàn)核酸是遺傳物質1944年Avery等揭示了144

R型菌R型菌R型菌+＋＋S型菌DNAS型菌DNAS型菌DNA（經蛋白酶水解）（經核酸酶水解）↓↓↓部分克隆變?yōu)椴糠挚寺∽優(yōu)椴荒茏優(yōu)镾型菌S型菌S型菌R型菌R型菌1451952年HersheyChase通過噬菌體感染細菌的實驗表明病毒的遺傳物質是DNA。1952年Hershey1461953年J.D.Watson和F.Crick建立了DNA雙螺旋結構模型

第三階段：為分子生物學奠定基礎的時期1953年J.D.Watson和F.Crick建立第1471958年*Kornberg等發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶(DNApolymerase)

*

Meselson等提出半保留復制，闡明DNA復制的機理*Crick提出了遺傳信息傳遞的中心法則1958年*Kornberg等發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶*C1481965年中國科學家人工合成牛胰島素1970年Temin等發(fā)現(xiàn)了從RNA→DNA反轉錄現(xiàn)象，使中心法則更完善1961年以后Jacob、Nirenberg和Monod等取得三個有意義的進展：1)證實了mRNA攜帶著DNA到蛋白質合成機制所需要的信息2)發(fā)現(xiàn)了遺傳密碼3)發(fā)現(xiàn)了蛋白質依靠tRNA和核糖體的幫助翻譯1965年中國科學家人工合成牛胰島素1970年Temin149遺傳信息傳遞的中心法則

（centraldogma）DNAmRNA轉錄多肽鏈翻譯蛋白質翻譯后加工DNA復制逆轉錄RNA復制遺傳信息傳遞的中心法則

（centraldogma）DNA150第四階段：分子生物學高速發(fā)展時期1.1971年限制性內切酶發(fā)現(xiàn)，DNA的分離成為可能第四階段：分子生物學高速發(fā)展時期1.1971年限制性內1512.直讀核苷酸序列方法(1975年Sanger發(fā)明)2.直讀核苷酸序列方法1523.DNA體外重組技術(1972年Berg發(fā)明)

3.DNA體外重組技術1531982年中國科學家人工合成酵母丙氨酸t(yī)RNA1985年Mullis建立PCR技術1981年T.Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA前體的自我拼接,稱為ribozyme.

1982年中國科學家人工合成酵母1985年Mulli154人類科學史上的三大工程人類基因組計劃曼哈頓原子計劃阿波羅登月計劃

1990年美國正式啟動人類基因組計劃。(humangenomeproject,HGP)

人類科學史上的三大工程人類基因組計劃曼哈頓原子計劃阿波羅登1551999年7月我國得到完成人類3號染色體短臂上一個約30Mb區(qū)域的測序任務，該區(qū)域約占人類整個基因組的1%，簡稱1%項目。提前兩年于2001年8月26日,繪制完成“中國卷”，贏得了國際科學界的贊譽。

上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件1562003年4月美、英、日、法、德、中等國政府首腦聯(lián)名發(fā)表《六國政府首腦關于完成人類基因組序列圖的聯(lián)合聲明》。2003年4月1571997年英國愛丁堡羅斯林研究所首次育成克隆羊。

1997年英國愛丁堡羅斯林研究所首次158水稻基因組（RiceGenome）2001年10月，中科院、科技部和國家計委聯(lián)合向全世界宣布，中國率先完成水稻（秈稻）基因組工作“框架圖”的繪制2002年4月5日，在Science雜志上以封面文章的形式發(fā)表。水稻基因組（RiceGenome）2001年10月，159**后基因組計劃（post-genomeproject）

又稱為功能基因組學（functionalgenomics）**蛋白質組（proteome）計劃又稱為蛋白質組學（proteomics）**后基因組計劃（post-genomeproject）160**隨著許多新的RNA功能陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，2000年各國科學家提出了RNA組的研究，稱為RNA組學（RNomics）**生物信息學(bioinformatics)**系統(tǒng)生物學(systemsbiology)**隨著許多新的RNA功能陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，161二、DNA研究的臨床應用1.疾病發(fā)病機理的研究1）遺傳性疾病

基因變異或基因缺陷是疾病發(fā)生的根本原因如:鐮刀狀紅細胞性貧血的致病因素是由于珠蛋白第6位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

二、DNA研究的臨床應用162

如：心血管疾?、笮透咧鞍籽Y的形成主要是由于ApoE基因中第112位和第158位的G和C發(fā)生變異，蛋白質肽鏈上原來Arg變成Cys，失去與ApoE受體結合的能力，使血脂升高

163

2）腫瘤癌基因激活和抑癌基因失活→分化受阻→腫瘤細胞（永生型）如：上世紀70年代發(fā)現(xiàn)了癌基因（H-ras)與抑癌基因(Rb)。

2）腫瘤164

2.

疾病的基因診斷DNA診斷：*快速DNA點雜交*限制性內切酶酶譜分析法*DNA限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP）*聚合酶鏈反應（PCR）產前診斷、植床前診斷

2.

疾病的基因診斷產前診斷、植床前診斷165

ABKb123123Kb8.3hcs-L

6.7hcs-B5.8hcs-A3.8hGH-N3.0hGH-V1.2hHG-V25.021.817.914.8單純性生長激素缺乏癥(IGHD)(isolatedgrowthhormonedeficience)圖中A為BamHI酶解片段與hGHcDNA探針雜交放射自顯影圖B為HindIⅢ酶解片段與hGHcDNA探針雜交放射自顯影圖1為正常人.2為IGHD患者.3為雜合子DNA

hcs為人絨毛膜促乳素.hGH為人生長激素A166父親母親孩子…GTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGT……GTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGT……GTCGTACGTGACACACACACACACACACACACAGTACGATACGT……GTCGTACGTGACACACACACACACACACAGTACGATACGT……GTCGTACGTGACACACACACACACACACACAGTACGATACGT……GTCGTACGTGACACACACACACACACACAGTACGATACGT…父親母親孩子46bp42bp40bp42bp42bp46bp40bp42bp40bpPCR結果的凝膠電泳：圖：某個CA2核苷酸重復的微衛(wèi)星在一個家系中的PCR檢測結果示意圖短串聯(lián)重復(shorttandemrepeat,STR)多態(tài)性分析父親母親孩子…GTCGTACGTGACACACACACACA1673.

疾病的預防與基因治療1）采用基因工程產生疫苗藥物2）基因治療3.

疾病的預防與基因治療168世界首例癌癥疫苗由美國Merck公司研制，專門針對人乳頭狀瘤病毒（HPV）的疫苗——“加德西”（Gardasil），2006年6月8日獲得美國FDA的上市批準。這是世界上第一個，也是惟一一個獲準上市的用來預防由HPV

6、11、16和18型引起的宮頸癌和生殖器官癌前病變的癌癥疫苗，保護率超過95%。

該癌癥疫苗的推出，將是人類首次真正嘗試通過疫苗將一種癌癥徹底消除。

德國科學家拉爾德·楚爾·豪森2008年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎世界首例癌癥疫苗由美國Merck公司研制，專門針對人乳頭狀瘤169構件分子—核苷酸nucleotide核苷nucleoside

磷酸phosphate

堿基bases戊糖pentose

嘧啶pyrimidine

嘌呤purine

核糖ribose

脫氧核糖deoxyribose三、核酸的結構核酸（多核苷酸Polynucleotide)（一）分子組成構件分子—核苷酸nucleotide核苷nucleoside1701.含氮有機堿（1）嘧啶堿：胞嘧啶Cytosine

胸腺嘧啶Thymine

尿嘧啶Uracil（2）嘌呤堿：腺嘌呤Adenine鳥嘌呤Guanine

1.含氮有機堿171上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件172堿基上有修飾：核苷的大寫字母前加上代表修飾基團的小寫字母右上方寫明堿基的第幾位

m2G表示2-N-甲基鳥苷

位置

m3227G表示N2，N2，7-三甲鳥苷

數量

S4U表示4-硫代尿嘧啶甲基(3)稀有堿基堿基上有修飾：m2G表示2-N-甲基鳥苷173R苷R苷1742.戊糖2.戊糖175順式腺苷反式腺苷3.核苷：C-N糖苷鍵

嘌呤堿N9嘧啶堿N1戊糖C1順式腺苷反式腺苷3.核苷：C-N糖苷鍵嘌呤堿N9戊糖C1176**順式和反式構象的定義:相對于糖的一部分,堿基沿糖苷鍵C’-N(對于嘧啶是N1,對嘌呤是N9)。可以采取2種主要的取向,順式和反式構象。**順式和反式構象的定義:177假尿苷51’假尿苷51’1784.

核苷酸4.核苷酸1791’2’3’4’5’1’2’3’4’5’180上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件1815’3’環(huán)核苷酸cAMP、cGMP

表示磷酸與3’、5’核苷羥基相接

5’3’環(huán)核苷酸182（二）、游離核苷酸的功能ATP、GTP、UTP、CTP參于代謝5FU（5－氟尿嘧啶）抗癌藥物6MP（6－巰基嘌呤）抗癌藥物5’-碘脫氧尿苷治療病毒性心肌炎AZT抗AIDS病毒（Azidothymidine疊氮基胸苷）cAMP、cGMP第二信使

（二）、游離核苷酸的功能183（三）DNA的一級結構1.DNA的一級結構是指脫氧核苷酸（堿基）在DNA分子中的排列順序2.DNA分子中脫氧核苷酸的連接方式

3’，5’磷酸二酯鍵3.直線形DNA有二個末端：5’磷酸末端3’羥基末端

（三）DNA的一級結構184

A.分子結構式B．線條式C．字母式

A.分子結構式1851)端粒DNA的結構

真核生物線性染色體末端的DNA序列,稱為端粒。端粒DNA序列相當保守，端粒DNA的3’末端是由數百個串聯(lián)的重復序列，長5-10kb。重復序列由G-T豐富的6個核苷酸組成。人:5’-AGGGTTAGGGTT-------3’

4.端粒（telomere）DNA結構與功能

1)端粒DNA的結構4.端粒（telomere）186熒光原位雜交顯示端粒和端粒序列熒光原位雜交顯示端粒和端粒序列187端粒的重復序列是由端粒酶（telomerase）合成后添加到染色體末端。端粒酶是一種核糖核蛋白復合物，具有逆轉錄酶的性質，以物種專一的內在RNA為模板，把合成的DNA添加到染色體的3‘端。端粒起到細胞分裂計時器的作用，核苷酸復制和基因DNA每復制一次，端粒減少50-100bp，正常體細胞染色體缺乏端粒酶活性，故隨細胞分裂而變短，細胞隨之衰老。人的生殖細胞，部分干細胞染色體，腫瘤細胞和永生細胞系具有端粒酶活性。端粒的重復序列是由端粒酶（telomerase）合成后添加到188上海交通大學醫(yī)學院分子生物學課程DNA1課件189

2）端粒DNA的功能a保證線性DNA的完整復制b維持染色體的穩(wěn)定c決定細胞的壽命2）端粒DNA的功能1902009諾貝爾生理學或醫(yī)學獎------

端粒酶（telomerase）ElizabethBlackburnJa