最新抗體制藥課件第三章

抗體制藥課件第三章抗體制藥課件第三章11、抗體（Antibody，Ab）：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白?？贵w產(chǎn)生的原因：機(jī)體免疫系統(tǒng)因病原菌、病毒感染，受抗原物質(zhì)刺激后產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞，被活化的B淋巴細(xì)胞經(jīng)增殖、分化產(chǎn)生漿細(xì)胞，漿細(xì)胞合成和分泌抗體。1、抗體（Antibody，Ab）：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合2最新抗體制藥課件第三章3最新抗體制藥課件第三章4最新抗體制藥課件第三章5最新抗體制藥課件第三章6最新抗體制藥課件第三章7最新抗體制藥課件第三章8一、McAb制備的一般程序B淋巴細(xì)胞×骨髓瘤細(xì)胞↓融合雜交瘤細(xì)胞↓有限稀釋↓克隆化純一的單克隆細(xì)胞系↓McAb一、McAb制備的一般程序9抗原礦物油↓↓注射活鼠注射BalB/c小鼠刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)誘發(fā)產(chǎn)生骨髓瘤細(xì)胞↓↓制備取鼠脾臟→B淋巴細(xì)胞×骨髓瘤細(xì)胞(HGPR缺陷)↓↓融合（PEG）制取B淋巴細(xì)胞分裝多孔板選擇性培（HAT）↓↓親株死亡B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖↓↓有限稀釋、克隆化制取多克隆抗體分離出單克隆細(xì)胞系→McAb抗原10二、McAb制備的基本技術(shù)（一）抗原的制備制備針對(duì)特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原。1、化學(xué)合成法制備高純度的單一抗原在已知抗原的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行。2、由病原菌、病毒或腫瘤細(xì)胞制備只能得到部分純化，甚至是極不純的抗原混合物。二、McAb制備的基本技術(shù)（一）抗原的制備113、用整個(gè)細(xì)胞或病毒為免疫原刺激動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)后取其B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞融合雜交后，再經(jīng)篩選、克隆化，鑒別篩選出純一的單克隆雜交瘤細(xì)胞系。3、用整個(gè)細(xì)胞或病毒為免疫原刺激動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)12（二）免疫動(dòng)物品系的選擇①多采用與骨髓瘤細(xì)胞供體相同品系的動(dòng)物做為免疫動(dòng)物。因種系距離越遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定。常采用BalB/C小鼠和Lou大鼠。②應(yīng)考慮所選動(dòng)物對(duì)所用抗原能否產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，若不能，應(yīng)改用其他品系的小鼠或大鼠。（二）免疫動(dòng)物品系的選擇13（三）動(dòng)物免疫1、體內(nèi)免疫法適用于抗原量多，免疫原性強(qiáng)的情況，常用8~12周齡的雌性鼠。（三）動(dòng)物免疫14（1）顆粒性抗原（細(xì)胞抗原）免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔刺激動(dòng)物免疫。①初次免疫，腹腔注射107個(gè)細(xì)胞。②3周后，追加免疫1~2次，腹腔注射1~5×106個(gè)在緩沖鹽溶液中洗過(guò)的細(xì)胞。③融合前4~5天，靜脈注射1~5×106個(gè)細(xì)胞。（1）顆粒性抗原（細(xì)胞抗原）15（2）可溶性抗原①按每只小鼠10~100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合皮下注射。②3~4周后，100μg抗原在福氏完全佐劑中追加一次。③采集脾細(xì)胞前3天由靜脈注射最后一次100μg抗原。因免疫后第3天B淋巴細(xì)胞的增殖率最高，是處于迅速分裂期的細(xì)胞，有利于融合后增殖。（2）可溶性抗原16福氏完全佐劑是由礦物油、乳化劑和殺死的分枝桿菌組成的油包水型的乳化佐劑，對(duì)于刺激細(xì)胞免疫和某些實(shí)驗(yàn)性免疫尤其有效。為促進(jìn)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高脾細(xì)胞分泌抗體的能力，可在注射抗原的同時(shí)加入細(xì)菌脂多糖。福氏完全佐劑是由礦物油、乳化劑和殺死的分枝桿菌組成的油包水型172、體外免疫（1）特點(diǎn)a、所用抗原量少（只需幾μg），免疫期短，僅4~5天，干擾因素少。b、融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞不夠穩(wěn)定。適用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況，如制備人源性McAb；或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時(shí)使用。2、體外免疫18（2）基本方法①采用4~8周齡BaLB/C小鼠的脾臟制成單細(xì)胞懸液。②加入抗原使其濃度達(dá)到0.5~5μg/ml。③在5%CO2，37℃下培養(yǎng)4~5天。④分離脾細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。（2）基本方法193、其它免疫方法近年來(lái)，其它免疫方法研究的較多，有脾內(nèi)免疫、腹貯植入、淋巴結(jié)注射、足墊注射等方法。其目的主要是減少抗原用量和注射次數(shù)，縮短免疫周期。3、其它免疫方法20（四）骨髓瘤細(xì)胞的來(lái)源和特性1、來(lái)源（1）骨髓瘤細(xì)胞的來(lái)源應(yīng)同免疫動(dòng)物的種屬一致，一般不選擇產(chǎn)生自身免疫球蛋白的細(xì)胞系。（2）鼠類骨髓瘤細(xì)胞系主要來(lái)自于BalB/C小鼠，少數(shù)來(lái)自于Lou大鼠。這些細(xì)胞系能夠在D-15或其他培養(yǎng)基中保存，在用于融合前應(yīng)保持其活力較高，目前這類細(xì)胞系有商品供應(yīng)。（四）骨髓瘤細(xì)胞的來(lái)源和特性21常用的鼠類骨髓瘤細(xì)胞系有NS-1、X45、X63、P3.653和SP2/O等。其最適培養(yǎng)的細(xì)胞密度為2~5×105細(xì)胞/ml，細(xì)胞密度過(guò)高易引起細(xì)胞死亡?？捎门囵B(yǎng)基內(nèi)酚紅指示劑監(jiān)測(cè)，開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)呈橙色，由于細(xì)胞生長(zhǎng)，PH降低，當(dāng)變?yōu)榧凕S色時(shí)需補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基降低細(xì)胞密度，正常培養(yǎng)基顏色維持在黃橙色之間。常用的鼠類骨髓瘤細(xì)胞系有NS-1、X45、X63、P3.6222、制取骨髓瘤細(xì)胞的制?。河玫V物油注射入小鼠腹腔內(nèi)，誘發(fā)產(chǎn)生腹水癌型漿細(xì)胞。再由腹腔抽取腹水癌細(xì)胞，從中分離獲得。2、制取233、骨髓瘤細(xì)胞系的特性①不能產(chǎn)生自身免疫球蛋白為避免雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體不純，骨髓瘤細(xì)胞不具有產(chǎn)生抗體的能力。②應(yīng)為HGPRT缺陷的細(xì)胞系其細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸合成的補(bǔ)救途徑必須喪失。即磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶或嘧啶核苷酸激酶的活力喪失，即HGPRT陰性細(xì)胞。③融合率高，容易培養(yǎng)，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長(zhǎng)期穩(wěn)定。如：SP2/O和P3.653細(xì)胞系。3、骨髓瘤細(xì)胞系的特性24（五）細(xì)胞融合1、基本方法：取適量B淋巴細(xì)胞（1×108/ml）與骨髓瘤細(xì)胞（2~3×107/ml）進(jìn)行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時(shí)間在2min內(nèi)。然后用HAT培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。（五）細(xì)胞融合252、促進(jìn)融合的條件①分子量在400~6000，濃度在10~60%之間的PEG溶液都能使細(xì)胞發(fā)生融合。目前常用分子量4000，濃度為40~50%的PEG溶液為最佳。②在PEG溶液中加入二甲基亞砜（DMSO），以提高細(xì)胞接觸的緊密性，提高融合率。但PEG和DMSO都對(duì)細(xì)胞有毒性，必須嚴(yán)格控制它們與細(xì)胞接觸的時(shí)間，應(yīng)盡快用新配制的培養(yǎng)液來(lái)稀釋助融劑并洗滌細(xì)胞。③通過(guò)低速離心使細(xì)胞接觸更為緊密來(lái)提高融合率。2、促進(jìn)融合的條件26（六）選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合后，可產(chǎn)生多種融合細(xì)胞，B-B、B-瘤、瘤-瘤的融合細(xì)胞，還有許多未融合的親株細(xì)胞，它們均比B-瘤融合的雜交瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖能力，很易將其淘汰。因此，融合后必須立即移入選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（六）選擇性培養(yǎng)27（1）選擇性培養(yǎng)的原理選擇性培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是用次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（A）能阻斷DNA合成的主要途徑。骨髓瘤細(xì)胞因是HGPRT缺失型，無(wú)DNA合成的補(bǔ)償途徑，因此瘤細(xì)胞和瘤-瘤融合細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。而B(niǎo)細(xì)胞和B-B融合細(xì)胞在這樣的離體組織培養(yǎng)條件下，無(wú)法生存幾天內(nèi)亦迅速死亡。骨髓瘤細(xì)胞是HGPRT（磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）缺陷型，但B細(xì)胞中有這種酶，因此B-瘤融合的雜交瘤細(xì)胞含有HGPRT酶，可利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶（T）來(lái)合成DNA，使雜交瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng)。（1）選擇性培養(yǎng)的原理28（2）選擇性培養(yǎng)的基本方法①將融合反應(yīng)后的細(xì)胞懸浮液于HAT培養(yǎng)液，加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)（0.1ml/孔）。②7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2~3天換液一次。換液時(shí)吸去1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。③第7~14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。④融合后培養(yǎng)的第9~11天，就可對(duì)所有克隆生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆。（2）選擇性培養(yǎng)的基本方法29（3）飼養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)融合細(xì)胞的生長(zhǎng)。單個(gè)或少數(shù)雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。常用飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞（未經(jīng)免疫的脾細(xì)胞）和胸腺細(xì)胞等。飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放某些生長(zhǎng)刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還具有清除死亡細(xì)胞和減少支原體污染的作用。（3）飼養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)融合細(xì)胞的生長(zhǎng)。30（七）雜交瘤培養(yǎng)物（陽(yáng)性克?。┑蔫b定與檢測(cè)經(jīng)培養(yǎng)而得到的雜交瘤細(xì)胞，只有一部分細(xì)胞可能產(chǎn)生針對(duì)特異抗原的目的抗體，因抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5%左右。因此，在培養(yǎng)9~11天左右，雜交瘤細(xì)胞集落直徑達(dá)1mm時(shí)，就應(yīng)對(duì)其能否分泌抗體進(jìn)行特異性鑒定，以便對(duì)抗體分泌陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化和擴(kuò)張。檢測(cè)時(shí)，取上清液的一半體積用于抗體測(cè)定，其余再補(bǔ)加等量的HT完全培養(yǎng)基。（七）雜交瘤培養(yǎng)物（陽(yáng)性克?。┑蔫b定與檢測(cè)311、鑒定與檢測(cè)方法的要求應(yīng)快速、靈敏、特異性（專一性）強(qiáng)、微量、簡(jiǎn)便并一次能檢測(cè)大批標(biāo)本。1、鑒定與檢測(cè)方法的要求322、常用的檢測(cè)方法有①、抗原直接結(jié)合法：適用于檢測(cè)能與可溶性和顆?？乖禺惤Y(jié)合的抗體。②利用第二抗體檢測(cè)的方法：適用于檢測(cè)能與可溶性和顆粒抗原特異結(jié)合的抗體。有酶聯(lián)免疫法，放射免疫法，免疫電鏡技術(shù)，免疫熒光技術(shù)。2、常用的檢測(cè)方法有33（1）抗原直接結(jié)合法①選取相應(yīng)的純一抗原，用125I進(jìn)行標(biāo)記，然后和雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液混合，在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間（如4℃，1h等）②再通過(guò)活性炭吸附、PEG6000沉淀或凝膠層析的方法分離未結(jié)合的抗原，純化抗體抗原免疫復(fù)合物。③最后通過(guò)測(cè)定其復(fù)合物的放射性強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行定性和定量測(cè)定。（1）抗原直接結(jié)合法34（2）利用第二抗體檢測(cè)第二抗體：能與抗原和抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后形成的復(fù)合物進(jìn)行特異結(jié)合的抗體，又稱抗抗體（2）利用第二抗體檢測(cè)35應(yīng)用第二抗體檢測(cè)雜交瘤分泌的抗體時(shí)，需采用免疫標(biāo)記技術(shù)。將第二抗體用125I放射性同位素標(biāo)記，或與酶連接，或與熒光染料連接，或用電子致密物質(zhì)加以標(biāo)記，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。具有應(yīng)用范圍廣，反應(yīng)速度快，容易觀察，且能進(jìn)行定量和定性檢測(cè)的特點(diǎn)。應(yīng)用第二抗體檢測(cè)雜交瘤分泌的抗體時(shí)，需采用免疫標(biāo)記技術(shù)。將第36①免疫熒光技術(shù)是利用結(jié)合有熒光素的第二抗體與抗原抗體的免疫復(fù)合物特異性結(jié)合，再檢測(cè)熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)的技術(shù)。常用的熒光素有異氰基熒光素（FIC）、異硫氰基熒光素等。基本原理：熒光素可與第二抗體球蛋白中賴氨酸的氨基結(jié)合，在藍(lán)紫光激發(fā)下發(fā)射出鮮明的黃綠色或玫瑰紅色，而且結(jié)合熒光素的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合后仍能發(fā)出熒光。①免疫熒光技術(shù)37②酶聯(lián)免疫技術(shù)用酶標(biāo)記抗體或第二抗體來(lái)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)或第二免疫反應(yīng)，檢測(cè)酶標(biāo)記的抗體或第二抗體是通過(guò)酶與特殊底物的反應(yīng)來(lái)進(jìn)行的（顏色變化，氧化還原電位變化等）?！裢ǔＳ玫拿赣校豪备^(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶等。應(yīng)用發(fā)展最快的是酶聯(lián)免疫吸附法，是檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗體的一種最有效方法。②酶聯(lián)免疫技術(shù)38③放射免疫技術(shù)是應(yīng)用同位素標(biāo)記的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行特異結(jié)合，再通過(guò)檢測(cè)放射強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定性定量檢測(cè)抗體的方法。具有高靈敏度和血清反應(yīng)的高特異性的優(yōu)點(diǎn)。但需要γ-計(jì)數(shù)器等檢測(cè)放射性的特殊儀器。③放射免疫技術(shù)39④免疫電鏡技術(shù)：是利用電子致密物質(zhì)標(biāo)記第二抗體后再與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，最后用電子顯微鏡檢測(cè)的技術(shù)。④免疫電鏡技術(shù)：是利用電子致密物質(zhì)標(biāo)記第二抗體后再與抗原抗體40（3）免疫標(biāo)記技術(shù)的方法步驟①將特定的純一抗原（20μg/ml）吸附在微量滴定板小孔中（每孔50~100μl抗原溶液），37℃溫育2h或4℃過(guò)夜，傾去抗原溶液，用DPBS緩沖液洗滌小孔3次，這時(shí)小孔上已粘附了特定的抗原。②用一種不能與待檢測(cè)抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)飽和小孔內(nèi)剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)（1%的牛血清蛋白DPBS緩沖液250μl），然后同樣用DPBS緩沖液洗滌小孔3次。（3）免疫標(biāo)記技術(shù)的方法步驟41③加入待檢測(cè)的雜交瘤培養(yǎng)上清液（每小孔加入上清液50~100μl），在37℃下溫育2h，使待測(cè)抗體與抗原充分結(jié)合。傾去上清液，用DPBS緩沖液洗滌3次。④加入用免疫標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記的第二抗體，使其與已形成的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，然后用相應(yīng)的方法檢測(cè)。③加入待檢測(cè)的雜交瘤培養(yǎng)上清液（每小孔加入上清液50~10042如：采用酶聯(lián)免疫技術(shù)每小孔加入50~100μl酶與第二抗體連接物的溶液，37℃下反應(yīng)30min，使第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。然后，再用含0.05%Tween-20的DPBS液洗滌小孔5次，再加入50~100μl酶的底物溶液，使底物與[抗原-抗體]-第二抗體-酶的復(fù)合物在一定條件下反應(yīng)。最后用多用掃描儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的光密度，再換算成待測(cè)抗體的濃度。如：采用酶聯(lián)免疫技術(shù)43（八）雜交瘤細(xì)胞的克隆化篩選出的陽(yáng)性克隆中（細(xì)胞集落），可能含有不分泌抗體的細(xì)胞，或有多株分泌不同抗體的細(xì)胞。而且剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體易丟失。因此，必須盡早進(jìn)行克隆化。（八）雜交瘤細(xì)胞的克隆化篩選出的陽(yáng)性克隆中（細(xì)胞集落），可44克隆化：分離獲得單細(xì)胞并將單細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)過(guò)程。這些細(xì)胞集團(tuán)中的每個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能是完全相同。一般融合鑒定后獲得的雜交瘤細(xì)胞集落要經(jīng)約3次克隆化，才能達(dá)到100%孔內(nèi)均為單克隆抗體陽(yáng)性細(xì)胞。克隆化：分離獲得單細(xì)胞并將單細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的45常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。1、有限稀釋法將雜交瘤細(xì)胞集落制成單細(xì)胞懸浮液，經(jīng)稀釋到一定細(xì)胞濃度后，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每個(gè)孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。經(jīng)培養(yǎng)、檢測(cè)和鑒定后進(jìn)一步分離篩選。常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。46①第一次克隆化時(shí)要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。②由于單個(gè)細(xì)胞難以存活，克隆化培養(yǎng)時(shí)需加入飼養(yǎng)細(xì)胞輔助其生長(zhǎng)。③抗體的檢測(cè)、鑒別。①第一次克隆化時(shí)要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的472、軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠，將雜交瘤集落的單細(xì)胞懸浮液加入其中，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊。由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細(xì)吸管將小球吸出，團(tuán)塊經(jīng)打碎后再制成單細(xì)胞懸浮液，移入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)和鑒定。用這種方法可以吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，因初代細(xì)胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進(jìn)行克隆化容易成功。2、軟瓊脂法48（九）雜交瘤細(xì)胞與McAb的鑒定1、雜交瘤細(xì)胞的鑒定對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析，不僅可作為鑒定的指標(biāo)，還能幫助了解其分泌抗體的能力。（九）雜交瘤細(xì)胞與McAb的鑒定1、雜交瘤細(xì)胞的鑒定49（1）雜交親本的染色體特點(diǎn)鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)為40，全部是端著絲點(diǎn)染色體。小鼠骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)變異較大，SP2/O細(xì)胞系為62~68，NS-1細(xì)胞系為54~64，大多數(shù)為非整倍體性，并且有中部和亞中部著絲點(diǎn)染色體。（1）雜交親本的染色體特點(diǎn)50（2）雜交瘤細(xì)胞的染色體特點(diǎn)①雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上除多數(shù)為端著絲點(diǎn)染色體外，還有少數(shù)的中著絲點(diǎn)或亞中著絲點(diǎn)標(biāo)志染色體。②染色體數(shù)目較多且又比較集中的雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌高效價(jià)的抗體，而染色體數(shù)目少且較分散的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力較低。（2）雜交瘤細(xì)胞的染色體特點(diǎn)512、McAb的鑒定（1）免疫球蛋白類和亞類的鑒定由于不同類和亞類的免疫球蛋白生物學(xué)特性差異較大，因此要對(duì)制備的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的McAb進(jìn)行Ig類和亞類的鑒定。方法：可用羊或免抗Ig不同類和亞類的抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行鑒定。2、McAb的鑒定52（2）McAb與對(duì)應(yīng)抗原的親和力測(cè)定可為正確選擇不同用途的McAb提供依據(jù)。（3）對(duì)McAb進(jìn)行特異性、純度和識(shí)別抗原的相對(duì)分子質(zhì)量等進(jìn)行測(cè)定。（2）McAb與對(duì)應(yīng)抗原的親和力測(cè)定53（十）單克隆抗體的大量制備McAb的大量制備有體外培養(yǎng)法和體內(nèi)誘生法。1、體內(nèi)誘生法可獲得5~20mg/ml的抗體，目前多采用。（1）動(dòng)物選擇：選用BALB/C小鼠來(lái)制備。（十）單克隆抗體的大量制備McAb的大量制備有體外培養(yǎng)法和54（2）基本方法：①在接種雜交瘤細(xì)胞前1~2周，先給小鼠腹腔注射0.5ml降植烷（或液體石蠟），以破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤細(xì)胞良好增殖的環(huán)境。②注射1×106雜交瘤細(xì)胞。③接種后7~12d抽取腹水，抽取數(shù)次，可達(dá)10ml。④離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。⑤分離純化McAb（凝膠層析，親和層析等）。（2）基本方法：55（3）特點(diǎn)①操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，所獲McAb量較多且效價(jià)高。②可有效地保存雜交瘤細(xì)胞系且能分離已經(jīng)污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株。③小鼠腹水中混有來(lái)自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來(lái)難度。（3）特點(diǎn)562、體外培養(yǎng)法（1）培養(yǎng)液①多采用RPMI1640培養(yǎng)液，添加10~20%胎牛或小牛血清。特點(diǎn)：Ⅰ、由于含有血清成分，總蛋白量可達(dá)100mg/ml以上，給純化帶來(lái)困難。Ⅱ、加入血清易發(fā)生支原體污染，而且批間質(zhì)量差異太大，直接影響雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。2、體外培養(yǎng)法57②無(wú)血清培養(yǎng)液采用RPMI1640培養(yǎng)液，利用白蛋白、胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，乙醇胺等混合物來(lái)代替小牛血清。特點(diǎn)：可減少支原體污染，但產(chǎn)量不高。②無(wú)血清培養(yǎng)液58（2）培養(yǎng)方法①靜止培養(yǎng)法（薄層）。②懸浮和連續(xù)懸浮培養(yǎng)法利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器，增加細(xì)胞生長(zhǎng)空間和細(xì)胞密度，使細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，提高M(jìn)cAb的產(chǎn)量。細(xì)胞密度可達(dá)2.0×107細(xì)胞/ml；收集的McAb可達(dá)400μg/ml。（2）培養(yǎng)方法59③微載體懸浮培養(yǎng)法用DEAE-SephadexA50等材料制成固體顆粒加入培養(yǎng)液中作為細(xì)胞生長(zhǎng)的載體，增大單位體積的表面積，以利于雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞密度可達(dá)108細(xì)胞/ml，并且McAb的產(chǎn)率進(jìn)一步提高。③微載體懸浮培養(yǎng)法60作業(yè)1、解釋：抗體，免疫球蛋白，單克隆抗體，第二抗體，克隆化。2、簡(jiǎn)述單克隆抗體制備的基本步驟。3、用于制備雜交瘤細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備哪些特性？4、雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)的原理？5、簡(jiǎn)述抗體分泌陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞鑒定和檢測(cè)的方法。6、簡(jiǎn)述雜交瘤細(xì)胞克隆化的基本方法。

作業(yè)61最新抗體制藥課件第三章62抗體制藥課件第三章抗體制藥課件第三章631、抗體（Antibody，Ab）：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白?？贵w產(chǎn)生的原因：機(jī)體免疫系統(tǒng)因病原菌、病毒感染，受抗原物質(zhì)刺激后產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞，被活化的B淋巴細(xì)胞經(jīng)增殖、分化產(chǎn)生漿細(xì)胞，漿細(xì)胞合成和分泌抗體。1、抗體（Antibody，Ab）：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合64最新抗體制藥課件第三章65最新抗體制藥課件第三章66最新抗體制藥課件第三章67最新抗體制藥課件第三章68最新抗體制藥課件第三章69最新抗體制藥課件第三章70一、McAb制備的一般程序B淋巴細(xì)胞×骨髓瘤細(xì)胞↓融合雜交瘤細(xì)胞↓有限稀釋↓克隆化純一的單克隆細(xì)胞系↓McAb一、McAb制備的一般程序71抗原礦物油↓↓注射活鼠注射BalB/c小鼠刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)誘發(fā)產(chǎn)生骨髓瘤細(xì)胞↓↓制備取鼠脾臟→B淋巴細(xì)胞×骨髓瘤細(xì)胞(HGPR缺陷)↓↓融合（PEG）制取B淋巴細(xì)胞分裝多孔板選擇性培（HAT）↓↓親株死亡B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖↓↓有限稀釋、克隆化制取多克隆抗體分離出單克隆細(xì)胞系→McAb抗原72二、McAb制備的基本技術(shù)（一）抗原的制備制備針對(duì)特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原。1、化學(xué)合成法制備高純度的單一抗原在已知抗原的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行。2、由病原菌、病毒或腫瘤細(xì)胞制備只能得到部分純化，甚至是極不純的抗原混合物。二、McAb制備的基本技術(shù)（一）抗原的制備733、用整個(gè)細(xì)胞或病毒為免疫原刺激動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)后取其B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞融合雜交后，再經(jīng)篩選、克隆化，鑒別篩選出純一的單克隆雜交瘤細(xì)胞系。3、用整個(gè)細(xì)胞或病毒為免疫原刺激動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)74（二）免疫動(dòng)物品系的選擇①多采用與骨髓瘤細(xì)胞供體相同品系的動(dòng)物做為免疫動(dòng)物。因種系距離越遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定。常采用BalB/C小鼠和Lou大鼠。②應(yīng)考慮所選動(dòng)物對(duì)所用抗原能否產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，若不能，應(yīng)改用其他品系的小鼠或大鼠。（二）免疫動(dòng)物品系的選擇75（三）動(dòng)物免疫1、體內(nèi)免疫法適用于抗原量多，免疫原性強(qiáng)的情況，常用8~12周齡的雌性鼠。（三）動(dòng)物免疫76（1）顆粒性抗原（細(xì)胞抗原）免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔刺激動(dòng)物免疫。①初次免疫，腹腔注射107個(gè)細(xì)胞。②3周后，追加免疫1~2次，腹腔注射1~5×106個(gè)在緩沖鹽溶液中洗過(guò)的細(xì)胞。③融合前4~5天，靜脈注射1~5×106個(gè)細(xì)胞。（1）顆粒性抗原（細(xì)胞抗原）77（2）可溶性抗原①按每只小鼠10~100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合皮下注射。②3~4周后，100μg抗原在福氏完全佐劑中追加一次。③采集脾細(xì)胞前3天由靜脈注射最后一次100μg抗原。因免疫后第3天B淋巴細(xì)胞的增殖率最高，是處于迅速分裂期的細(xì)胞，有利于融合后增殖。（2）可溶性抗原78福氏完全佐劑是由礦物油、乳化劑和殺死的分枝桿菌組成的油包水型的乳化佐劑，對(duì)于刺激細(xì)胞免疫和某些實(shí)驗(yàn)性免疫尤其有效。為促進(jìn)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高脾細(xì)胞分泌抗體的能力，可在注射抗原的同時(shí)加入細(xì)菌脂多糖。福氏完全佐劑是由礦物油、乳化劑和殺死的分枝桿菌組成的油包水型792、體外免疫（1）特點(diǎn)a、所用抗原量少（只需幾μg），免疫期短，僅4~5天，干擾因素少。b、融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞不夠穩(wěn)定。適用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況，如制備人源性McAb；或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時(shí)使用。2、體外免疫80（2）基本方法①采用4~8周齡BaLB/C小鼠的脾臟制成單細(xì)胞懸液。②加入抗原使其濃度達(dá)到0.5~5μg/ml。③在5%CO2，37℃下培養(yǎng)4~5天。④分離脾細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。（2）基本方法813、其它免疫方法近年來(lái)，其它免疫方法研究的較多，有脾內(nèi)免疫、腹貯植入、淋巴結(jié)注射、足墊注射等方法。其目的主要是減少抗原用量和注射次數(shù)，縮短免疫周期。3、其它免疫方法82（四）骨髓瘤細(xì)胞的來(lái)源和特性1、來(lái)源（1）骨髓瘤細(xì)胞的來(lái)源應(yīng)同免疫動(dòng)物的種屬一致，一般不選擇產(chǎn)生自身免疫球蛋白的細(xì)胞系。（2）鼠類骨髓瘤細(xì)胞系主要來(lái)自于BalB/C小鼠，少數(shù)來(lái)自于Lou大鼠。這些細(xì)胞系能夠在D-15或其他培養(yǎng)基中保存，在用于融合前應(yīng)保持其活力較高，目前這類細(xì)胞系有商品供應(yīng)。（四）骨髓瘤細(xì)胞的來(lái)源和特性83常用的鼠類骨髓瘤細(xì)胞系有NS-1、X45、X63、P3.653和SP2/O等。其最適培養(yǎng)的細(xì)胞密度為2~5×105細(xì)胞/ml，細(xì)胞密度過(guò)高易引起細(xì)胞死亡?？捎门囵B(yǎng)基內(nèi)酚紅指示劑監(jiān)測(cè)，開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)呈橙色，由于細(xì)胞生長(zhǎng)，PH降低，當(dāng)變?yōu)榧凕S色時(shí)需補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基降低細(xì)胞密度，正常培養(yǎng)基顏色維持在黃橙色之間。常用的鼠類骨髓瘤細(xì)胞系有NS-1、X45、X63、P3.6842、制取骨髓瘤細(xì)胞的制?。河玫V物油注射入小鼠腹腔內(nèi)，誘發(fā)產(chǎn)生腹水癌型漿細(xì)胞。再由腹腔抽取腹水癌細(xì)胞，從中分離獲得。2、制取853、骨髓瘤細(xì)胞系的特性①不能產(chǎn)生自身免疫球蛋白為避免雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體不純，骨髓瘤細(xì)胞不具有產(chǎn)生抗體的能力。②應(yīng)為HGPRT缺陷的細(xì)胞系其細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸合成的補(bǔ)救途徑必須喪失。即磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶或嘧啶核苷酸激酶的活力喪失，即HGPRT陰性細(xì)胞。③融合率高，容易培養(yǎng)，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長(zhǎng)期穩(wěn)定。如：SP2/O和P3.653細(xì)胞系。3、骨髓瘤細(xì)胞系的特性86（五）細(xì)胞融合1、基本方法：取適量B淋巴細(xì)胞（1×108/ml）與骨髓瘤細(xì)胞（2~3×107/ml）進(jìn)行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時(shí)間在2min內(nèi)。然后用HAT培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。（五）細(xì)胞融合872、促進(jìn)融合的條件①分子量在400~6000，濃度在10~60%之間的PEG溶液都能使細(xì)胞發(fā)生融合。目前常用分子量4000，濃度為40~50%的PEG溶液為最佳。②在PEG溶液中加入二甲基亞砜（DMSO），以提高細(xì)胞接觸的緊密性，提高融合率。但PEG和DMSO都對(duì)細(xì)胞有毒性，必須嚴(yán)格控制它們與細(xì)胞接觸的時(shí)間，應(yīng)盡快用新配制的培養(yǎng)液來(lái)稀釋助融劑并洗滌細(xì)胞。③通過(guò)低速離心使細(xì)胞接觸更為緊密來(lái)提高融合率。2、促進(jìn)融合的條件88（六）選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合后，可產(chǎn)生多種融合細(xì)胞，B-B、B-瘤、瘤-瘤的融合細(xì)胞，還有許多未融合的親株細(xì)胞，它們均比B-瘤融合的雜交瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖能力，很易將其淘汰。因此，融合后必須立即移入選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（六）選擇性培養(yǎng)89（1）選擇性培養(yǎng)的原理選擇性培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是用次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（A）能阻斷DNA合成的主要途徑。骨髓瘤細(xì)胞因是HGPRT缺失型，無(wú)DNA合成的補(bǔ)償途徑，因此瘤細(xì)胞和瘤-瘤融合細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。而B(niǎo)細(xì)胞和B-B融合細(xì)胞在這樣的離體組織培養(yǎng)條件下，無(wú)法生存幾天內(nèi)亦迅速死亡。骨髓瘤細(xì)胞是HGPRT（磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）缺陷型，但B細(xì)胞中有這種酶，因此B-瘤融合的雜交瘤細(xì)胞含有HGPRT酶，可利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶（T）來(lái)合成DNA，使雜交瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng)。（1）選擇性培養(yǎng)的原理90（2）選擇性培養(yǎng)的基本方法①將融合反應(yīng)后的細(xì)胞懸浮液于HAT培養(yǎng)液，加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)（0.1ml/孔）。②7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2~3天換液一次。換液時(shí)吸去1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。③第7~14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。④融合后培養(yǎng)的第9~11天，就可對(duì)所有克隆生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆。（2）選擇性培養(yǎng)的基本方法91（3）飼養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)融合細(xì)胞的生長(zhǎng)。單個(gè)或少數(shù)雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。常用飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞（未經(jīng)免疫的脾細(xì)胞）和胸腺細(xì)胞等。飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放某些生長(zhǎng)刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還具有清除死亡細(xì)胞和減少支原體污染的作用。（3）飼養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)融合細(xì)胞的生長(zhǎng)。92（七）雜交瘤培養(yǎng)物（陽(yáng)性克隆）的鑒定與檢測(cè)經(jīng)培養(yǎng)而得到的雜交瘤細(xì)胞，只有一部分細(xì)胞可能產(chǎn)生針對(duì)特異抗原的目的抗體，因抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5%左右。因此，在培養(yǎng)9~11天左右，雜交瘤細(xì)胞集落直徑達(dá)1mm時(shí)，就應(yīng)對(duì)其能否分泌抗體進(jìn)行特異性鑒定，以便對(duì)抗體分泌陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化和擴(kuò)張。檢測(cè)時(shí)，取上清液的一半體積用于抗體測(cè)定，其余再補(bǔ)加等量的HT完全培養(yǎng)基。（七）雜交瘤培養(yǎng)物（陽(yáng)性克?。┑蔫b定與檢測(cè)931、鑒定與檢測(cè)方法的要求應(yīng)快速、靈敏、特異性（專一性）強(qiáng)、微量、簡(jiǎn)便并一次能檢測(cè)大批標(biāo)本。1、鑒定與檢測(cè)方法的要求942、常用的檢測(cè)方法有①、抗原直接結(jié)合法：適用于檢測(cè)能與可溶性和顆?？乖禺惤Y(jié)合的抗體。②利用第二抗體檢測(cè)的方法：適用于檢測(cè)能與可溶性和顆?？乖禺惤Y(jié)合的抗體。有酶聯(lián)免疫法，放射免疫法，免疫電鏡技術(shù)，免疫熒光技術(shù)。2、常用的檢測(cè)方法有95（1）抗原直接結(jié)合法①選取相應(yīng)的純一抗原，用125I進(jìn)行標(biāo)記，然后和雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液混合，在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間（如4℃，1h等）②再通過(guò)活性炭吸附、PEG6000沉淀或凝膠層析的方法分離未結(jié)合的抗原，純化抗體抗原免疫復(fù)合物。③最后通過(guò)測(cè)定其復(fù)合物的放射性強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行定性和定量測(cè)定。（1）抗原直接結(jié)合法96（2）利用第二抗體檢測(cè)第二抗體：能與抗原和抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后形成的復(fù)合物進(jìn)行特異結(jié)合的抗體，又稱抗抗體（2）利用第二抗體檢測(cè)97應(yīng)用第二抗體檢測(cè)雜交瘤分泌的抗體時(shí)，需采用免疫標(biāo)記技術(shù)。將第二抗體用125I放射性同位素標(biāo)記，或與酶連接，或與熒光染料連接，或用電子致密物質(zhì)加以標(biāo)記，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。具有應(yīng)用范圍廣，反應(yīng)速度快，容易觀察，且能進(jìn)行定量和定性檢測(cè)的特點(diǎn)。應(yīng)用第二抗體檢測(cè)雜交瘤分泌的抗體時(shí)，需采用免疫標(biāo)記技術(shù)。將第98①免疫熒光技術(shù)是利用結(jié)合有熒光素的第二抗體與抗原抗體的免疫復(fù)合物特異性結(jié)合，再檢測(cè)熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)的技術(shù)。常用的熒光素有異氰基熒光素（FIC）、異硫氰基熒光素等?；驹恚簾晒馑乜膳c第二抗體球蛋白中賴氨酸的氨基結(jié)合，在藍(lán)紫光激發(fā)下發(fā)射出鮮明的黃綠色或玫瑰紅色，而且結(jié)合熒光素的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合后仍能發(fā)出熒光。①免疫熒光技術(shù)99②酶聯(lián)免疫技術(shù)用酶標(biāo)記抗體或第二抗體來(lái)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)或第二免疫反應(yīng)，檢測(cè)酶標(biāo)記的抗體或第二抗體是通過(guò)酶與特殊底物的反應(yīng)來(lái)進(jìn)行的（顏色變化，氧化還原電位變化等）。●通常用的酶有：辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶等。應(yīng)用發(fā)展最快的是酶聯(lián)免疫吸附法，是檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗體的一種最有效方法。②酶聯(lián)免疫技術(shù)100③放射免疫技術(shù)是應(yīng)用同位素標(biāo)記的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行特異結(jié)合，再通過(guò)檢測(cè)放射強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定性定量檢測(cè)抗體的方法。具有高靈敏度和血清反應(yīng)的高特異性的優(yōu)點(diǎn)。但需要γ-計(jì)數(shù)器等檢測(cè)放射性的特殊儀器。③放射免疫技術(shù)101④免疫電鏡技術(shù)：是利用電子致密物質(zhì)標(biāo)記第二抗體后再與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，最后用電子顯微鏡檢測(cè)的技術(shù)。④免疫電鏡技術(shù)：是利用電子致密物質(zhì)標(biāo)記第二抗體后再與抗原抗體102（3）免疫標(biāo)記技術(shù)的方法步驟①將特定的純一抗原（20μg/ml）吸附在微量滴定板小孔中（每孔50~100μl抗原溶液），37℃溫育2h或4℃過(guò)夜，傾去抗原溶液，用DPBS緩沖液洗滌小孔3次，這時(shí)小孔上已粘附了特定的抗原。②用一種不能與待檢測(cè)抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)飽和小孔內(nèi)剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)（1%的牛血清蛋白DPBS緩沖液250μl），然后同樣用DPBS緩沖液洗滌小孔3次。（3）免疫標(biāo)記技術(shù)的方法步驟103③加入待檢測(cè)的雜交瘤培養(yǎng)上清液（每小孔加入上清液50~100μl），在37℃下溫育2h，使待測(cè)抗體與抗原充分結(jié)合。傾去上清液，用DPBS緩沖液洗滌3次。④加入用免疫標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記的第二抗體，使其與已形成的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，然后用相應(yīng)的方法檢測(cè)。③加入待檢測(cè)的雜交瘤培養(yǎng)上清液（每小孔加入上清液50~100104如：采用酶聯(lián)免疫技術(shù)每小孔加入50~100μl酶與第二抗體連接物的溶液，37℃下反應(yīng)30min，使第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。然后，再用含0.05%Tween-20的DPBS液洗滌小孔5次，再加入50~100μl酶的底物溶液，使底物與[抗原-抗體]-第二抗體-酶的復(fù)合物在一定條件下反應(yīng)。最后用多用掃描儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的光密度，再換算成待測(cè)抗體的濃度。如：采用酶聯(lián)免疫技術(shù)105（八）雜交瘤細(xì)胞的克隆化篩選出的陽(yáng)性克隆中（細(xì)胞集落），可能含有不分泌抗體的細(xì)胞，或有多株分泌不同抗體的細(xì)胞。而且剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體易丟失。因此，必須盡早進(jìn)行克隆化。（八）雜交瘤細(xì)胞的克隆化篩選出的陽(yáng)性克隆中（細(xì)胞集落），可106克隆化：分離獲得單細(xì)胞并將單細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)過(guò)程。這些細(xì)胞集團(tuán)中的每個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能是完全相同。一般融合鑒定后獲得的雜交瘤細(xì)胞集落要經(jīng)約3次克隆化，才能達(dá)到100%孔內(nèi)均為單克隆抗體陽(yáng)性細(xì)胞?？寺』悍蛛x獲得單細(xì)胞并將單細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的107常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。1、有限稀釋法將雜交瘤細(xì)胞集落制成單細(xì)胞懸浮液，經(jīng)稀釋到一定細(xì)胞濃度后，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每個(gè)孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。經(jīng)培養(yǎng)、檢測(cè)和鑒定后進(jìn)一步分離篩選。常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。108①第一次克隆化時(shí)要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。②由于單個(gè)細(xì)胞難以存活，克隆化培養(yǎng)時(shí)需加入飼養(yǎng)細(xì)胞輔助其生長(zhǎng)。③抗體的檢測(cè)、鑒別。①第一次克隆化時(shí)要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的1092、軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠，將雜交瘤集落的單細(xì)胞懸浮液加入其中，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊。由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細(xì)吸管將小球吸出，團(tuán)塊經(jīng)打碎后再制成單細(xì)胞懸浮液，移入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)和鑒定。用這種方法可以吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，因初代細(xì)胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進(jìn)行克隆化容易成功。2、軟瓊脂法110（九）雜交瘤細(xì)胞與McAb的鑒