3T3-L1細胞實驗操作

3T3-L1細胞實驗操作3T3-L1細胞實驗操作3T3-L1細胞實驗操作資料僅供參考文件編號：2022年4月3T3-L1細胞實驗操作版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準:發(fā)布日期：3T3-L1細胞實驗操作3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞（前脂肪）培養(yǎng)基配制（準備1L高壓過的超純水）1、DMEM粉倒入1L放旋子的燒杯，加滅菌水1000ml，蓋錫紙磁力攪拌40分鐘。2、擦凈，加入Na2CO3，蓋錫紙磁力攪拌10分鐘。3、稱HEPES（4℃保存），蓋錫紙磁力攪拌20分鐘。4、拿過濾嘴、針筒，用針筒吸配好的培養(yǎng)基，通過濾嘴過濾至高壓過的100ml瓶分裝，4℃保存，用時加10ml血清配成10%FBS。順便先配誘導液：配好的培養(yǎng)基分裝入100ml瓶中，90mlDMEM。準備好FBS、IBMX、DEX、insulin（2μg/ml）先配兩瓶100ml10%FBS，A液：IBMX1ml+DEX100μl+insulin250μl入100ml10%FBSB液：insulin250μl入100ml10%FBS（先過濾）細胞凍存（全程滅菌、雙手消毒、槍頭勿亂碰、瓶口滅菌）1、準備DMEM（分裝好的）*1瓶，50ml瓶*2，針，過濾器*1，DMSO試劑，凍存管。2、配凍存液（10ml）：按5：4：1比例→培養(yǎng)基5ml：血清4ml：DMSO1ml，混勻。拿出一個新的、標記好用針筒把過濾器弄在瓶口用針筒吸新配的凍存液，把針頭摘掉，經過濾器把新配的凍存液濾到新瓶。PBS清洗細胞，加完蓋蓋子，加在壁上，然后吸棄，換槍頭吸（一對一）。吸胰酶500μl（吸勻再用），放顯微鏡觀察，消化完畢即吸棄（一對一）。大皿加入2~3ml凍存液，打圈吹散，分裝1ml至凍存管，勿離心。-4℃30min，-20℃1h，-80℃2h，最后液氮凍存。一、細胞復蘇（準備10%FBS、晚上復蘇）將從液氮取出凍存管放入37℃恒溫水箱攪拌解凍。將細胞懸液軟管吸取至培養(yǎng)皿中，加入5~6ml10%FBS，混勻。培養(yǎng)過夜后進行換液。二、細胞傳代（全程滅菌、雙手消毒、槍頭勿亂碰、瓶口滅菌）10%FBS即90mlDMEM+10ml血清半個月內用完1、緩慢吸走舊培養(yǎng)基，換槍頭，用2mlDMEM清洗，后吸棄。2、加500μl胰酶，在顯微鏡觀察細胞形態(tài)，大部分消化成方形即可吸棄胰酶。3、加入2ml10%FBS，打圈混勻，吸1ml，每皿大概5~6滴入新的培養(yǎng)皿（大皿10滴~1ml），其余棄掉，后加3ml10%FBS（大皿8ml），大概可2天傳代。4、換液時需緩慢吸棄舊培養(yǎng)基，DMEM清洗細胞（注意換槍頭杜絕污染）后吸棄，10%FBS貼壁加入3ml。三、細胞接板（全程滅菌、雙手消毒、槍頭勿亂碰、瓶口滅菌）24孔板：560μl細胞+6ml10%FBS（12個樣）【600μl分化增殖】12孔板：1400μl細胞+11ml10%FBS用25ml瓶一板對一瓶裝準備好12孔板、24孔板各兩份（兩皿細胞）、DMEM、血清、25ml瓶4個、軟管。配10%FBS90mlDMEM+10ml血清第一二瓶各6ml10%FBS，第三四瓶各11ml10%FBS吸棄舊培養(yǎng)基，加2mlDMEM搖晃清洗，吸棄，500μl一皿細胞胰酶消化，顯微鏡觀察細胞分散開來即停止消化。每皿加入2ml10%FBS，1ml槍頭打圈吹散。將兩皿細胞集中在一個培養(yǎng)皿，打圈吹散。560μl細胞分別加入一二瓶混勻，1400μl細胞分別加入三四瓶混勻。一二瓶對應加500μl細胞進24孔板（加12個孔）搖晃混勻，三四瓶對應加1ml細胞進12孔板，搖晃混勻。放培養(yǎng)箱，第二天進行轉染。四、細胞轉染（無酶EP管、無酶小管、全程滅菌、雙手消毒、槍頭勿亂碰、瓶口滅菌）1、準Opti-MEM，滅菌水，mic（inhibitor），NC，Lipo3000，無酶EP管、無酶小管，96孔槍頭板，12孔板、24孔板各2板（工具照紫外）2、NC、mic（inhibitor）4℃1500r離心3、分裝Lipo3000tube管150μl一管（輕混），mic（inhibitor）、NC小管（換槍頭加滅菌水稀釋，按說明書要求），標記好4、分裝Opti-MEM20ml入瓶待用5、計算好體系：(n為樣品數量，N為總樣品數量）Mic：①45μl+600μlOpti-MEM（12孔板）μlMic*n+50μlOpti-MEM*n；②μl+300μlOpti-MEM（24孔板12個樣）μlMic*n+25μlOpti-MEM*nNC：③45μl+600μlOpti-MEM（12孔板）μlNC*n+50μlOpti-MEM*n；④μl+300μlOpti-MEM（24孔板12個樣）μlNC*n+25μlOpti-MEM*nLP：⑤84μl+1200μlOpti-MEM（12孔板）μlLP*N+50μlOpti-MEM*N；⑥36μl+600μlOpti-MEM（24孔板12個樣）μlLP*N+25μlOpti-MEM*NInhibitor：①90μl+600μlOpti-MEM（12孔板）μlinh*n+50μlOpti-MEM*n；②45μl+300μlOpti-MEM（24孔板12個樣）μlinh*n+50μlOpti-MEM*nNC：③90μl+600μlOpti-MEM（12孔板）μlNC*n+50μlOpti-MEM*n；④45μl+300μlOpti-MEM（24孔板12個樣）μlNC*n+50μlOpti-MEM*nLP：⑤84μl+1200μlOpti-MEM（12孔板）μlLP*N+50μlOpti-MEM*N；⑥36μl+600μlOpti-MEM（24孔板12個樣）μlLP*N+25μlOpti-MEM*N6、標記好tube管：①mic45μl+600μl；②micμl+300μl；③NC45μl+600μl；④NCμl+300μl；⑤LP84μl+1200μl；⑥LP36μl+600μl。①in90μl+600μl；②in45μl+300μl；③NC90μl+600μl；④NC45μl+300μl；⑤LP84μl+1200μl；⑥LP36μl+600μl。注意：LP需輕輕混勻，⑤平均分至①③；⑥平均分至②④，加后輕輕混勻。靜置5min，拿出接板后的12孔板、24孔板細胞觀察。將舊培養(yǎng)基吸棄，12孔板每孔1mlOpti-MEM+100μl轉染液；24孔板每孔500μlOpti-MEM+50μl轉染液（12個孔）8、加完晃勻，6h后換10%FBS，放培養(yǎng)箱42h后換誘導液開始進行誘導。五、細胞誘導分化（全程滅菌、雙手消毒、槍頭勿亂碰、瓶口滅菌）配置儲備液：IBMX(異丁基-甲基-黃嘌呤):分子量：mol（Sigma:I5879）-20℃保存（難溶最后溶）用二甲基亞砜DMSO配制ml（L）儲存液即：IBMX+940ulddH2O+60ulKOH需用濾嘴過濾至新瓶子終濃度為L。（現(xiàn)配現(xiàn)用）DEX：分子量：mol（Sigma:D4902）-20℃保存用無水乙醇配制1mg/mlL)儲存液即：DEX+無水乙醇終濃度為1umol/L。Insulin：25mgInsulin+HCl溶解后過濾，PCR小管分裝，終濃度為2ug/ml，-20℃保存。1、待3T3-L1細胞在24孔板，毎板100μl原細胞體積+400μl10%FBS養(yǎng)2天長滿，配制誘導液誘導3T3-L1分化。（先配好10%FBS兩瓶100ml的）2、將舊培養(yǎng)液軟管吸棄，PBS清洗，吸棄PBS，加入配制好的誘導液I每孔500μl于24孔板中，培養(yǎng)2天。3、將培養(yǎng)液軟管吸棄，PBS清洗，吸棄PBS，用200ul的槍頭慢慢加入配制好的誘導液II每孔500μl于24孔板中，培養(yǎng)2天。4、將舊培養(yǎng)液軟管吸棄，PBS清洗，吸棄PBS，用10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)2天。5、細胞油紅O染色的操作步驟：①、10%中性甲醛的配制材料：中性甲醛(多聚甲醛)

密封瓶。方法：稱取1g中性甲醛粉末，加入10ml的超純水中，密封，在60度水浴中過夜才能溶解。配好的溶液1個星期內有效，最好4度保存。②、染色液的配制材料：油紅染料、棕色可密封瓶、異丙醇、針筒、濾嘴方法：稱取預先研磨粉碎的油紅干粉，溶于少量異丙醇中，然后加異丙醇至100ml，60℃水浴溶解，棕色瓶密封(或錫箔紙包裹避光)4℃保存，為儲存液，可長期保存。用時取6ml加超純水4ml混勻，濾嘴過濾，稀釋后數小時內用完。吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，加入10％的甲醛固定30min~1h（貼壁加），期間過濾油紅吸棄10%甲醛，用超純水洗2遍，60%異丙醇孵育5min吸棄60%異丙醇，均勻覆蓋oilredO染20min（6孔板2ml，12孔板1ml，24孔板500μl）吸棄oilredO后，用超純水洗2~5遍，直至無污點加蘇木精孵育細胞1min，吸棄蘇木精，超純水2~5遍在細胞上加超純水觀察若轉染誘導成功，重新轉染誘導一批細胞，進行一系列實驗：流式細胞術：（無酶槍頭、管）注意用前滅菌準備接板好的12孔板細胞、無酶槍頭、tube管、96孔板。擺好12個tube管，把原來1ml10%FBS培養(yǎng)基吸至tube管，一組一槍頭，吸1mlPBS清洗細胞（懸空加）。吸棄PBS，一組一槍頭，吸100~150μl胰酶消化細胞（兩排兩排消化），顯微鏡觀察第一個，吸棄胰酶，將原培養(yǎng)基從tube管一一對應吸回去12孔板，并吹勻細胞，輕輕吹打。顯微鏡觀察是否吹勻。將消化并吹勻的細胞懸液吸回去tube管，一對一，3000g離心5min。吸上清，留沉淀，大概留50μl，調950μl吸棄上清。懸空加入4℃冷卻的PBS1ml，吹勻細胞，3000g離心5min，吸棄PBS（950μl+50μl兩次小心吸棄）。加300μl4℃冷卻的PBS，吹勻細胞，避免成團。緩慢懸空加入700μl預冷的70%無水乙醇，輕輕吹打均勻，4℃保存（可一周）。PI染色：準備好染色劑、25ml用錫箔紙包好的小瓶、24孔板、錫箔紙。算好體系，多配一個樣，加入小瓶備用?，F(xiàn)配現(xiàn)用，當天使用，4℃保存：染色緩沖液（n+1）*ml-20℃碘化丙啶染色液（20x）（n+1）*25μl保存RNaseA（50x）（n+1）*10μl避光配制Total（n+1）*ml先加多后加少容易混勻將樣品5000g離心6min，沉淀細胞。小心吸除上清，850μl+50μl吸棄上清，預留50μl左右的乙醇，以免吸走細胞。加入4℃PBS，洗滌一次，離心5000g5min，沉淀細胞，小心吸除上清，850μl+50μl吸棄上清，預留50μl左右的PBS，以免吸走細胞。輕輕彈擊tube管底，使細胞分散，避免成團。染色：每管樣品中加入ml染色液，緩慢并充分重懸細胞，37℃避光（樣品放入24孔板用錫箔紙包好）溫?。ǚ藕嫦洌?0min，隨后4℃或冰浴避光（樣品垂直插入攜帶冰箱內冰）存放。染色完成后宜24h內或當日完成檢測，最好當天完成。CV變異系數CV越低，峰值越好，越尖銳，5%左右效果較好，一般＜10%即可。提RNA的收樣（無酶槍頭、管）注意用前滅菌①一組組分好不同槍頭吸棄培養(yǎng)基，加入500μlRNAiso放5min。②標記好無酶管，反復刮取、吸取細胞，將細胞移至tube管（不同組必須換槍頭，移完蓋好）。③收樣存放-80℃。RNA提?。o酶槍頭、管）①從-80℃冰箱取出樣品↓靜置5min后12000r，4℃離心10min②上清移至新的tube管并標記好↓加入RNAisoPlus等體積的氯仿（一般為100μl）震蕩搖勻③室溫靜置5min↓12000r，4℃離心15min④將上清轉移至新的tube管并標記好（150~200μl）↓加與上清液等體積的異丙醇，顛倒混勻⑤室溫靜置10min↓13000r，4℃離心10min⑥棄上清，向沉淀加入1ml的75%乙醇顛倒清洗沉淀（離心時以管頭朝內側，則沉淀會附于管外側，加入乙醇時從內側，勿觸沉淀，設陰性對照，即橫板為dH2O）↓13000r，4℃離心10min⑦棄上清，留沉淀↓14000r，4℃離心3min⑨吸走多余的75%乙醇↓操作臺風干2min⑩各加入8μlDEPC溶解檢測純度：打開軟件→按“Acid”→按“否”→選RNA↓每次吸2μlDEPC先洗3遍，用濾紙弄干用2μlDEPC每洗1次按Blank，Measure↓洗到為止每個樣品吸2μl，Measure（每測完一次都要擦干）↓保存（Report）RNA稀釋：（mRNA定量C統(tǒng)一為200miRNA定量C統(tǒng)一為500）（V剩=6μl）miRNA定量（冰上操作、無酶離心管、無酶槍頭）①取已稀釋的RT引物5μl，加入45μlRNA-Free水。準備好96孔板，引物RT，U6RT，放在冰上。②多配一個體系：miRNA-RT引物2μl（n+1）U6RT2μl（n+1）RNA不少于1500ng（1500ng/C統(tǒng)一=3μl）無菌ddH2O4μl（n+1）總體積11μl（n+1）注意：RT引物用前稀釋；配②體系時，RT引物和U6RT的量是固定的，模板和水的量是浮動的；只在一個引物里面加內參；下游引物是通用的；不夠的體系用無菌ddH2O配平；做完樣品后保存至-20℃；如果接下來要做miRNA定量，則放在4℃?zhèn)溆?。樣?樣品2樣品3樣品4樣品5樣品6↑↑↑↑↑↑11μl體系②11μl體系②11μl體系②11μl體系②11μl體系②11μl體系②③后對應加入模板（1500ng/C統(tǒng)一=）3μl，標記好，放入小型離心機，離心一下，再放入PCR儀70℃10min，冰上2min（程序：000）④放一管無酶tube管，多配一個體系，加入體系：5xbuffer5μl（n+1）Mix1μl（n+1）無菌ddH2O8μl（n+1）總體積：14μl（n+1）樣品1樣品2樣品3樣品4樣品5樣品6↑↑↑↑↑↑14μl體系④14μl體系④14μl體系④14μl體系④14μl體系④14μl體系④即總體積：25μl42℃1h，37℃15min，98℃5min（程序：0000）⑤多配一個體系（n+1），混勻，引物瞬時離心：SYBR10μl（n+1）Fμl（n+1）R（通用）μl（n+1）ddH2Oμl（n+1）除去模板2μl，總體積18μl（n+1）⑥在冰上鋪一次性手套，按96孔板在冰里，放好定量小管，標記好⑦每個小管對應加18μl體系⑤，每個樣都要有U6作為參照：cDNA123456miRmiR體系⑤miR體系⑤miR體系⑤miR體系⑤miR體系⑤miR體系⑤U6U6體系⑤U6體系⑤U6體系⑤U6體系⑤U6體系⑤U6體系⑤蓋上蓋子，注意勿污染，用一次性手套隔著按緊定量管蓋子，用鑷子輕輕撬松定量小管，離心一下。⑧去楊老師那，打開Real-time機，桌面miRNApcrd，然后OK→Next→選第三個→OpenLid，放樣品，用一次性手套按一下，最后CloseLid→StarRun，選擇文件夾命名好保存，直到機器綠燈亮起，登記好走人。RT-PCR（冰上操作、無酶離心管、無酶槍頭）①按1：50比例加1μlgDNARemover入50μl4xDNAmastermix②標記、加樣、低速離心，加2μlRNA進管，RNA熱變性5min65℃，冰上冷卻③先配總4xDNAmastermix2μl（固定）后分裝dH2O4μl（根據樣品而定）C統(tǒng)一為200RNA模板（樣品）2μl（≤μg）Total8μl37℃5min冰上冷卻注：n為樣品數量④上述反應液8μl5xRTmixII2μlTotal10μl37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃保存⑤加ddH2O稀釋40μl--即稀釋5倍（換槍頭混勻，4℃保存）mRNA定量（冰上操作、無酶離心管、無酶槍頭）1、反應體系試劑體積２×ＳＹＢＲ10μL上游引物μL下游引物μL滅菌水μLRNA模板3μL總體積20μL(n+2)*10(避光)(n+2)*10(避光)各（n+2）*體系各（n+2）*體系(n+2)*(n+2)*冰上操作，準備好各種規(guī)格的無酶槍頭、tube管、引物、定量管計算體系，多配2個擺好定量管、tube管，標記好，先加體系（加中間，勿碰壁）加樣一個對應一種引物加蓋蓋緊，離心打開Mrd_RT→StarRun→OpenLid按順序擺好→CloseLid→StarRun選好文件夾，保存好，開始。WesternBlot細胞蛋白收樣（冰上操作、無酶EP管、無酶槍頭）1、n個樣，n*2個EP管（一式兩份），實驗前2-3分鐘準備試劑（RIPA、PI），打冰。2、把要收的樣小心吸棄培養(yǎng)基，注意一組一槍頭。3、1ml冷凍的PBS清洗，吸棄，換組換槍頭。配蛋白裂解液：六孔板每孔150μl/十二孔板每孔100μl，多配一點，RIPA：PI=100：1。按體系算好，加入，晃勻，4℃冰箱孵育30min，打開4℃離心機。用200μl槍頭吸勻刮取后加入至tube管，12000x/g（即12000rcf）離心15min移上清至新無酶小管（先吸上部分，下部分10μl槍頭慢慢吸，維持140μl~150μl），收樣完后-80℃保存。蛋白濃度測定（冰上操作、無酶tube管、無酶槍頭）1、BCA法BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。（需先計算體系，即）標準蛋白質溶液：所買試劑濃度5mg/ml，用時稀釋成1mg/ml的溶液。（從5mg/ml的標準蛋白溶液吸取μl加入μl的RIPA共配63μl的1μg/μl的標準蛋白溶液）實驗操作：繪制標準曲線取96孔酶標板，按下表加入試劑。標準曲線的繪制（表1）管號12345678標準蛋白溶液（μl）0124812162063μlRIPA（μl）2019181612840BCA試劑（μl）200200200200200200200200蛋白質濃度（mg/ml）0上述試劑加完后，準確吸取20μl樣品（10μl樣品+10μlRIPA）溶液于酶標孔中，加入BCA試劑200μl，輕搖，于37℃保溫30-60min，冷卻至室溫后，以空白為對照，在酶標儀上590nm處比色打開酶標儀，把96孔板蓋去掉放進酶標儀并合上，電腦打開Gen5，點擊，點OK即可導出Excel。以牛血清白蛋白含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。以標準曲線空白為對照，根據樣品的吸光值從標準曲線上查出樣品的蛋白質含量保存Excel文件，選中測得標準蛋白溶液吸光度為橫坐標，蛋白質濃度為縱坐標，插入XY散點圖，右擊表中的散點，添加趨勢線，選擇多項式，勾選顯示公式以及R平均值。將樣品吸光值copy成列，將樣品測得吸光值帶入公式即可求得C所測樣品稀釋后濃度，由于所測20μl樣品是10μl原樣品+10μlPBS，即稀釋2倍，所以C該樣品實際濃度=2×C所測樣品稀釋后濃度，n該樣品體系最小物質量=C最小所測體系濃度*V最小濃度體積，V所取體積=n該樣品體系最小物質量/C該樣品體系濃度，，VSDS=V所取體積/4。（V最小濃度體積為測得最小濃度的樣品剩下體積；C所測樣品稀釋后濃度為代入公式后的濃度）蛋白變性在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。上樣體積：5X的SDS蛋白上樣緩沖液（LoadingBuffer）=4:1，離心一下，沸水煮10分鐘，以充分變性蛋白。流程圖制膠（1h）→電泳跑膠(80V40min110V140min&90V30min)→轉膜（80V50min&）→TBST清洗5次（每次5min）→封閉（）→TBST清洗5次（每次5min）→附Ⅰ抗（內參：小鼠抗β-Actin，先搖床輕搖30min，再放冰箱4度過夜）→TBST清洗三次（5min/次）→附Ⅱ抗（內參：山羊抗小鼠，輕搖1h）→TBST清洗三次（5min/次）→顯影物料及配制電泳液：一包電泳粉+1000ml雙蒸水（可回收使用）10%過硫酸銨：1g過硫酸銨+10ml雙蒸水轉膜液：一包轉膜粉+800ml雙蒸水+200ml甲醇（可回收使用）TBST溶液：50ml20*TBS+950ml雙蒸水+1ml吐溫20。（無需回收）封閉液：購買Ⅰ抗（內參）：將小鼠抗β-Actin：Ⅰ稀釋液按1:500稀釋待用，4度保存。Ⅰ抗（目的蛋白58kDa）：將smad2：Ⅰ稀釋液按1:1000稀釋待用，4度保存。Ⅱ抗（內參）：將山羊抗小鼠：Ⅱ抗稀釋液按1:5000稀釋代用，4度保存。Ⅱ抗（目的蛋白58kDa）：將山羊抗兔：Ⅱ抗稀釋液按1:5000稀釋待用，4度保存。7、顯影液：按說明書配制，避光可長期回收使用8、定影液：按說明書配制，可長期回收使用9、發(fā)光液：超敏發(fā)光液A液：B液=1:1三、步驟制膠Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳12%分離膠溶液的配制溶液成分成分體積（共約）雙蒸水30%丙烯酰胺溶液LTris（）10%SDS72μl10%過硫酸氨72μlTEMED（最后放，混勻）4μlTris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳5%積層膠所用溶液溶液成分成分體積（共約）雙蒸水30%丙烯酰胺溶液LTris（）10%SDS45μl10%過硫酸氨45μlTEMED（最后放，混勻）6μl3、1）將規(guī)格或其它規(guī)格的玻璃板固定好。2）依次將所需試劑加入燒杯中，加入TEMED之后，混勻，用1000ml的移液槍沿玻璃板縫左右兩邊的角交替加入分離膠溶液，也可從左到右連續(xù)加入（目的：兩種方法都可以使液面快速達到水平狀態(tài)）。溶液加至玻璃板約2/3高度（即插梳子離水平面大約），然后加雙蒸水至滿或溢出。室溫放置約1h，因受溫度影響，具體時間以膠凝固并且水平為標準（可稍微傾斜玻璃板觀察膠是否已經凝固）。如果膠凝固后未達到水平狀態(tài)，需重做。3）積層膠溶液的加入同上，使溶液至滿或略低，將對應規(guī)格的梳子嵌入積層膠溶液（同時按壓梳子兩側），室溫（25度左右）放置約1h，因受溫度影響，具體時間以膠凝固并且水平為標（可稍微傾斜玻璃板觀察膠是否已經凝固）。注：TEMED的量要嚴格把握！若配制的膠過早凝固導致液面未達到水平狀態(tài)，或者長時間不凝固，最可能的原因是加入TEMED時出現(xiàn)了較大誤差。天氣較冷時（10度左右），凝固時間會延長，可放恒溫箱中37度加速凝固。跑膠電泳液的配制（凝膠時配好）溶液成分成分體積（共約1200ml）雙蒸水1200ml甘氨酸TrisBaseSDS1、將玻璃板放入電泳槽中，加入適量電泳液（要淹沒玻璃板頂部）。在梳子兩邊同時用力，將其拔出。2、在積層膠最左側或最右側的孔中加入5μl的Mark，然后在剩余孔中依次加入30μl蛋白提取液（藍色）。加入的Mark和蛋白液的量可適當調整。加入時一定要仔細，視線要與孔保持水平，保證所加蛋白提取液全部落入孔中，否則會影響后期含量測定。3、開始跑膠1）將電壓調為80V，一直至藍色接近玻璃板底部停止（約40min，分離效果較好）。2）將電壓調為80V，當藍色過了積層膠與分離膠的分