最新抗體制藥課件第三章

抗體制藥課件第三章抗體制藥課件第三章11、抗體（Antibody，Ab）：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白?？贵w產(chǎn)生的原因：機體免疫系統(tǒng)因病原菌、病毒感染，受抗原物質(zhì)刺激后產(chǎn)生B淋巴細胞，被活化的B淋巴細胞經(jīng)增殖、分化產(chǎn)生漿細胞，漿細胞合成和分泌抗體。1、抗體（Antibody，Ab）：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合2最新抗體制藥課件第三章3最新抗體制藥課件第三章4最新抗體制藥課件第三章5最新抗體制藥課件第三章6最新抗體制藥課件第三章7最新抗體制藥課件第三章8一、McAb制備的一般程序B淋巴細胞×骨髓瘤細胞↓融合雜交瘤細胞↓有限稀釋↓克隆化純一的單克隆細胞系↓McAb一、McAb制備的一般程序9抗原礦物油↓↓注射活鼠注射BalB/c小鼠刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)誘發(fā)產(chǎn)生骨髓瘤細胞↓↓制備取鼠脾臟→B淋巴細胞×骨髓瘤細胞(HGPR缺陷)↓↓融合（PEG）制取B淋巴細胞分裝多孔板選擇性培（HAT）↓↓親株死亡B淋巴細胞培養(yǎng)雜交瘤細胞生長繁殖↓↓有限稀釋、克隆化制取多克隆抗體分離出單克隆細胞系→McAb抗原10二、McAb制備的基本技術(shù)（一）抗原的制備制備針對特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當抗原。1、化學(xué)合成法制備高純度的單一抗原在已知抗原的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的情況下進行。2、由病原菌、病毒或腫瘤細胞制備只能得到部分純化，甚至是極不純的抗原混合物。二、McAb制備的基本技術(shù)（一）抗原的制備113、用整個細胞或病毒為免疫原刺激動物細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)后取其B淋巴細胞，B淋巴細胞融合雜交后，再經(jīng)篩選、克隆化，鑒別篩選出純一的單克隆雜交瘤細胞系。3、用整個細胞或病毒為免疫原刺激動物細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)12（二）免疫動物品系的選擇①多采用與骨髓瘤細胞供體相同品系的動物做為免疫動物。因種系距離越遠，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定。常采用BalB/C小鼠和Lou大鼠。②應(yīng)考慮所選動物對所用抗原能否產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，若不能，應(yīng)改用其他品系的小鼠或大鼠。（二）免疫動物品系的選擇13（三）動物免疫1、體內(nèi)免疫法適用于抗原量多，免疫原性強的情況，常用8~12周齡的雌性鼠。（三）動物免疫14（1）顆粒性抗原（細胞抗原）免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔刺激動物免疫。①初次免疫，腹腔注射107個細胞。②3周后，追加免疫1~2次，腹腔注射1~5×106個在緩沖鹽溶液中洗過的細胞。③融合前4~5天，靜脈注射1~5×106個細胞。（1）顆粒性抗原（細胞抗原）15（2）可溶性抗原①按每只小鼠10~100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合皮下注射。②3~4周后，100μg抗原在福氏完全佐劑中追加一次。③采集脾細胞前3天由靜脈注射最后一次100μg抗原。因免疫后第3天B淋巴細胞的增殖率最高，是處于迅速分裂期的細胞，有利于融合后增殖。（2）可溶性抗原16福氏完全佐劑是由礦物油、乳化劑和殺死的分枝桿菌組成的油包水型的乳化佐劑，對于刺激細胞免疫和某些實驗性免疫尤其有效。為促進B淋巴細胞轉(zhuǎn)化，提高脾細胞分泌抗體的能力，可在注射抗原的同時加入細菌脂多糖。福氏完全佐劑是由礦物油、乳化劑和殺死的分枝桿菌組成的油包水型172、體外免疫（1）特點a、所用抗原量少（只需幾μg），免疫期短，僅4~5天，干擾因素少。b、融合后產(chǎn)生的雜交瘤細胞不夠穩(wěn)定。適用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況，如制備人源性McAb；或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時使用。2、體外免疫18（2）基本方法①采用4~8周齡BaLB/C小鼠的脾臟制成單細胞懸液。②加入抗原使其濃度達到0.5~5μg/ml。③在5%CO2，37℃下培養(yǎng)4~5天。④分離脾細胞，進行細胞融合。（2）基本方法193、其它免疫方法近年來，其它免疫方法研究的較多，有脾內(nèi)免疫、腹貯植入、淋巴結(jié)注射、足墊注射等方法。其目的主要是減少抗原用量和注射次數(shù)，縮短免疫周期。3、其它免疫方法20（四）骨髓瘤細胞的來源和特性1、來源（1）骨髓瘤細胞的來源應(yīng)同免疫動物的種屬一致，一般不選擇產(chǎn)生自身免疫球蛋白的細胞系。（2）鼠類骨髓瘤細胞系主要來自于BalB/C小鼠，少數(shù)來自于Lou大鼠。這些細胞系能夠在D-15或其他培養(yǎng)基中保存，在用于融合前應(yīng)保持其活力較高，目前這類細胞系有商品供應(yīng)。（四）骨髓瘤細胞的來源和特性21常用的鼠類骨髓瘤細胞系有NS-1、X45、X63、P3.653和SP2/O等。其最適培養(yǎng)的細胞密度為2~5×105細胞/ml，細胞密度過高易引起細胞死亡。可用培養(yǎng)基內(nèi)酚紅指示劑監(jiān)測，開始生長時呈橙色，由于細胞生長，PH降低，當變?yōu)榧凕S色時需補加新鮮培養(yǎng)基降低細胞密度，正常培養(yǎng)基顏色維持在黃橙色之間。常用的鼠類骨髓瘤細胞系有NS-1、X45、X63、P3.6222、制取骨髓瘤細胞的制取：用礦物油注射入小鼠腹腔內(nèi)，誘發(fā)產(chǎn)生腹水癌型漿細胞。再由腹腔抽取腹水癌細胞，從中分離獲得。2、制取233、骨髓瘤細胞系的特性①不能產(chǎn)生自身免疫球蛋白為避免雜交瘤細胞分泌的抗體不純，骨髓瘤細胞不具有產(chǎn)生抗體的能力。②應(yīng)為HGPRT缺陷的細胞系其細胞內(nèi)嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸合成的補救途徑必須喪失。即磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶或嘧啶核苷酸激酶的活力喪失，即HGPRT陰性細胞。③融合率高，容易培養(yǎng)，所產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定。如：SP2/O和P3.653細胞系。3、骨髓瘤細胞系的特性24（五）細胞融合1、基本方法：取適量B淋巴細胞（1×108/ml）與骨髓瘤細胞（2~3×107/ml）進行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時間在2min內(nèi)。然后用HAT培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。（五）細胞融合252、促進融合的條件①分子量在400~6000，濃度在10~60%之間的PEG溶液都能使細胞發(fā)生融合。目前常用分子量4000，濃度為40~50%的PEG溶液為最佳。②在PEG溶液中加入二甲基亞砜（DMSO），以提高細胞接觸的緊密性，提高融合率。但PEG和DMSO都對細胞有毒性，必須嚴格控制它們與細胞接觸的時間，應(yīng)盡快用新配制的培養(yǎng)液來稀釋助融劑并洗滌細胞。③通過低速離心使細胞接觸更為緊密來提高融合率。2、促進融合的條件26（六）選擇性培養(yǎng)細胞融合后，可產(chǎn)生多種融合細胞，B-B、B-瘤、瘤-瘤的融合細胞，還有許多未融合的親株細胞，它們均比B-瘤融合的雜交瘤細胞有更強的增殖能力，很易將其淘汰。因此，融合后必須立即移入選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（六）選擇性培養(yǎng)27（1）選擇性培養(yǎng)的原理選擇性培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是用次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（A）能阻斷DNA合成的主要途徑。骨髓瘤細胞因是HGPRT缺失型，無DNA合成的補償途徑，因此瘤細胞和瘤-瘤融合細胞因不能合成DNA而死亡。而B細胞和B-B融合細胞在這樣的離體組織培養(yǎng)條件下，無法生存幾天內(nèi)亦迅速死亡。骨髓瘤細胞是HGPRT（磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）缺陷型，但B細胞中有這種酶，因此B-瘤融合的雜交瘤細胞含有HGPRT酶，可利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶（T）來合成DNA，使雜交瘤細胞得以生長。（1）選擇性培養(yǎng)的原理28（2）選擇性培養(yǎng)的基本方法①將融合反應(yīng)后的細胞懸浮液于HAT培養(yǎng)液，加入到含有飼養(yǎng)細胞的96孔板內(nèi)（0.1ml/孔）。②7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2~3天換液一次。換液時吸去1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。③第7~14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。④融合后培養(yǎng)的第9~11天，就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清液進行抗體檢測，篩出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。（2）選擇性培養(yǎng)的基本方法29（3）飼養(yǎng)細胞，促進融合細胞的生長。單個或少數(shù)雜交瘤細胞多半不易存活，通常要加入飼養(yǎng)細胞才能使其繁殖。常用飼養(yǎng)細胞有小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞（未經(jīng)免疫的脾細胞）和胸腺細胞等。飼養(yǎng)細胞能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細胞還具有清除死亡細胞和減少支原體污染的作用。（3）飼養(yǎng)細胞，促進融合細胞的生長。30（七）雜交瘤培養(yǎng)物（陽性克?。┑蔫b定與檢測經(jīng)培養(yǎng)而得到的雜交瘤細胞，只有一部分細胞可能產(chǎn)生針對特異抗原的目的抗體，因抗體產(chǎn)生細胞只占所有脾細胞的5%左右。因此，在培養(yǎng)9~11天左右，雜交瘤細胞集落直徑達1mm時，就應(yīng)對其能否分泌抗體進行特異性鑒定，以便對抗體分泌陽性的雜交瘤細胞進行克隆化和擴張。檢測時，取上清液的一半體積用于抗體測定，其余再補加等量的HT完全培養(yǎng)基。（七）雜交瘤培養(yǎng)物（陽性克?。┑蔫b定與檢測311、鑒定與檢測方法的要求應(yīng)快速、靈敏、特異性（專一性）強、微量、簡便并一次能檢測大批標本。1、鑒定與檢測方法的要求322、常用的檢測方法有①、抗原直接結(jié)合法：適用于檢測能與可溶性和顆?？乖禺惤Y(jié)合的抗體。②利用第二抗體檢測的方法：適用于檢測能與可溶性和顆粒抗原特異結(jié)合的抗體。有酶聯(lián)免疫法，放射免疫法，免疫電鏡技術(shù)，免疫熒光技術(shù)。2、常用的檢測方法有33（1）抗原直接結(jié)合法①選取相應(yīng)的純一抗原，用125I進行標記，然后和雜交瘤細胞培養(yǎng)的上清液混合，在一定溫度下反應(yīng)一定時間（如4℃，1h等）②再通過活性炭吸附、PEG6000沉淀或凝膠層析的方法分離未結(jié)合的抗原，純化抗體抗原免疫復(fù)合物。③最后通過測定其復(fù)合物的放射性強弱來進行定性和定量測定。（1）抗原直接結(jié)合法34（2）利用第二抗體檢測第二抗體：能與抗原和抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后形成的復(fù)合物進行特異結(jié)合的抗體，又稱抗抗體（2）利用第二抗體檢測35應(yīng)用第二抗體檢測雜交瘤分泌的抗體時，需采用免疫標記技術(shù)。將第二抗體用125I放射性同位素標記，或與酶連接，或與熒光染料連接，或用電子致密物質(zhì)加以標記，以提高檢測的準確性和靈敏度。具有應(yīng)用范圍廣，反應(yīng)速度快，容易觀察，且能進行定量和定性檢測的特點。應(yīng)用第二抗體檢測雜交瘤分泌的抗體時，需采用免疫標記技術(shù)。將第36①免疫熒光技術(shù)是利用結(jié)合有熒光素的第二抗體與抗原抗體的免疫復(fù)合物特異性結(jié)合，再檢測熒光強度實現(xiàn)定性定量檢測的技術(shù)。常用的熒光素有異氰基熒光素（FIC）、異硫氰基熒光素等。基本原理：熒光素可與第二抗體球蛋白中賴氨酸的氨基結(jié)合，在藍紫光激發(fā)下發(fā)射出鮮明的黃綠色或玫瑰紅色，而且結(jié)合熒光素的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合后仍能發(fā)出熒光。①免疫熒光技術(shù)37②酶聯(lián)免疫技術(shù)用酶標記抗體或第二抗體來進行抗原抗體反應(yīng)或第二免疫反應(yīng)，檢測酶標記的抗體或第二抗體是通過酶與特殊底物的反應(yīng)來進行的（顏色變化，氧化還原電位變化等）?！裢ǔＳ玫拿赣校豪备^氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶等。應(yīng)用發(fā)展最快的是酶聯(lián)免疫吸附法，是檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液中抗體的一種最有效方法。②酶聯(lián)免疫技術(shù)38③放射免疫技術(shù)是應(yīng)用同位素標記的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物進行特異結(jié)合，再通過檢測放射強度來進行定性定量檢測抗體的方法。具有高靈敏度和血清反應(yīng)的高特異性的優(yōu)點。但需要γ-計數(shù)器等檢測放射性的特殊儀器。③放射免疫技術(shù)39④免疫電鏡技術(shù)：是利用電子致密物質(zhì)標記第二抗體后再與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，最后用電子顯微鏡檢測的技術(shù)。④免疫電鏡技術(shù)：是利用電子致密物質(zhì)標記第二抗體后再與抗原抗體40（3）免疫標記技術(shù)的方法步驟①將特定的純一抗原（20μg/ml）吸附在微量滴定板小孔中（每孔50~100μl抗原溶液），37℃溫育2h或4℃過夜，傾去抗原溶液，用DPBS緩沖液洗滌小孔3次，這時小孔上已粘附了特定的抗原。②用一種不能與待檢測抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)飽和小孔內(nèi)剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點（1%的牛血清蛋白DPBS緩沖液250μl），然后同樣用DPBS緩沖液洗滌小孔3次。（3）免疫標記技術(shù)的方法步驟41③加入待檢測的雜交瘤培養(yǎng)上清液（每小孔加入上清液50~100μl），在37℃下溫育2h，使待測抗體與抗原充分結(jié)合。傾去上清液，用DPBS緩沖液洗滌3次。④加入用免疫標記技術(shù)標記的第二抗體，使其與已形成的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，然后用相應(yīng)的方法檢測。③加入待檢測的雜交瘤培養(yǎng)上清液（每小孔加入上清液50~10042如：采用酶聯(lián)免疫技術(shù)每小孔加入50~100μl酶與第二抗體連接物的溶液，37℃下反應(yīng)30min，使第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。然后，再用含0.05%Tween-20的DPBS液洗滌小孔5次，再加入50~100μl酶的底物溶液，使底物與[抗原-抗體]-第二抗體-酶的復(fù)合物在一定條件下反應(yīng)。最后用多用掃描儀在特定波長下測定反應(yīng)產(chǎn)物的光密度，再換算成待測抗體的濃度。如：采用酶聯(lián)免疫技術(shù)43（八）雜交瘤細胞的克隆化篩選出的陽性克隆中（細胞集落），可能含有不分泌抗體的細胞，或有多株分泌不同抗體的細胞。而且剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細胞不穩(wěn)定，染色體易丟失。因此，必須盡早進行克隆化。（八）雜交瘤細胞的克隆化篩選出的陽性克隆中（細胞集落），可44克隆化：分離獲得單細胞并將單細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個過程。這些細胞集團中的每個細胞的生物學(xué)特性和功能是完全相同。一般融合鑒定后獲得的雜交瘤細胞集落要經(jīng)約3次克隆化，才能達到100%孔內(nèi)均為單克隆抗體陽性細胞?？寺』悍蛛x獲得單細胞并將單細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的45常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。1、有限稀釋法將雜交瘤細胞集落制成單細胞懸浮液，經(jīng)稀釋到一定細胞濃度后，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，使每個孔中在理論上只含有一個細胞。經(jīng)培養(yǎng)、檢測和鑒定后進一步分離篩選。常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。46①第一次克隆化時要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。②由于單個細胞難以存活，克隆化培養(yǎng)時需加入飼養(yǎng)細胞輔助其生長。③抗體的檢測、鑒別。①第一次克隆化時要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的472、軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠，將雜交瘤集落的單細胞懸浮液加入其中，細胞分裂后形成小球樣團塊。由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細吸管將小球吸出，團塊經(jīng)打碎后再制成單細胞懸浮液，移入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)和鑒定。用這種方法可以吸出大量克隆細胞進行培養(yǎng)，因初代細胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進行克隆化容易成功。2、軟瓊脂法48（九）雜交瘤細胞與McAb的鑒定1、雜交瘤細胞的鑒定對雜交瘤細胞進行染色體分析，不僅可作為鑒定的指標，還能幫助了解其分泌抗體的能力。（九）雜交瘤細胞與McAb的鑒定1、雜交瘤細胞的鑒定49（1）雜交親本的染色體特點鼠的脾細胞染色體數(shù)為40，全部是端著絲點染色體。小鼠骨髓瘤細胞的染色體數(shù)變異較大，SP2/O細胞系為62~68，NS-1細胞系為54~64，大多數(shù)為非整倍體性，并且有中部和亞中部著絲點染色體。（1）雜交親本的染色體特點50（2）雜交瘤細胞的染色體特點①雜交瘤細胞染色體數(shù)目接近兩種親本細胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上除多數(shù)為端著絲點染色體外，還有少數(shù)的中著絲點或亞中著絲點標志染色體。②染色體數(shù)目較多且又比較集中的雜交瘤細胞能穩(wěn)定分泌高效價的抗體，而染色體數(shù)目少且較分散的雜交瘤細胞分泌抗體的能力較低。（2）雜交瘤細胞的染色體特點512、McAb的鑒定（1）免疫球蛋白類和亞類的鑒定由于不同類和亞類的免疫球蛋白生物學(xué)特性差異較大，因此要對制備的雜交瘤細胞所產(chǎn)生的McAb進行Ig類和亞類的鑒定。方法：可用羊或免抗Ig不同類和亞類的抗體，進行免疫擴散或酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行鑒定。2、McAb的鑒定52（2）McAb與對應(yīng)抗原的親和力測定可為正確選擇不同用途的McAb提供依據(jù)。（3）對McAb進行特異性、純度和識別抗原的相對分子質(zhì)量等進行測定。（2）McAb與對應(yīng)抗原的親和力測定53（十）單克隆抗體的大量制備McAb的大量制備有體外培養(yǎng)法和體內(nèi)誘生法。1、體內(nèi)誘生法可獲得5~20mg/ml的抗體，目前多采用。（1）動物選擇：選用BALB/C小鼠來制備。（十）單克隆抗體的大量制備McAb的大量制備有體外培養(yǎng)法和54（2）基本方法：①在接種雜交瘤細胞前1~2周，先給小鼠腹腔注射0.5ml降植烷（或液體石蠟），以破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤細胞良好增殖的環(huán)境。②注射1×106雜交瘤細胞。③接種后7~12d抽取腹水，抽取數(shù)次，可達10ml。④離心去細胞沉淀，取上清液凍存。⑤分離純化McAb（凝膠層析，親和層析等）。（2）基本方法：55（3）特點①操作簡便、經(jīng)濟，所獲McAb量較多且效價高。②可有效地保存雜交瘤細胞系且能分離已經(jīng)污染雜菌的雜交瘤細胞株。③小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。（3）特點562、體外培養(yǎng)法（1）培養(yǎng)液①多采用RPMI1640培養(yǎng)液，添加10~20%胎?；蛐∨Ｑ?。特點：Ⅰ、由于含有血清成分，總蛋白量可達100mg/ml以上，給純化帶來困難。Ⅱ、加入血清易發(fā)生支原體污染，而且批間質(zhì)量差異太大，直接影響雜交瘤細胞的生長。2、體外培養(yǎng)法57②無血清培養(yǎng)液采用RPMI1640培養(yǎng)液，利用白蛋白、胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，乙醇胺等混合物來代替小牛血清。特點：可減少支原體污染，但產(chǎn)量不高。②無血清培養(yǎng)液58（2）培養(yǎng)方法①靜止培養(yǎng)法（薄層）。②懸浮和連續(xù)懸浮培養(yǎng)法利用動物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器，增加細胞生長空間和細胞密度，使細胞生長旺盛，提高McAb的產(chǎn)量。細胞密度可達2.0×107細胞/ml；收集的McAb可達400μg/ml。（2）培養(yǎng)方法59③微載體懸浮培養(yǎng)法用DEAE-SephadexA50等材料制成固體顆粒加入培養(yǎng)液中作為細胞生長的載體，增大單位體積的表面積，以利于雜交瘤細胞生長，細胞密度可達108細胞/ml，并且McAb的產(chǎn)率進一步提高。③微載體懸浮培養(yǎng)法60作業(yè)1、解釋：抗體，免疫球蛋白，單克隆抗體，第二抗體，克隆化。2、簡述單克隆抗體制備的基本步驟。3、用于制備雜交瘤細胞的骨髓瘤細胞應(yīng)具備哪些特性？4、雜交瘤細胞選擇性培養(yǎng)的原理？5、簡述抗體分泌陽性的雜交瘤細胞鑒定和檢測的方法。6、簡述雜交瘤細胞克隆化的基本方法。

作業(yè)61最新抗體制藥課件第三章62抗體制藥課件第三章抗體制藥課件第三章631、抗體（Antibody，Ab）：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白?？贵w產(chǎn)生的原因：機體免疫系統(tǒng)因病原菌、病毒感染，受抗原物質(zhì)刺激后產(chǎn)生B淋巴細胞，被活化的B淋巴細胞經(jīng)增殖、分化產(chǎn)生漿細胞，漿細胞合成和分泌抗體。1、抗體（Antibody，Ab）：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合64最新抗體制藥課件第三章65最新抗體制藥課件第三章66最新抗體制藥課件第三章67最新抗體制藥課件第三章68最新抗體制藥課件第三章69最新抗體制藥課件第三章70一、McAb制備的一般程序B淋巴細胞×骨髓瘤細胞↓融合雜交瘤細胞↓有限稀釋↓克隆化純一的單克隆細胞系↓McAb一、McAb制備的一般程序71抗原礦物油↓↓注射活鼠注射BalB/c小鼠刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)誘發(fā)產(chǎn)生骨髓瘤細胞↓↓制備取鼠脾臟→B淋巴細胞×骨髓瘤細胞(HGPR缺陷)↓↓融合（PEG）制取B淋巴細胞分裝多孔板選擇性培（HAT）↓↓親株死亡B淋巴細胞培養(yǎng)雜交瘤細胞生長繁殖↓↓有限稀釋、克隆化制取多克隆抗體分離出單克隆細胞系→McAb抗原72二、McAb制備的基本技術(shù)（一）抗原的制備制備針對特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當抗原。1、化學(xué)合成法制備高純度的單一抗原在已知抗原的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的情況下進行。2、由病原菌、病毒或腫瘤細胞制備只能得到部分純化，甚至是極不純的抗原混合物。二、McAb制備的基本技術(shù)（一）抗原的制備733、用整個細胞或病毒為免疫原刺激動物細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)后取其B淋巴細胞，B淋巴細胞融合雜交后，再經(jīng)篩選、克隆化，鑒別篩選出純一的單克隆雜交瘤細胞系。3、用整個細胞或病毒為免疫原刺激動物細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)74（二）免疫動物品系的選擇①多采用與骨髓瘤細胞供體相同品系的動物做為免疫動物。因種系距離越遠，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定。常采用BalB/C小鼠和Lou大鼠。②應(yīng)考慮所選動物對所用抗原能否產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，若不能，應(yīng)改用其他品系的小鼠或大鼠。（二）免疫動物品系的選擇75（三）動物免疫1、體內(nèi)免疫法適用于抗原量多，免疫原性強的情況，常用8~12周齡的雌性鼠。（三）動物免疫76（1）顆粒性抗原（細胞抗原）免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔刺激動物免疫。①初次免疫，腹腔注射107個細胞。②3周后，追加免疫1~2次，腹腔注射1~5×106個在緩沖鹽溶液中洗過的細胞。③融合前4~5天，靜脈注射1~5×106個細胞。（1）顆粒性抗原（細胞抗原）77（2）可溶性抗原①按每只小鼠10~100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合皮下注射。②3~4周后，100μg抗原在福氏完全佐劑中追加一次。③采集脾細胞前3天由靜脈注射最后一次100μg抗原。因免疫后第3天B淋巴細胞的增殖率最高，是處于迅速分裂期的細胞，有利于融合后增殖。（2）可溶性抗原78福氏完全佐劑是由礦物油、乳化劑和殺死的分枝桿菌組成的油包水型的乳化佐劑，對于刺激細胞免疫和某些實驗性免疫尤其有效。為促進B淋巴細胞轉(zhuǎn)化，提高脾細胞分泌抗體的能力，可在注射抗原的同時加入細菌脂多糖。福氏完全佐劑是由礦物油、乳化劑和殺死的分枝桿菌組成的油包水型792、體外免疫（1）特點a、所用抗原量少（只需幾μg），免疫期短，僅4~5天，干擾因素少。b、融合后產(chǎn)生的雜交瘤細胞不夠穩(wěn)定。適用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況，如制備人源性McAb；或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時使用。2、體外免疫80（2）基本方法①采用4~8周齡BaLB/C小鼠的脾臟制成單細胞懸液。②加入抗原使其濃度達到0.5~5μg/ml。③在5%CO2，37℃下培養(yǎng)4~5天。④分離脾細胞，進行細胞融合。（2）基本方法813、其它免疫方法近年來，其它免疫方法研究的較多，有脾內(nèi)免疫、腹貯植入、淋巴結(jié)注射、足墊注射等方法。其目的主要是減少抗原用量和注射次數(shù)，縮短免疫周期。3、其它免疫方法82（四）骨髓瘤細胞的來源和特性1、來源（1）骨髓瘤細胞的來源應(yīng)同免疫動物的種屬一致，一般不選擇產(chǎn)生自身免疫球蛋白的細胞系。（2）鼠類骨髓瘤細胞系主要來自于BalB/C小鼠，少數(shù)來自于Lou大鼠。這些細胞系能夠在D-15或其他培養(yǎng)基中保存，在用于融合前應(yīng)保持其活力較高，目前這類細胞系有商品供應(yīng)。（四）骨髓瘤細胞的來源和特性83常用的鼠類骨髓瘤細胞系有NS-1、X45、X63、P3.653和SP2/O等。其最適培養(yǎng)的細胞密度為2~5×105細胞/ml，細胞密度過高易引起細胞死亡?？捎门囵B(yǎng)基內(nèi)酚紅指示劑監(jiān)測，開始生長時呈橙色，由于細胞生長，PH降低，當變?yōu)榧凕S色時需補加新鮮培養(yǎng)基降低細胞密度，正常培養(yǎng)基顏色維持在黃橙色之間。常用的鼠類骨髓瘤細胞系有NS-1、X45、X63、P3.6842、制取骨髓瘤細胞的制?。河玫V物油注射入小鼠腹腔內(nèi)，誘發(fā)產(chǎn)生腹水癌型漿細胞。再由腹腔抽取腹水癌細胞，從中分離獲得。2、制取853、骨髓瘤細胞系的特性①不能產(chǎn)生自身免疫球蛋白為避免雜交瘤細胞分泌的抗體不純，骨髓瘤細胞不具有產(chǎn)生抗體的能力。②應(yīng)為HGPRT缺陷的細胞系其細胞內(nèi)嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸合成的補救途徑必須喪失。即磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶或嘧啶核苷酸激酶的活力喪失，即HGPRT陰性細胞。③融合率高，容易培養(yǎng)，所產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定。如：SP2/O和P3.653細胞系。3、骨髓瘤細胞系的特性86（五）細胞融合1、基本方法：取適量B淋巴細胞（1×108/ml）與骨髓瘤細胞（2~3×107/ml）進行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時間在2min內(nèi)。然后用HAT培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。（五）細胞融合872、促進融合的條件①分子量在400~6000，濃度在10~60%之間的PEG溶液都能使細胞發(fā)生融合。目前常用分子量4000，濃度為40~50%的PEG溶液為最佳。②在PEG溶液中加入二甲基亞砜（DMSO），以提高細胞接觸的緊密性，提高融合率。但PEG和DMSO都對細胞有毒性，必須嚴格控制它們與細胞接觸的時間，應(yīng)盡快用新配制的培養(yǎng)液來稀釋助融劑并洗滌細胞。③通過低速離心使細胞接觸更為緊密來提高融合率。2、促進融合的條件88（六）選擇性培養(yǎng)細胞融合后，可產(chǎn)生多種融合細胞，B-B、B-瘤、瘤-瘤的融合細胞，還有許多未融合的親株細胞，它們均比B-瘤融合的雜交瘤細胞有更強的增殖能力，很易將其淘汰。因此，融合后必須立即移入選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（六）選擇性培養(yǎng)89（1）選擇性培養(yǎng)的原理選擇性培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是用次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（A）能阻斷DNA合成的主要途徑。骨髓瘤細胞因是HGPRT缺失型，無DNA合成的補償途徑，因此瘤細胞和瘤-瘤融合細胞因不能合成DNA而死亡。而B細胞和B-B融合細胞在這樣的離體組織培養(yǎng)條件下，無法生存幾天內(nèi)亦迅速死亡。骨髓瘤細胞是HGPRT（磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）缺陷型，但B細胞中有這種酶，因此B-瘤融合的雜交瘤細胞含有HGPRT酶，可利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶（T）來合成DNA，使雜交瘤細胞得以生長。（1）選擇性培養(yǎng)的原理90（2）選擇性培養(yǎng)的基本方法①將融合反應(yīng)后的細胞懸浮液于HAT培養(yǎng)液，加入到含有飼養(yǎng)細胞的96孔板內(nèi)（0.1ml/孔）。②7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2~3天換液一次。換液時吸去1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。③第7~14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。④融合后培養(yǎng)的第9~11天，就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清液進行抗體檢測，篩出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。（2）選擇性培養(yǎng)的基本方法91（3）飼養(yǎng)細胞，促進融合細胞的生長。單個或少數(shù)雜交瘤細胞多半不易存活，通常要加入飼養(yǎng)細胞才能使其繁殖。常用飼養(yǎng)細胞有小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞（未經(jīng)免疫的脾細胞）和胸腺細胞等。飼養(yǎng)細胞能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細胞還具有清除死亡細胞和減少支原體污染的作用。（3）飼養(yǎng)細胞，促進融合細胞的生長。92（七）雜交瘤培養(yǎng)物（陽性克?。┑蔫b定與檢測經(jīng)培養(yǎng)而得到的雜交瘤細胞，只有一部分細胞可能產(chǎn)生針對特異抗原的目的抗體，因抗體產(chǎn)生細胞只占所有脾細胞的5%左右。因此，在培養(yǎng)9~11天左右，雜交瘤細胞集落直徑達1mm時，就應(yīng)對其能否分泌抗體進行特異性鑒定，以便對抗體分泌陽性的雜交瘤細胞進行克隆化和擴張。檢測時，取上清液的一半體積用于抗體測定，其余再補加等量的HT完全培養(yǎng)基。（七）雜交瘤培養(yǎng)物（陽性克?。┑蔫b定與檢測931、鑒定與檢測方法的要求應(yīng)快速、靈敏、特異性（專一性）強、微量、簡便并一次能檢測大批標本。1、鑒定與檢測方法的要求942、常用的檢測方法有①、抗原直接結(jié)合法：適用于檢測能與可溶性和顆?？乖禺惤Y(jié)合的抗體。②利用第二抗體檢測的方法：適用于檢測能與可溶性和顆?？乖禺惤Y(jié)合的抗體。有酶聯(lián)免疫法，放射免疫法，免疫電鏡技術(shù)，免疫熒光技術(shù)。2、常用的檢測方法有95（1）抗原直接結(jié)合法①選取相應(yīng)的純一抗原，用125I進行標記，然后和雜交瘤細胞培養(yǎng)的上清液混合，在一定溫度下反應(yīng)一定時間（如4℃，1h等）②再通過活性炭吸附、PEG6000沉淀或凝膠層析的方法分離未結(jié)合的抗原，純化抗體抗原免疫復(fù)合物。③最后通過測定其復(fù)合物的放射性強弱來進行定性和定量測定。（1）抗原直接結(jié)合法96（2）利用第二抗體檢測第二抗體：能與抗原和抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后形成的復(fù)合物進行特異結(jié)合的抗體，又稱抗抗體（2）利用第二抗體檢測97應(yīng)用第二抗體檢測雜交瘤分泌的抗體時，需采用免疫標記技術(shù)。將第二抗體用125I放射性同位素標記，或與酶連接，或與熒光染料連接，或用電子致密物質(zhì)加以標記，以提高檢測的準確性和靈敏度。具有應(yīng)用范圍廣，反應(yīng)速度快，容易觀察，且能進行定量和定性檢測的特點。應(yīng)用第二抗體檢測雜交瘤分泌的抗體時，需采用免疫標記技術(shù)。將第98①免疫熒光技術(shù)是利用結(jié)合有熒光素的第二抗體與抗原抗體的免疫復(fù)合物特異性結(jié)合，再檢測熒光強度實現(xiàn)定性定量檢測的技術(shù)。常用的熒光素有異氰基熒光素（FIC）、異硫氰基熒光素等。基本原理：熒光素可與第二抗體球蛋白中賴氨酸的氨基結(jié)合，在藍紫光激發(fā)下發(fā)射出鮮明的黃綠色或玫瑰紅色，而且結(jié)合熒光素的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合后仍能發(fā)出熒光。①免疫熒光技術(shù)99②酶聯(lián)免疫技術(shù)用酶標記抗體或第二抗體來進行抗原抗體反應(yīng)或第二免疫反應(yīng)，檢測酶標記的抗體或第二抗體是通過酶與特殊底物的反應(yīng)來進行的（顏色變化，氧化還原電位變化等）。●通常用的酶有：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶等。應(yīng)用發(fā)展最快的是酶聯(lián)免疫吸附法，是檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液中抗體的一種最有效方法。②酶聯(lián)免疫技術(shù)100③放射免疫技術(shù)是應(yīng)用同位素標記的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物進行特異結(jié)合，再通過檢測放射強度來進行定性定量檢測抗體的方法。具有高靈敏度和血清反應(yīng)的高特異性的優(yōu)點。但需要γ-計數(shù)器等檢測放射性的特殊儀器。③放射免疫技術(shù)101④免疫電鏡技術(shù)：是利用電子致密物質(zhì)標記第二抗體后再與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，最后用電子顯微鏡檢測的技術(shù)。④免疫電鏡技術(shù)：是利用電子致密物質(zhì)標記第二抗體后再與抗原抗體102（3）免疫標記技術(shù)的方法步驟①將特定的純一抗原（20μg/ml）吸附在微量滴定板小孔中（每孔50~100μl抗原溶液），37℃溫育2h或4℃過夜，傾去抗原溶液，用DPBS緩沖液洗滌小孔3次，這時小孔上已粘附了特定的抗原。②用一種不能與待檢測抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)飽和小孔內(nèi)剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點（1%的牛血清蛋白DPBS緩沖液250μl），然后同樣用DPBS緩沖液洗滌小孔3次。（3）免疫標記技術(shù)的方法步驟103③加入待檢測的雜交瘤培養(yǎng)上清液（每小孔加入上清液50~100μl），在37℃下溫育2h，使待測抗體與抗原充分結(jié)合。傾去上清液，用DPBS緩沖液洗滌3次。④加入用免疫標記技術(shù)標記的第二抗體，使其與已形成的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，然后用相應(yīng)的方法檢測。③加入待檢測的雜交瘤培養(yǎng)上清液（每小孔加入上清液50~100104如：采用酶聯(lián)免疫技術(shù)每小孔加入50~100μl酶與第二抗體連接物的溶液，37℃下反應(yīng)30min，使第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。然后，再用含0.05%Tween-20的DPBS液洗滌小孔5次，再加入50~100μl酶的底物溶液，使底物與[抗原-抗體]-第二抗體-酶的復(fù)合物在一定條件下反應(yīng)。最后用多用掃描儀在特定波長下測定反應(yīng)產(chǎn)物的光密度，再換算成待測抗體的濃度。如：采用酶聯(lián)免疫技術(shù)105（八）雜交瘤細胞的克隆化篩選出的陽性克隆中（細胞集落），可能含有不分泌抗體的細胞，或有多株分泌不同抗體的細胞。而且剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細胞不穩(wěn)定，染色體易丟失。因此，必須盡早進行克隆化。（八）雜交瘤細胞的克隆化篩選出的陽性克隆中（細胞集落），可106克隆化：分離獲得單細胞并將單細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個過程。這些細胞集團中的每個細胞的生物學(xué)特性和功能是完全相同。一般融合鑒定后獲得的雜交瘤細胞集落要經(jīng)約3次克隆化，才能達到100%孔內(nèi)均為單克隆抗體陽性細胞?？寺』悍蛛x獲得單細胞并將單細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的107常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。1、有限稀釋法將雜交瘤細胞集落制成單細胞懸浮液，經(jīng)稀釋到一定細胞濃度后，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，使每個孔中在理論上只含有一個細胞。經(jīng)培養(yǎng)、檢測和鑒定后進一步分離篩選。常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。108①第一次克隆化時要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。②由于單個細胞難以存活，克隆化培養(yǎng)時需加入飼養(yǎng)細胞輔助其生長。③抗體的檢測、鑒別。①第一次克隆化時要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的1092、軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠，將雜交瘤集落的單細胞懸浮液加入其中，細胞分裂后形成小球樣團塊。由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細吸管將小球吸出，團塊經(jīng)打碎后再制成單細胞懸浮液，移入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)和鑒定。用這種方法可以吸出大量克隆細胞進行培養(yǎng)，因初代細胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進行克隆化容易成功。2、軟瓊脂法110（九）雜交瘤細胞與McAb的鑒