動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

Section4：Scaling-upofcellculture動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!

動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)失建立在貼壁培養(yǎng)法和懸浮培養(yǎng)法基礎(chǔ)上，再融合了固定化細(xì)胞、填充床、生物反應(yīng)器技術(shù)以及人工灌流等技術(shù)而發(fā)展起來的。主要包括：懸浮培養(yǎng)微載體培養(yǎng)微囊化培養(yǎng)中空纖維法利用大規(guī)模培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞是一項(xiàng)重要的生產(chǎn)生物制品的技術(shù)，包括疫苗、干擾素、激素、生長因子和單抗等，具有很高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!1967年，VanWezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。微載體是直徑60-250μm的微珠。多用帶不同基團(tuán)的葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子，使其帶有適當(dāng)電荷或介質(zhì)，以利于細(xì)胞的貼壁及生長。

動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!這種模式，把單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)融匯在一起，具有兩種培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)。1)表面積／體積比大2)由于微裁體懸浮于培養(yǎng)基中，是均勻懸浮培養(yǎng)，簡化了細(xì)胞生長各種環(huán)境因素的監(jiān)測和控制。3)培養(yǎng)基利用率高。4)采樣重演性好。5）收獲過程不復(fù)雜。6)放大較容易。7)勞動(dòng)強(qiáng)度小，占用空間小動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!收獲細(xì)胞接種——球傳球動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!4、微囊化培養(yǎng)

在動(dòng)物細(xì)胞微囊化的制備中，主要是應(yīng)用海藻酸—聚氨基酸的方法，簡單過程是動(dòng)物細(xì)胞與海藻酸溶液混合攪拌，經(jīng)過微囊發(fā)生器將微球滴入氯化鈣溶液中，形成凝膠，然后再用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，最后用檸檬酸處理去除微球內(nèi)的鈣離子，以便球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動(dòng)物細(xì)胞得以懸浮在其中。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是關(guān)鍵材料。微囊化方法能使細(xì)胞處于相對穩(wěn)定、受剪切力小的環(huán)境中，而養(yǎng)分和氧又可以從微囊外的培養(yǎng)液擴(kuò)散進(jìn)入。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!1000L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器系統(tǒng)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!中空纖維反應(yīng)器：左右兩箭頭為無菌空氣進(jìn)出口。細(xì)胞生長在由半透性的多孔膜制成的中空纖維中外表面。典型動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

A中空纖維反應(yīng)器（貼壁反應(yīng)器）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!無泡攪拌反應(yīng)器是一種裝有膜攪拌器的生物反應(yīng)器，這種反應(yīng)器的開發(fā)和應(yīng)用在生產(chǎn)中同時(shí)解決了通氣和均相化的要求。無泡攪拌反應(yīng)器采用多孔的疏水性的塑料管裝配成通氣攪拌槳。由于選用多孔塑料管具有良好的氧通透性，從而實(shí)現(xiàn)無泡通氣攪拌。由于這類反應(yīng)器能提供動(dòng)物細(xì)胞生長中所需的溶氧要求，產(chǎn)生的剪切力較小以及在通氣中不產(chǎn)生泡沫，避免了在其它反應(yīng)器中常見的某些弱點(diǎn)，如泡隊(duì)等，因而己廣泛地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究和中試工業(yè)生產(chǎn)。膜由聚丙烯或其它材料制成，它被加工成多孔的管。在多孔管內(nèi)的氣體壓力不能超過鼓泡壓力，即氣泡在膜外表面出現(xiàn)的靜止內(nèi)壓。對于不濕潤的硫水膜，相對于水的氣泡壓力約在13X10’Pa。上述這一要求是容易實(shí)現(xiàn)的，即加在管上的壓力應(yīng)比管內(nèi)流動(dòng)壓力降和氣泡壓力的總和高出10％。在那種情況下，就可以形成管外的氣掖界面層。即使當(dāng)多孔管運(yùn)動(dòng)時(shí)單獨(dú)的氣泡不出現(xiàn)，其傳質(zhì)的情況基本上與氣體鼓泡相似。C膜攪拌器(懸浮培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)用:攪拌器型式之二)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!Vero細(xì)胞和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝DMEM培養(yǎng)基胎牛血清其他成分錐形瓶逐級放大培養(yǎng)加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養(yǎng)液微載體5L種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)液50L生物反應(yīng)器接種狂犬病毒出液口收獲病毒動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!1、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細(xì)胞密度的主要限制因素。體外動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中氨離子的積累是抑制細(xì)胞生長的主要因素之一。氨的積聚使細(xì)胞內(nèi)UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影響細(xì)胞的生長及蛋白的糖基化過程。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!3、培養(yǎng)基與細(xì)胞系無血清培養(yǎng)基成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域研究的一大課題。無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免了血清的批次、質(zhì)量、成分等對細(xì)胞培養(yǎng)造成的污染、毒性作用和不利于產(chǎn)品純化等不良影響。在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長和表達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。但無血清培養(yǎng)基并不適用于廣泛的細(xì)胞類型，不同類型的細(xì)胞甚至不同的細(xì)胞系或細(xì)胞株都有可能有各自的無血清培養(yǎng)基構(gòu)成。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!1、懸浮培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁保護(hù)，不能耐受劇烈的攪拌和通氣。對于小規(guī)程培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶和滾瓶培養(yǎng)，大規(guī)模培養(yǎng)多采用發(fā)酵罐式的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器。懸浮培養(yǎng)，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單，有成熟的理論計(jì)算，可以借鑒微生物發(fā)酵的部分經(jīng)驗(yàn)，放大效應(yīng)小。但是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度較低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有潛在致癌危險(xiǎn)，培養(yǎng)病毒易失去病毒標(biāo)記而降低免疫強(qiáng)力。此外，有許多動(dòng)物細(xì)胞屬于貼壁依賴性的，不能懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵是要選擇適當(dāng)?shù)臄嚢韬屯庋b置.動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!2、微載體培養(yǎng)系統(tǒng)

貼壁依賴性動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，最初是采用滾瓶系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)簡單、投資少，技術(shù)成熟，重現(xiàn)性好，放大只是簡單地增加該瓶數(shù)。但是，滾瓶系統(tǒng)勞動(dòng)強(qiáng)度大，單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小。為了克服這些不利因素，1967年，vanwezell開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞。微載體是直徑為60~250μm的微珠。采用微裁體系統(tǒng)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，細(xì)胞貽壁于微載體上，微載體(和細(xì)胞)懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞在微載體表面逐漸生長成單層。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!與微載體結(jié)合的生物反應(yīng)器系統(tǒng)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!3、包埋培養(yǎng)

懸浮生長和對貼壁依賴生長的細(xì)胞都適用，細(xì)胞生長的密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)。對懸浮生長的細(xì)胞用海藻酸鈣包埋，對貼壁依賴生長細(xì)胞用膠原包埋。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)慢而費(fèi)有高，且對剪切力敏感，經(jīng)包埋后可有效的保護(hù)細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!5、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)中空纖維是聚砜或丙烯的聚合物制成，一個(gè)培養(yǎng)筒內(nèi)由數(shù)千根中空纖維所組成，然后封存在特制的圓筒中，組成的培養(yǎng)系統(tǒng)。每根纖維管內(nèi)成為“內(nèi)室”，可灌流無血清培養(yǎng)液供細(xì)胞生長；管與管之間稱為“外室”。接種的細(xì)胞就貼在管壁上，并吸取“內(nèi)室”滲透出來的養(yǎng)分，迅速生長繁殖。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!自學(xué)：動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!其中關(guān)鍵的是一個(gè)籠式撐拌器?；\式通氣裝置的特點(diǎn)主要是可以避免在向培養(yǎng)基中通氣時(shí)，氣泡不會(huì)直接損傷細(xì)胞。（因?yàn)闅馀菀驯簧喜康?00目絲網(wǎng)機(jī)械的破壞了。同時(shí)，在采用微教體系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，微載體不會(huì)被由于通氣所產(chǎn)生泡沫所裹抉在氣液界面。導(dǎo)流筒隨攪拌同步轉(zhuǎn)動(dòng)（30~60rpm)時(shí)，由于離心力的作用，使攪拌器中心管內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓，迫使攪拌器外培養(yǎng)基流入中心管，沿管螺旋上升，再從三導(dǎo)流筒口排出，繞攪拌器外緣螺旋下降，培養(yǎng)基和懸浮的細(xì)胞或附著細(xì)胞或微載體反復(fù)循環(huán)。由流體攪拌加流體循環(huán)，使反應(yīng)器內(nèi)流體混和相當(dāng)好。B、氣腔式反應(yīng)器（懸浮培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)用:攪拌器形式之一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!D流化床反應(yīng)器（懸浮培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)用攪拌器形式三）流化床反應(yīng)器的基本原理就是使支持細(xì)胞生長的微粒呈流態(tài)化。右圖所示為由膠原制成的微粒直徑約500μm，具有像海綿一樣的多孔性用非毒性物質(zhì)增加其比重使之達(dá)到1．6或更高，以便它在高速向上流動(dòng)的培養(yǎng)波中里流態(tài)化。細(xì)胞就接種于這種微粒之中，通過反應(yīng)器垂直向上循環(huán)流動(dòng)的培養(yǎng)液使之成為流化床，并不斷提供給細(xì)胞必要的營養(yǎng)成分，細(xì)胞得以在微粒中生長。同時(shí)，新鮮培養(yǎng)浪不斷地披加入，而培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物又不斷地被排除。這種反應(yīng)器傳質(zhì)性能很好，并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器，能快速提供給高密度細(xì)胞所需的氧，同時(shí)排除代謝產(chǎn)物如二氧化碳(c02)。反應(yīng)器中的液體流速能足以使細(xì)胞微粒懸浮，卻不會(huì)損壞脆弱的細(xì)胞；培養(yǎng)的細(xì)胞密度同且細(xì)胞長時(shí)間停留在反應(yīng)器中，細(xì)胞生長環(huán)境可方便地調(diào)控。對貼壁與非貼壁細(xì)胞均適用。放大也容易。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用1962年開始，用于生物醫(yī)學(xué)研究，生產(chǎn)酶制劑，生長因子，疫苗，單抗等動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長因子、疫苗和單抗等大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問題及對策

1、優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境2、改變細(xì)胞特性3、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率

動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法及其應(yīng)用共34頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!2、細(xì)胞死亡與凋亡

在大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，細(xì)胞凋亡/死亡多是在營養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多時(shí)發(fā)生。因此一種“細(xì)胞靜止”過程可以有效降低營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生，