專業(yè)英語(yǔ)翻譯

氨基末端單聚乙二醇化重組人內(nèi)皮抑素的制備及其穩(wěn)定性聶永軍，張馨，新昌王，君輝陳*

國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，醫(yī)藥生物技術(shù)，生物化學(xué)系，南京大學(xué)，南京210093

中國(guó)體育河。收到05年12月14日;收到修改稿2006年5月27日內(nèi)皮抑素能特異地抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，有效地抑制血管生成和腫瘤的生長(zhǎng)。

重組人內(nèi)皮抑素氨基末端特定位點(diǎn)的單聚乙二醇被使用平均達(dá)5000分子量甲氧基聚乙二醇（MPEG）的丙醛通過(guò)終端醛基反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。該特定的共軛乙二醇是在最好的條件下生成的，這是通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)的L9（34）正交試驗(yàn)檢測(cè)來(lái)確定的。在這項(xiàng)研究中，我們已經(jīng)調(diào)查聚乙二醇-rhES的穩(wěn)定性和抗腫瘤活性。聚丙烯酰胺凝膠電泳，反相高效液相色譜法，紫外分光光度分析被用來(lái)確定乙二醇-rhES的純度和穩(wěn)定性。當(dāng)孵育蛋白酶或放置在一

極端環(huán)境下的MPEG-rhES比rhES穩(wěn)定。未修改和聚乙二醇的鏈接RHE進(jìn)行了測(cè)試他們抑制雄性小鼠H22肝癌腫瘤生長(zhǎng)的能力。在多與單劑量的比較研究，日常服用為0.25，0.50和1.00微mol/公斤的rhES

七天導(dǎo)致了26.9％，43.0％和64.9%腫瘤重量減少，而單劑量0.13，0.25，

和0.50微mol/公斤聚乙二醇化的蛋白質(zhì)每天導(dǎo)致24.8％，38.0％和64.5％減少，分別為。這兩種治療導(dǎo)致腫瘤減少的平均重量相比用生理鹽水處理(對(duì)照)顯著減少的多，而用乙二醇rhES換成一半劑量的rhES，而腫瘤抑制率分別為相似。因此，有人建議，聚乙二醇化提高了穩(wěn)定性和連接RHE提高其抗腫瘤活性。蛋白質(zhì)和多肽類藥物作為治療劑代理有很大的潛力。然而，其中許多是由蛋白水解降解在體內(nèi)的酶，它們迅速就被腎臟排出。另外，B細(xì)胞能產(chǎn)生中和抗體來(lái)抵抗這些蛋白質(zhì)和多肽。因此，這些藥物通常有短期循環(huán)半衰期（1）。聚（乙二醇）（聚乙二醇）是一個(gè)廣泛的研究聚合物用于許多藥學(xué)和生物藥學(xué)中生物大分子的共價(jià)修飾，尤其是肽和蛋白質(zhì)（2）。通過(guò)增加蛋白質(zhì)和多肽分子質(zhì)量來(lái)避免蛋白水解酶，從而改善藥物動(dòng)力學(xué)（1）。廣泛的治療類蛋白質(zhì)，包括人體生長(zhǎng)激素，干擾素，胰島素，粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF），和白細(xì)胞介素二，聚乙二醇化（3）。頭幾的PEG-蛋白質(zhì)現(xiàn)在市場(chǎng)上（Adagen，Oncospar和PEGIntron）產(chǎn)品，制定了利用聚乙二醇化學(xué)的第一代。第二代的聚乙二醇化的目的是要避免第一代化學(xué)的問(wèn)題，特別是去活化的聚乙二醇雜質(zhì)，低分子量的限制，乙二醇，不穩(wěn)定的聯(lián)系，并缺乏修改選擇性。近日，特定蛋白質(zhì)的聚乙二醇化已嘗試在特定的共軛條件下用一類特殊職能化的聚乙二醇衍生物。例如，氨基-末端粒細(xì)胞集落刺激因子特殊的聚乙二醇由共軛在酸性pH值條件下甲氧基聚乙二醇衍生物中獲得的。這策略是基于這樣的事實(shí)，初級(jí)胺殘留在蛋白質(zhì)中使其有不同的pKa值：pKa=7.8是氨基末端的@氨基，pKa=10.1的是賴氨酸殘基的@氨基（5）。當(dāng)丙醛或N-羥基聚乙二醇偶聯(lián)在較低pH值條件下，在聚乙二醇N-末端的位點(diǎn)優(yōu)先發(fā)生是由于兩種@伯胺之間不同的pKa值。

內(nèi)皮抑素，一個(gè)20kDa（千道爾頓-原子質(zhì)量單位）的羧基端片段的膠原蛋白十八，被孤立于血管內(nèi)皮瘤的條件培養(yǎng)基（EOMA）細(xì)胞。它專門抑制血管內(nèi)皮的增殖和有效地抑制血管生成和腫瘤增長(zhǎng)（7）。內(nèi)皮抑素來(lái)源于彈性蛋白酶介導(dǎo)的切割（8）。血管生成是固體腫瘤持續(xù)快速增長(zhǎng)的關(guān)鍵，以這看來(lái)，腫瘤直接影響'血管生成開關(guān)'，以維持細(xì)胞的連續(xù)增殖（9）。有趣的是，內(nèi)皮抑素似乎不誘導(dǎo)抗藥性。此外，反復(fù)循環(huán)的系統(tǒng)性內(nèi)皮抑素在荷瘤小鼠體內(nèi)反應(yīng)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中所引起的持續(xù)腫瘤休眠。因此，內(nèi)皮抑素將成為新的重要抗腫瘤劑。3在這項(xiàng)研究中，聚??乙二醇化rhES的N-端在特定方式下與聚乙二醇丙醛衍生物（4,6）。各種表征方法，如快速蛋白質(zhì)液相色譜（FPLC）和反相高性能液相色譜法（RP-HPLC法）技術(shù)被用來(lái)表明，單一聚乙二醇反應(yīng)發(fā)生網(wǎng)站專門

在N-端的R-胺組的特定位點(diǎn)。在體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，如孵化胰蛋白酶或糜蛋白酶與被保持在一個(gè)極端的pH值或溫度的活的有機(jī)體肝癌H22小鼠中抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究，表明單聚乙二醇化內(nèi)皮抑素進(jìn)行抗癌治療的潛在能力。實(shí)驗(yàn)步驟材料。重組人血管內(nèi)皮抑制素（rhES）的捐贈(zèng)

由仲愷生物制藥（蘇州，江蘇，中國(guó)）。該5kDa的乙二醇，丙購(gòu)自SunBio（安陽(yáng)市，漢城，韓國(guó)）;胰蛋白酶，糜蛋白酶，鈉

氰基，和透析膜（兆瓦截止1000）由Sigma提供（圣路易斯，密蘇里州）;CM-瓊脂糖凝膠法來(lái)自于Amersham公司PharmaciaBiotech公司（白金漢郡，英國(guó)），5um的BDS的孔徑C18反相柱（150×4.6mm）提供于Hypersil（尚法，朗科恩，柴郡，英國(guó)）;及小鼠H22肝癌細(xì)胞的形態(tài)和昆明小鼠SIPI（上海，中國(guó)）。

聚乙二醇與聚乙二醇的連接RHE-丙醛衍生物。

該反應(yīng)的最佳條件，是實(shí)現(xiàn)通過(guò)統(tǒng)計(jì)采用正交試驗(yàn)。這四個(gè)因素

pH值，乙二醇丙醛摩爾比，溫度，和時(shí)間。表1報(bào)告每個(gè)因素的三個(gè)層次。被終止的反應(yīng)，用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)PH至3.5，利用SDS和中間軟件系統(tǒng)進(jìn)行樣品分析。通過(guò)快速液相色譜儀進(jìn)行分離純化。反應(yīng)混合物被裝上一個(gè)CM陽(yáng)離子交換層析法郎

柱（1.0cm×20cm），預(yù)平衡20毫米醋酸鈉，pH值4.5（緩沖液A）在1.0毫升/min的流速，使用快速液相色譜儀系統(tǒng)。300毫升的緩沖液A洗前一梯梯度20％，40％和60％緩沖液B（緩沖液A+1M氯化鈉）的

應(yīng)用梯度大約5柱體積。該組分被分析通過(guò)非還原SDS–PAGE及中間軟件系統(tǒng)。該樣本含有單聚乙二醇化及未經(jīng)修改的rhES被順序收集。通過(guò)透析和冷凍干燥后樣品于20℃下存放。紫外分光光度法。聚乙二醇化蛋白質(zhì)含量可以通過(guò)在波長(zhǎng)280nm的紫外線下比較rhES和MPEG-rhES的吸光度測(cè)定出。其純度和聚乙二醇醇化后的殘余物可以通過(guò)蛋白質(zhì)含量來(lái)確定。反相高效液相色譜法（RP-HPLC法）。聚乙二醇化rhES或rhES可被分析通過(guò)一臺(tái)HypersilBDS的C18的平衡柱

用緩沖液c（含0.1％TFA的水）在其流速為

1.0毫升/分鐘并在波長(zhǎng)為280nm處進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并用

濃度為60％緩沖液類（含0.1％TFA的乙腈）進(jìn)行線性洗脫

20分鐘以上。

體外蛋白質(zhì)水解。mPEG-rRHE（1.25mg/ml，pH值7.4磷酸鹽緩沖液（PBS））的400ul被制備通過(guò)4微升的胰蛋白酶(1.0mg/ml）或20微升的糜蛋白酶（2.0mg/ml）在37℃下。每個(gè)樣品的20微升裝在一個(gè)在不同的C18柱中間進(jìn)行階段培養(yǎng)并通過(guò)反相高效液相色譜法鑒定。MPEG-rhES的峰面積的保留時(shí)間區(qū)域用以指示剩余的MPEG-rhES。同時(shí)，rhES用來(lái)和MPEG-rhES作比較;mPEG-rhES在極端的pH值或溫度下的穩(wěn)定性。

要獲得rhES和mPEG-rhES對(duì)溫度的影響，mPEG-rhES（1.25mg/ml，pH值7.4的PBS，400ul）或rhES（1.0mg/ml，pH值7.4的PBS，400ul）分別在4，25，37，45，50，55，60，65℃下進(jìn)行制備。制備好過(guò)24小時(shí)后，所有樣品在15000轉(zhuǎn)/秒下離心10min。同樣，要獲得酸或堿的影響，MPEG-rhES（1.25mg/ml，pH值7.4的PBS，400ul）或rhES（1.0mg/ml，pH值7.4的PBS，400ul）用醋酸溶液和氫氧化鈉溶液將其pH分別值調(diào)整為2，3，4，5，6和8，9，10，11。樣品經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)，在37℃下離心收集。剩余的蛋白質(zhì)含量用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定。圖1。SDS-PAGE電泳分析樣品的正交染色

考馬斯藍(lán)。1至9行：九正交試驗(yàn)樣品

相應(yīng)的檢驗(yàn)號(hào)。第10行：未經(jīng)修改的原始

rhES的解決方案。mPEG-rhES在被移植H22肝癌小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性

患H22肝癌小鼠體內(nèi)良好的成長(zhǎng)性腹水，從SIPI獲得（上海藥物工業(yè)研究所

，上海，中國(guó)），分別稀釋于4倍體積生理鹽水中。取0.2毫升稀釋后

的腹水用套管針對(duì)每個(gè)雄性昆明小鼠（4周大;體重19-21g×100。對(duì)所有的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照所求腫瘤抑制率指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果rhES中的聚乙二醇。統(tǒng)計(jì)采用正交試驗(yàn),

經(jīng)SDS-PAGE分析表明單聚乙二醇較好,

在1至4行（圖1）。單聚乙二醇rhES的比例

分別為66.80％和63.08%在第1行和第4行。該

PEG濃度較高，導(dǎo)致了聚乙二醇化rhES的比例較高（行3，6，9，圖1）。經(jīng)過(guò)正向

對(duì)四個(gè)因素的分析，我們發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)最重要的角色是MPEG與rhES的摩爾比，溫度，時(shí)間次之，最后是pH值（表2）在聚乙二醇?；磻?yīng)產(chǎn)生單聚乙二醇化rhES，多聚乙二醇化rhES

與未反應(yīng)的陽(yáng)離子層析交換生成rhES分子

（圖2）。經(jīng)過(guò)透析，冷凍干燥，用SDS–PAGE測(cè)定

單聚乙二醇化rhES的含量（圖3），紫外分光光度法和反相高效液相色譜法（圖4）。經(jīng)SDS-PAGE和反向高效液相色譜層析結(jié)果

指出了MPEG-rhES是純粹的。實(shí)驗(yàn)測(cè)出聚乙二醇化rhES蛋白質(zhì)含量為80.21％，其殘余的PEG

計(jì)數(shù)是1。這一結(jié)果不僅表明mPEG—rhES

是純粹的，但也正是表明，該產(chǎn)品是

單一的聚乙二醇。mPEG-rhES的穩(wěn)定性。余下的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的rhES經(jīng)胰蛋白酶或糜蛋白酶培養(yǎng)，經(jīng)C18柱高效液相色譜法分析，結(jié)果表明，聚乙二醇化rhES更單聚乙二醇化重組人血管內(nèi)皮抑制素表2。結(jié)果正交Testsa1.因素，在反應(yīng)中發(fā)揮最重要作用經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，正交試驗(yàn)。2.單聚乙二醇化rhES（RMPES％）的比例是從凝膠工作由一維的中間Gelwoks軟件系統(tǒng)測(cè)定。3.K值是該RMPES％有一定的因素的總和具有相同的水平。4.K1/3意味著K1的值除以3。5.在一定的因素，最小Kx/3（x=1，2或3）減去最大一個(gè)給了R值。R值越大，更重要的因素的

反應(yīng)中的作用。在遞減的順序，最重要的因素是對(duì)MPEG的摩爾比(rhES)，受溫度，時(shí)間，pH值。圖2。陽(yáng)離子交換的快速蛋白質(zhì)液相色譜專一的聚乙二醇化連接RHE?？挂鹊鞍酌富蛞饶榈鞍酌概crhES。后40分鐘的孵化與胰蛋白酶，只有4％的rhES存活，而相比之下單聚乙二醇化90％的rhES存活圖5）。當(dāng)乙二醇-rhES和rhES分別與糜蛋白酶反應(yīng)，結(jié)果表明，半數(shù)的mPEG-rhES壽命約60歲而rhES的分鐘約24分鐘（圖6）。因此，聚乙二醇化顯著增加了antiproteolytic穩(wěn)定性

重組胚胎穩(wěn)定在4°C至40°C就像乙二醇-rhES。然而，當(dāng)溫度升高到50°C時(shí)，只有20％的rhES乙二醇-rhES剩余,而其余幾乎100％變性。當(dāng)連接RHE變性比例為50％的溫度為47.6°C間，而，mPEG-rhES相應(yīng)的溫度約為62.6°C間（圖7）因此，聚乙二醇化能顯著增加血管內(nèi)皮抑制素的熱穩(wěn)定性。

重組胚胎是在pH值2，穩(wěn)定pH值至7以及乙二醇-rhES。當(dāng)pH值超過(guò)9的MPEG-rhES是較穩(wěn)定rhES。即使是pH值上升至10，乙二醇-rhES仍然穩(wěn)定，而變性比例較低。圖3。SDS-PAGE分析純化的兩個(gè)部位對(duì)一非還原17％凝膠和考馬斯亮藍(lán)染色。

甲，分子量標(biāo)記乙，未經(jīng)修改的連接RHE（圖2）丙，單聚乙二醇化rhES（峰值在圖21）。圖4。純化后的單聚乙二醇化rhES高效液相色譜專頁(yè)。圖5。在聚乙二醇rhES（9）和rhES（]），以相對(duì)電阻胰蛋白酶的蛋白質(zhì)。每個(gè)數(shù)據(jù)值表示方式（標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。rhES達(dá)到84.4％（圖8）。因此，在N-末端

還增強(qiáng)了具體的聚乙二醇酸基穩(wěn)定性顯著的rhES。體內(nèi)聚乙二醇化rhESímol/公斤未修改rhES

7天分別導(dǎo)致26.9％，43.0％和64.9％削減腫瘤重量。圖6。在聚乙二醇rhES（9）和rhES（]），以相對(duì)電阻糜蛋白酶蛋白質(zhì)。每個(gè)數(shù)據(jù)值表示方法(n=3)圖7。對(duì)相對(duì)敏感的聚乙二醇的影響。聚乙二醇rhES（9）和rhES（]）的溫度。每個(gè)數(shù)據(jù)值代表

指（標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。圖8。對(duì)相對(duì)敏感的聚乙二醇的影響

聚乙二醇rhES（9）和rhES（]），以pH值。每個(gè)數(shù)據(jù)值表示方法

（標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。

這兩種治療分別顯著導(dǎo)致24.8％，38.0％和64.5％腫瘤的平均重量下降（見表3）。生理鹽水（對(duì)照）處理的P-值“0.001小鼠。mPEG-rhES的劑量是rhES的一半，repectively，而腫瘤抑制率（紅外熱光譜％）相當(dāng)接近。討論聚乙二醇衍生物的共軛伯胺組內(nèi)皮抑素的發(fā)生主要是通過(guò)親核取代反應(yīng)：對(duì)unprotonated胺的羰基群攻組醛。表3?？鼓[瘤活性的rhES和MPEG–rfES作用相反

小鼠H22肝癌移植的1.10天后，殺死小鼠，提取小鼠體內(nèi)的腫瘤用于測(cè)量。測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差代表兩種藥物對(duì)10個(gè)腫瘤的不同效果。2.腫瘤抑制率（紅外熱光譜％）=（1-平均治療組腫瘤重量/模型組平均腫瘤的重量）×1

003.值得注意的是不同于PSS控制組在P<0.001（a和e）也同樣有反應(yīng)聚乙二醇化基礎(chǔ)條件，所以多聚乙二醇化非均相混合物

物種可能會(huì)產(chǎn)生。與此相反，在酸性條件下，選擇性u(píng)nprotonation的N-端的R-氨基能發(fā)生時(shí)，做出比胺組有更多的反應(yīng)在賴氨酸由于殘留的pKa值的差異：7-8

的R-胺，并為10-11胺（5）。這還原胺化反應(yīng)與N-端的R-胺組中，在場(chǎng)氰基鈉作為還原劑，可能導(dǎo)致在特定地點(diǎn)的單聚乙二醇化CSF和表皮生長(zhǎng)因子（4，6）。單聚乙二醇化蛋白質(zhì)復(fù)合物，如血管內(nèi)皮抑制素，亦同樣獲得通過(guò)的N-端選擇性共軛的R-胺殘留的統(tǒng)計(jì)正交試驗(yàn)。陽(yáng)離子交換后，簡(jiǎn)單的純化步驟層析，透析，純單聚乙二醇rhES在共軛可以得到證明的情況下作為rhES經(jīng)SDS-PAGE和反相高效液相色譜法分析。rhES在單聚乙二醇化連接rhES蛋白測(cè)定采用紫外280納米。通過(guò)計(jì)算，蛋白質(zhì)含量的MPEG-rhES為80.21％，而聚乙二醇?xì)埩魯?shù)（N）為1。這一結(jié)果不僅表明目前MPEG-rhES是純粹的，但也充分顯示，在良好的分子量與血管內(nèi)皮抑制素的協(xié)議包含一個(gè)單一的共軛5000大聚乙二醇衍生物。在美國(guó)，治療期臨床試驗(yàn)rhES均采用1