基因工程制藥

基因工程制藥第一節(jié)概述第二節(jié)基因工程基本技術(shù)與策略第三節(jié)基因藥物生產(chǎn)的基本過程第四節(jié)基因工程藥物制造實例第一節(jié)概述一、基因工程建立的基礎(chǔ)二、基因工程的相關(guān)概念及相關(guān)酶學三、基因工程技術(shù)所生產(chǎn)的藥物四、基因工程制藥的優(yōu)點五、基因工程制藥所使用的生物技術(shù)六、我國基因工程制藥的進展七、基因工程制藥生產(chǎn)的化學工藝學要求八、基因工程的發(fā)展一、基因工程建立的基礎(chǔ)（一）、理論方面的三個重要的發(fā)現(xiàn)1.生物遺傳物質(zhì)—DNA的發(fā)現(xiàn)2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復制機理的建立

1953年，沃森(Watson）和克里克（Crick）首次提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復制機理。這一重大發(fā)現(xiàn)大大地促進了現(xiàn)代生物科學的發(fā)展。3.遺傳信息傳遞方式的確立1966年，發(fā)現(xiàn)DNA連接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜血桿菌中分離并純化限制性內(nèi)切酶HindШ，使DNA分子的切割成為可能。1979年，Bltimore和Temin領(lǐng)導的兩個研究小組分別在各自的工作中發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。（二）、技術(shù)上三個重要成果1.基因工程的工具酶1972年，美國斯坦福大學Berg研究小組利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和T4DNA連接酶成功地進行了首例體外基因重組實驗。2.基因工程載體為了使DNA片段能在宿主細胞中得以擴增，須將其接到一個特定能夠進行自我復制的載體分子上。Lederberg開始從事細菌性因子（F因子）研究。20世紀50-60年代，相繼發(fā)現(xiàn)其他質(zhì)粒，如抗藥性基因（R因子）和大腸桿菌因子（CoE）。這些工作為基因工程載體系統(tǒng)的建立打下基礎(chǔ)。3.基因的體外重組技術(shù)1973年，科恩（Cohen）等人用EcoRI內(nèi)切酶處理大腸桿菌的抗四環(huán)素和抗青霉素及磺胺的質(zhì)粒，并連接成一個新的重組質(zhì)粒。將這種工程化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，在含有四環(huán)素和青霉素的平板中篩選重組菌落。同年，加利福尼亞的博耶（Boyer）也進行了類似的實驗。重組子轉(zhuǎn)化的成功標志著基因工程的誕生。

基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計十分類似的方法，按照人類的需要進行設(shè)計，然后按設(shè)計方案創(chuàng)建出具有某種新的性狀的生物新品系，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。（三）、基因工程的研究內(nèi)容二、基因工程相關(guān)概念及基本工具1.克隆與克隆化克隆指同一副本或拷貝集合。從眾多不同的分子群體中分離的某一感興趣分子，經(jīng)擴增產(chǎn)生很多相同分子集合，即為分子克隆。

2.DNA克隆在體外外來遺傳物質(zhì)與載體DNA結(jié)合成具自我復制的DNA分子，通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞、篩選出轉(zhuǎn)化子細胞，再擴增提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆又稱重組DNA。（一）、基因工程的相關(guān)概念3.目的的基因有時應(yīng)用用重組DNA技技術(shù)的分分離、獲獲得某一一感興趣趣的基因因或DNA序列列，有時時是為獲獲得感興興趣基因因的表達達產(chǎn)物--蛋白白質(zhì)。4.基因因載體也稱克隆隆載體。。這是為為“攜帶帶”感興興趣的外外源DNA、實實現(xiàn)外源源DNA的無性性繁殖或或表達有有意義的的蛋白質(zhì)質(zhì)所采用用的一些些DNA分子。。其中，，為使插插入的外外源DNA序列列可轉(zhuǎn)錄錄、進而而翻譯成成多肽鏈鏈而設(shè)計計的克隆隆載體又又稱表達達載體。?？沙洚敭斂寺≥d載體的DNA分分子有質(zhì)質(zhì)粒DNA、噬噬菌體DNA和和病毒DNA。?？寺『瓦M進行基因因操作需需要對遺遺傳物質(zhì)質(zhì)進行剪剪切、修修飾和連連接，這這些過程程都是在在工具酶酶的催化化下完成成的。按按功能將將工具酶酶分類，，可分為剪切酶類類、連連接酶類類和修飾飾酶類如下所示示分子剪刀刀和分子子針線（二）、、基因工工程的工工具酶1.限制制性核酸酸內(nèi)切酶酶(restrictionendonuclease,RE)(1)定定義是一類由由細菌產(chǎn)產(chǎn)生的能能專一識識別和切割雙鏈鏈DNA中的特定定堿基序序列的核核酸內(nèi)切切酶，簡簡稱限制酶或切割酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ與甲基化化酶共同同構(gòu)成細細菌的限制-修修飾系統(tǒng)統(tǒng)：限制外外源DNA，保保護自身身DNA，穩(wěn)定定細菌遺遺傳性狀狀。(2)分分類、、作用Ⅰ、Ⅱ、、Ⅲ（基因工工程技術(shù)術(shù)中常用用Ⅱ型））第一個字字母取自自產(chǎn)生該該酶的細細菌屬名名第一個個字母，，用大寫寫；第二、第第三個字字母是該該細菌種種名的前前兩個字字母，用用小寫；第四個字字母代表表菌株類類型；如果菌株株有幾種種酶，在在代表菌菌株的字字母后用用羅馬數(shù)數(shù)字表示示。(3)命命名EcoRⅠ

屬

種

株

序EscherichiacoliRY13株大腸桿菌菌RY13株的第第一種酶酶(4)ⅡⅡ類酶識識別序列列特點———回文結(jié)構(gòu)構(gòu)(palindrome)特異識別別及切割割48個bp長度度且具有有回文序列列的DNA片斷，，主要產(chǎn)產(chǎn)生3種種末端結(jié)結(jié)構(gòu)：5ˊ－粘粘性末端端3ˊ－粘粘性末端端平端或鈍鈍端回文序列列(palindrome)是指該部部位的核核苷酸序序列呈180O反向重復復;粘性末端端(stickyend)是指經(jīng)內(nèi)內(nèi)切酶特特異切割割后產(chǎn)生生的5ˊˊ－末端端突出和和3ˊ－－末端突突出的堿堿基序列列相互間間具有互互補性。BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口口粘端切口口同尾酶有些限制制性內(nèi)切切酶雖然然識別序序列不完完全相同同，但切切割DNA后，，產(chǎn)生相同同的粘性性末端，，稱為同尾尾酶。這這兩個相相同的粘粘性末端端稱為配配伍未端端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA2.DNA聚聚合酶ⅠⅠ（全全酶）E.ColiDNA聚聚合酶ⅠⅠ（DNApolⅠⅠ）是是一個個具有3種酶酶活性的的多功能能性酶。。包括：5ˊ→3ˊDNA聚聚合酶活活性5ˊ→3ˊ核酸酸外切酶酶活性3ˊ→5ˊ核酸酸外切酶酶活性DNApolⅠ應(yīng)應(yīng)用⑴常用來催化DNA缺口口平移反反應(yīng)，制制備高比比活性DNA探針；⑵cDNA第二條條鏈的合合成；⑶對對DNA3突出末端端進行標標記；⑷DNA序序列分析析。E.coliDNApol.ⅠⅠ催化缺缺口平移移*T*T*T*TMg2+DNase

I5'3'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'dATP,dCTP,dGTP[-32P]dTTPE.coliDNAPOLI3.TaqDNA聚合合酶(TaqDNApolymerase)作用特點點1）TaqDNApol催化化DNA合成的的最適溫溫度范圍圍7075℃，，2）95℃以以上高溫溫，半小小時不失失活，3）最最適合用用于聚合酶鏈鏈反應(yīng)（（PCR）。4.逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶特點逆轉(zhuǎn)錄酶酶是一個個多功能能性酶，，至少具具有以下下3種酶酶活性：⑴以以單鏈RNA為為模板，，催化化合成cDNA單鏈⑵具具有RNaseH活活性，，能水解解RNA:DNA雜交交鏈中的的RNA⑶以以DNA為模板板，催化合成成cDNA雙鏈鏈。逆轉(zhuǎn)錄酶酶的應(yīng)用用：⑴將mRNA逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建建cDNA文庫庫；⑵補補平和標標記5ˊ-末端突突出的DNA片片段；⑶代代替Klenow酶用用于DNA序列列分析；；⑷制制備雜交交探針等等。5.DNA聚聚合酶ⅠⅠ大片段段——Klenow片片段Klenow片片段用途途⑴補齊齊雙鏈DNA的的3ˊ末端端；⑵用標標記堿基基補齊3ˊ末端；；⑶用于cDNA克隆中中第二股股鏈的合合成；⑷DNA序序列分析析。6.DNA連連接酶(DNAligase)催化雙鏈鏈DNA中一條條鏈的3’-OH與另一條條鏈的5’-PO3H2形成磷酸酸二酯鍵鍵，從而而構(gòu)成完完整的DNA長長鏈。DNA連連接酶的的用途（1）兩兩個個雙鏈DNA片片段連接接起來5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊˊT4DNA連連接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修修補補帶有缺缺口的雙雙鏈DNA分子子T4DNA連接酶7.堿性性磷酸酶酶（alkalinephosphatase）能夠催化化水解去去除DNA或RNA5’-端端的磷酸酸基團。。用途⒈制備載體體時，用堿堿性磷酸酸酶處理理去除載載體分子子5’’－端磷磷酸基后后，可防止載體體自身環(huán)環(huán)化連接，提提高重組組效率。。⒉用用32P標記5’-端端前，去去除5’’-P，，再通過過激酶作作用把放放射性核核苷酸加加到5'-端端進行標標記。8.末端端（脫脫氧核苷苷酸）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶(TdT)作用將標記或未標標記的dNTP加到DNA的3’-OH末端；；也可催化載載體分子或待待克隆的DNA片段上加加上互補的同同聚尾，便于于進一步連接接。應(yīng)用①探針標標記P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32②在載載體和待克隆隆的片段上形形成同聚物尾尾，以便于進進行連接3′3′重要的工具酶酶工具酶活性限制性核酸內(nèi)切酶（Ⅱ型）

識別特異堿基序列，切割DNAT4DNA連接酶催化DNA5’-磷酸與3’-羥基形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA堿性磷酸酶切除5’-末端磷酸末端轉(zhuǎn)移酶催化3’-端合成同聚尾基因工程的載載體是為“攜攜帶”感興趣趣的外源DNA、實現(xiàn)外外源DNA的的無性繁殖或或表達有意義義的蛋白質(zhì)所所采用的一些些DNA分子子。（三）、基因因工程的載體體常用載體(vector)來源分類：質(zhì)粒載體噬菌體載體病毒載體人工染色體載載體用途分類：克隆載體表達載體穿梭載體克隆載體(cloningvector)能使插入的外外源DNA序序列被復制、、擴增而不能能表達，這樣樣的載體為克隆載體。表達載體(expressionvector)使插入的外源源DNA序列列轉(zhuǎn)錄翻譯，，表達出多肽肽鏈，這樣的的載體稱為表達載體。這類載體中含含有來源不同同的復制子結(jié)結(jié)構(gòu)，既具備備原核細胞復制所需的序序列結(jié)構(gòu)，又又具有能使外外源片段在真核細胞表達所需的結(jié)結(jié)構(gòu)元件和相相應(yīng)的選擇標標記基因,故故能在兩種受受體細胞中復復制并檢測，，克隆的外源源基因在此類類載體直接從從一種受體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入另一種受受體中進行復復制和表達．．穿梭載體（shuttlevector)①具有能使外外源DNA片片段組入的克克隆位點。②能攜帶外源源DNA進入入受體細胞，，或游離在細細胞質(zhì)中進行行自我復制，，或整合到染染色體DNA上隨染色體體DNA的復復制而復制。。③必須具有選選擇標記，承承載外源DNA的載體進進入受體細胞胞后，以便篩篩選克隆子。。④分子量小，，拷貝數(shù)高。。⑤具有較高的的遺傳穩(wěn)定性性。基因克隆載體體必須具備三三個條件松弛型的復制制子、多克隆隆位點、篩選標記.常見:質(zhì)粒、、噬菌體◆克隆載體必需需結(jié)構(gòu):具有復制子，篩選標記，位于多克隆隆位點的上下下游具有轉(zhuǎn)錄錄效率較高的的啟動子，起始密碼子和和核糖體結(jié)合合位點，轉(zhuǎn)錄終止子結(jié)構(gòu)．◆表達載體結(jié)構(gòu)構(gòu)特點：三、基因工程程技術(shù)所生產(chǎn)產(chǎn)的藥物傳統(tǒng)方法很難難生產(chǎn)的，主主要是藥用活活性蛋白質(zhì)和和多肽類，包包括：（1）免疫蛋白質(zhì)----各種種抗原、單克克隆抗體、乙乙肝疫苗。（2）細胞因子----各種種干擾素、白白細胞介素、、集落刺激生生長因子、表表皮生長因子子、凝血因子子、促紅細胞胞生成素。（3）激素----胰島島素、生長激激素、心鈉素素、人腦激素素。（4））酶酶類類----尿尿激激酶酶、、鏈鏈激激酶酶、、葡葡聚聚糖糖酶酶、、組組織織型型纖纖維維蛋蛋白白溶溶解解酶酶原原激激活活劑劑、、超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶、、a-淀淀粉粉酶酶、、凝凝乳乳酶酶、、人人溶溶菌菌酶酶、、胰胰蛋蛋白白酶酶抑抑制制劑劑。。四、、基基因因工工程程制制藥藥的的優(yōu)優(yōu)點點（1））利利用用基基因因工工程程技技術(shù)術(shù)可可以以生生產(chǎn)產(chǎn)出出過過去去難難以以獲獲得得的的生生理理活活性性蛋蛋白白和和多多肽肽。。（2））可可以以通通過過大批批量量的生生產(chǎn)產(chǎn)方方法法獲獲得得足足夠夠數(shù)數(shù)量量的的生生物物活活性性物物質(zhì)質(zhì)。。（3））利利用用基基因因工工程程技技術(shù)術(shù)可可以以發(fā)發(fā)掘掘出出更更多多的的內(nèi)內(nèi)源源性性生生理理活活性性物物質(zhì)質(zhì)。。（4））利利用用基基因因工工程程技技術(shù)術(shù)和和蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)工工程程技技術(shù)術(shù)可可以以對對藥藥物物蛋蛋白白進進行行修飾飾和和改改造造，來來提提高高藥藥效效價價值值和和獲獲得得新新型型的的化化合合物物。。五、、基基因因工工程程制制藥藥所所使使用用的的生生物物技技術(shù)術(shù)（1））DNA重重組組技技術(shù)術(shù)（2））淋淋巴巴細細胞胞雜雜交交瘤瘤技技術(shù)術(shù)（3））細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)技技術(shù)術(shù)（4））克克隆隆表表達達技技術(shù)術(shù)六、、我我國國基基因因工工程程制制藥藥的的進進展展α-1b型型基基因因工工程程干干擾擾素素，是是我我國國自自行行研研究究開開發(fā)發(fā)的的具具有有國國際際先先進進水水平平的的基基因因工工程程藥藥物物，，于于1997年年通通過過III期期臨臨床床，，并并獲獲得得國國家家一類類新新藥藥證證書書。它它源源于于中中國國人人基基因因，，最最適適于于黃黃種種人人使使用用。。目前前，，我我國國已已經(jīng)經(jīng)批批準準了了12種種基基因因工工程程藥藥物物和和疫疫苗苗上上市市。。七、、基基因因工工程程制制藥藥生生產(chǎn)產(chǎn)的的化化學學工工藝藝學學要要求求（1））工工程程菌菌大大規(guī)規(guī)模模發(fā)酵酵工工藝藝最佳佳參參數(shù)數(shù)的的確確立立（2））新新型型生生物物反反應(yīng)應(yīng)器器的的研研制制（3））高高效效分離離介介質(zhì)質(zhì)和裝裝置置的的開開發(fā)發(fā)（4））分分離離純化化技技術(shù)術(shù)的優(yōu)優(yōu)化化控控制制（5））高高純純度度產(chǎn)產(chǎn)品品的的制制備備技技術(shù)術(shù)（6））生生物物傳傳感感器器等等儀儀器器儀儀表表的的設(shè)設(shè)計計和和制制造造（7））電電子子計計算算機機的的智智能能優(yōu)優(yōu)化化控控制制八、、基基因因工工程程的的發(fā)發(fā)展展（一一））基基因因工工程程的的歷歷史史（二二））基基因因工工程程所所生生產(chǎn)產(chǎn)的的產(chǎn)產(chǎn)品品（三三））基基因因工工程程的發(fā)發(fā)展展方方向向（一一））基基因因工工程程的的歷歷史史1973年年----Cohen第第一一例例成成功功的的克克隆隆實實驗驗。。1978年年----Genentech公公司司生生產(chǎn)產(chǎn)出出世世界界上上第第一一種種基基因因工工程程蛋蛋白白藥藥物物----人人胰胰島島素素。。1982年年----第第一一個個基基因因工工程程藥藥物物重重組組人人胰胰島島素素在在英英、、美美獲獲準準使使用用。。八十十年年代代中中期期----PCR技技術(shù)術(shù)發(fā)發(fā)明明1985年年----第第一一批批轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因家家畜畜（（兔兔、、豬豬和和羊羊））培培育育成成功功。。1999年年9月月----中中國國獲獲準準加加入入人人類類基基因因組組計計劃劃，，負負責責測測定定人人類類基基因因組組全全部部序序列列的的1%2000年年6月月26日日----科科學學家家公公布布人人類類基基因因組組工工作作草草圖圖。。2003年年4月月14日日----公公布布人人類類基基因因組組基基本本信信息息。。產(chǎn)品品名名稱稱治療療功功能能與與醫(yī)醫(yī)藥藥范范圍圍1.人胰胰島島素素治療療糖糖尿尿病病2.人人生生長長激激素素治療療侏侏儒儒癥癥，，加加速速創(chuàng)創(chuàng)口口愈愈合合3.αα干干擾擾素素治療療癌癌癥癥、、病病毒毒感感染染4.ββ干干擾擾素素治療療帶帶狀狀皰皰疹疹，，眼眼結(jié)結(jié)、、角角膜膜炎炎5.γγ干干擾擾素素治療療癌癌癥癥、、病病毒毒感感染染6.人人組組織織纖纖溶溶酶酶原原激激活活因因子子(tPA)溶解解血血栓栓，，治治療療急急性性心心肌肌梗梗塞塞7.紅紅細細胞胞生生成成素素(Epo)治療療腎腎病病性性貧貧血血，，增增加加紅紅細細胞胞及及血血色色素素水水平平8.超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶清除除超超氧氧化化物物，，治治療療關(guān)關(guān)節(jié)節(jié)炎炎，，緩緩解解心心肌肌壞壞死死9.凝凝血血因因子子ⅧⅧ治療A型血友友病10.乙型型肝炎疫苗防治肝炎11.神經(jīng)經(jīng)生長因子維持神經(jīng)元細細胞存活、生生長和分化12.腦啡啡膚鎮(zhèn)痛13.降鈣鈣素治療骨質(zhì)疏松松癥（二）基因工工程所生產(chǎn)的的產(chǎn)品基因工程生產(chǎn)產(chǎn)胰島素的原原理（示意圖圖）（三）基因工工程的發(fā)展方向第一代基因工工程----蛋白多肽的的高效表達----經(jīng)典典基因工程第二代基因工工程----蛋白編碼基基因的定向誘誘變----改造基因第三代基因工工程----代謝信息途途徑的修飾重重構(gòu)----改造個體第四代基因工工程----基因組或染染色體的轉(zhuǎn)移移----基基因組工程第二節(jié)、基因因工程基本技技術(shù)與策略一、切二、接三、轉(zhuǎn)四、增五、檢一、切（一）定義--限制性內(nèi)內(nèi)切酶切及與與載體連接（二）關(guān)鍵問問題--限制制性內(nèi)切酶的的選擇及連接接末端的設(shè)計計。（三）具體方方法：1、同種限制制性內(nèi)切酶產(chǎn)產(chǎn)生的粘性末末端連接2、同尾酶產(chǎn)產(chǎn)生的粘性末末端連接3、不同限制制性內(nèi)切酶粘粘性末端的連連接4、人工粘性性末端的連接接--5’突突出末端5、人工粘性性末端的連接接--3’突突出末端6、粘性末端端的添加與更更換，利用人人工接頭Linker幾種主要的連連接策略1、同種限制制性內(nèi)切酶產(chǎn)產(chǎn)生的粘性末末端連接2、同尾酶酶產(chǎn)生的粘性性末端連接3、不同限制制性內(nèi)切酶粘粘性末端的連連接4、人工粘性性末端的連接接--5’突突出末端5、人工粘性性末端的連接接--3’突突出末端6、粘性末端端的添加與更更換，利用人人工接頭Linker二、接（體外外重組）（一）重組率率--含有外外源DNA的的重組分子數(shù)數(shù)/載體分子子總數(shù)（二）重組特特性：粘性末端的重重組率大大高于平末端。雙酶切片段與與載體的重組組率高于單酶切片段與與載體。（三）提高重重組率的方法法1、加大外源源基因片段與與載體的比例例2、選擇基因因序列固有的的酶切位點3、在利用PCR擴增基基因的同時引引入酶切位點點4、利用中間間載體提供酶酶切位點1、加大外源源基因片段與與載體的比例例（1）外源基基因片段與載載體的比例為為5:1--10:1（2）5’末末端去磷酸酸化2、選擇基因序列列兩側(cè)固有酶酶切位點選用酶切位點點,不能在基基因序列內(nèi)部部雙酶切產(chǎn)生粘粘端連接>單單酶切粘端連接>平平端連接3、在利用PCR擴增基基因的同時引引入酶切位點點利用PCR擴擴增基因時，，在引物序列列中加入特定定的限制性酶酶切位點序列，在擴增增基因的兩側(cè)側(cè)就帶有了該該特定酶切位位點。4、利用中中間載體提供供酶切位點例：Taq酶酶特點，常會會在3’末端端添加一個脫脫氧腺苷酸（（A），因此此，為克隆PCR產(chǎn)物，，設(shè)計一個特特殊的載體--T載體，其特點是3’’末端含有一一個脫氧胸腺腺苷酸（T））。PCR產(chǎn)產(chǎn)物可以不經(jīng)經(jīng)過酶切直接接與T載體連連接，T/A克隆隨后就可以利利用質(zhì)粒上插插入基因兩側(cè)側(cè)的酶切位點點來克隆基因因。三、轉(zhuǎn)（外源源基因?qū)爰毤毎ㄒ唬┺D(zhuǎn)化方方法1、大腸桿菌菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化化2、酵母的質(zhì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法法（二）轉(zhuǎn)化率率（三）轉(zhuǎn)化率率的用途（四）轉(zhuǎn)化率率的影響因素素1、大腸桿菌菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化化（1）鈣離子轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法（2）電轉(zhuǎn)化化法（3）大腸桿桿菌的噬菌體轉(zhuǎn)染染（1）鈣離子子轉(zhuǎn)化法適用于革蘭氏氏陰性菌（如如大腸桿菌）），利用鈣離離子與細菌細細胞膜磷脂在在低溫下形成成液晶結(jié)構(gòu)，，這一狀態(tài)下下的細胞稱為為感受態(tài)細胞。此時細胞經(jīng)經(jīng)過熱脈沖發(fā)發(fā)生收縮作用用，細胞膜出出現(xiàn)間隙，此此時質(zhì)粒DNA可通過進進入細胞。（2）電穿孔孔法將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)質(zhì)?；駾NA重組連接液液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀儀的樣品池中，，兩極施加高高壓電場。在在強大電場的的作用下，細細菌細胞壁和和細胞膜產(chǎn)生生縫隙，質(zhì)粒?；駾NA重重組分子便可可進入細胞內(nèi)內(nèi)。電穿孔轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法操作簡簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y(jié)構(gòu)構(gòu)的受體細胞胞均有效，但但轉(zhuǎn)化效率差差別很大。（3）大腸桿桿菌的噬菌體轉(zhuǎn)染染2、酵母的的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方方法（1）乙酸鋰鋰轉(zhuǎn)化法（2）原生質(zhì)質(zhì)體轉(zhuǎn)化法（3）電轉(zhuǎn)化化法（二）轉(zhuǎn)化率率轉(zhuǎn)化率----單位位質(zhì)量的質(zhì)粒粒轉(zhuǎn)化大腸桿桿菌產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子的數(shù)量。鈣離子轉(zhuǎn)化法法：106--109/ug超螺螺旋質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化法：108--1010/ug超螺螺旋質(zhì)粒例如，pUC18對大腸腸桿菌的轉(zhuǎn)化化率為108，即每微克pUC18中中只有108個分子能進入入受體細胞。。一微克pUC18共有有3.4×1011個分子（6.02×1017/2686×660），即即每3400個pUC18分分子才有一個個分子進入受受體細胞在實際操作過過程中，轉(zhuǎn)化化一微克pUC18共需需2ml感受受態(tài)細胞，大大約含有2×1010個大腸桿菌細細胞，也就是是說，每200個細細胞只有一個個細胞能接納納pUC18DNA。。（三）轉(zhuǎn)化率率的用途（四）轉(zhuǎn)化率的影響響因素1、載體本身身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化同一株受受體細胞，其其轉(zhuǎn)化率不同同。2、載體的空空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最最高，經(jīng)酶切切連接后的載載體由于空間間構(gòu)象難以恢恢復，其轉(zhuǎn)化化率要比新制制備的質(zhì)粒低低兩個數(shù)量級級。3、插入片段段的大?。簩|(zhì)粒載體而而言，插入片段越大大，轉(zhuǎn)化效率越低低4、受體細胞胞的性質(zhì)：不同菌株轉(zhuǎn)化化效率有較大大差異5、受體細胞胞與載體的匹匹配：受體細胞必須須與載體相匹匹配，如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌JM83株轉(zhuǎn)化率很低低；但對大腸腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則則較高。6、實驗參數(shù)數(shù)條件方面：：實驗操作對轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率影響較較大，特別是是電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化電壓，電電容，電阻等等參數(shù)的設(shè)置置非常重要。。四、增（重組組基因的擴增增）增殖轉(zhuǎn)化細胞胞擴增與表達載載體上的標記記基因及目標標基因表達外源基因因五、檢（檢檢測轉(zhuǎn)化子，，獲得重組子子）1、抗藥性檢檢測篩選法2、顯色檢測測3、限制酶切切圖譜檢測4、PCR擴增檢測5、原位雜交交檢測6、外源蛋白白質(zhì)功能檢測測外源性DNA插入到載體體DNA的某某一抗藥性基基因區(qū)域時，，會導致抗藥藥基因的失活。轉(zhuǎn)化細胞就就不能生長在在含相應(yīng)抗生生素的培養(yǎng)平平板上。1、抗藥性檢檢測篩選法對于將外源DNA插入BamHⅠ和和SalⅠ之之間位點2.顯色檢測—β-半乳糖糖苷酶篩選系系統(tǒng)：IPTG可誘導LacZ基因片段編碼碼β-半乳糖苷苷酶氨基端片片段,與宿主細胞胞