基于免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的檢測研究及其在堆肥

基于免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的檢測研究及其在堆肥賴萃曾光明黃丹蓮馮沖凌胡霜蘇峰峰趙美花黃超危臻【內(nèi)容摘要】金納米顆粒作為一種性能優(yōu)異的標(biāo)記物應(yīng)用廣泛。隨后發(fā)展出來的免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)作為一種靈敏度高、操作步驟簡便、檢測快速的免疫反應(yīng)檢測技術(shù)得到廣泛關(guān)注。本文介紹了免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的基本原理、制備方法并詳述了近年來該技術(shù)的新發(fā)展。除此之外，結(jié)合免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在免疫檢測與環(huán)境檢測實際工作中的應(yīng)用，瞻望了其在堆肥環(huán)境檢測中的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景?！颈疚年P(guān)鍵詞語】膠體金；標(biāo)記；免疫檢測；堆肥;評述abstractｇoldnanoparticlehasbeenwidelyusedasagoodlabelingsubstance.subsequently,increasingconcernhasbeenpaidtoimmunogoldlabelingtechniquewhichhashighsensitivity,simpleprocedureandrapiddetectioninimmunoassay.ｔhebasicprinciple,preparationmethodsandimportantdevelopmentsofimmunogoldlabelingtechniquewereintroducedinthisarticle.inaddition,thenewapplicationsandprospectsofimmunogoldlabelingtechniqueincompostdetectionwereproposedbasedontheapplicationsinimmunoassayandenvironmentalanalysis.keywordscolloidalgold;labeling;immunoassay;composting;review1引言堆肥被以為是將固體廢物減量化、資源化的最佳途徑[1]。研究建立有效而實用的原位、在體、實時、高靈敏度、高選擇性的分析檢測方法，用于檢測與控制堆肥經(jīng)過中生物組分及污染物，這是堆肥研究中的關(guān)鍵技術(shù)。傳統(tǒng)的堆肥分析檢測方法常需要冗雜、冗長的萃取、提純、濃縮、色譜分離等步驟，而且試劑用量大，費用高[2]。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于特異性抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金具有納米材料所特有的三大效應(yīng)：外表效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，具有很大的比外表積，獨特的光學(xué)、導(dǎo)電、導(dǎo)熱等物理特性以及良好的生物相容性[3～5]，能夠與蛋白質(zhì)、核酸等非共價結(jié)合，且檢測不依靠昂貴的激光檢測儀器，只需普通，以至肉眼可辨。另外免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)具有制造方便、價格低廉、容易操作、無放射性污染等優(yōu)點，知足了現(xiàn)場快速環(huán)境檢測及實時監(jiān)測等方面的要求。但是該技術(shù)在環(huán)境污染治理領(lǐng)域，十分是堆肥環(huán)境檢測的應(yīng)用起步較晚，相關(guān)報道較少。本文通過評述免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)近年來的新發(fā)展及實際應(yīng)用情況，十分是在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展來瞻望其在堆肥環(huán)境檢測中的應(yīng)用前景。2免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的研究現(xiàn)在狀況2.1膠體金標(biāo)記原理與制備膠體金是氯金酸在復(fù)原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用構(gòu)成一種穩(wěn)定的膠體狀況，故稱之為膠體金[6]。在堿性條件下，膠體金顆粒外表帶負(fù)電荷，可與目的蛋白質(zhì)所帶正電荷基團之間構(gòu)成非共價鍵的靜電吸引而結(jié)實結(jié)合，這種結(jié)合對所標(biāo)蛋白的生物學(xué)活性無明顯影響。吸附在膠體金外表的抗原或抗體能定向?qū)⒛z體金顆粒載運到組織或細(xì)胞內(nèi)、固相載體上的相應(yīng)抗體、抗原的位置。由于金顆粒具高電子密度的特性，這些標(biāo)記物在抗原抗體反應(yīng)處聚集到達(dá)一定密度時〔即金顆粒107個/mm2〕，出現(xiàn)肉眼可見的粉紅色斑點[7]。膠體金溶液的常見制備方法大致分為白磷復(fù)原法、硼氫化鈉復(fù)原法、抗壞血酸鹽復(fù)原法、檸檬酸三鈉復(fù)原法和鞣酸檸檬酸三鈉復(fù)原法。其基本原理是向一定濃度的金溶液內(nèi)參加適量復(fù)原劑，使金離子復(fù)原為金原子。通過改變反應(yīng)體系中氯金酸與復(fù)原劑的比例可得到所需不同直徑的金顆粒。慣例制備膠體金的方法是用電爐加熱。sun等[8]改良了制備方法，采取微波技術(shù)所制膠體顆粒體系穩(wěn)定，而且能控制顆粒大小。膠體金標(biāo)記物又被稱為膠體金結(jié)合物、膠體金探針或免疫金。被標(biāo)記物須經(jīng)過徹底除鹽的預(yù)處理，而制備穩(wěn)定的膠體金結(jié)合物受多種因素影響，如金顆粒大小、離子濃度、被標(biāo)記物用量及標(biāo)記體系的ph值等。最適ph值一般接近或略大于被標(biāo)記物的等電點，而被標(biāo)記物的用量取決于金顆粒的大小。評價膠體金質(zhì)量的方法有肉眼觀察、光譜分析評價、電鏡評價及zeta電位分析等。肉眼觀察膠體金的顏色可對其質(zhì)量進(jìn)行初步判定。在可見光范圍內(nèi)〔400～700nm〕對膠體金顆粒進(jìn)行掃描獲得膠體金可見光吸收光譜。3～20nm金顆粒在520nm處有吸收峰，隨著粒子粒徑的增加，會出現(xiàn)最大吸收波長紅移及峰形展寬的現(xiàn)象[910]。透射電鏡則可更直觀地觀察金顆粒的大小、均勻水平、顆粒的形狀及凝集情況。zeta電位的大小可反映制備的膠體金體系的穩(wěn)定水平。2.2免疫金標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展1971年,faulk等[11]把免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)用于細(xì)胞構(gòu)造的透射電鏡〔tem〕研究后，關(guān)于膠體金制備和應(yīng)用研究的報道逐步增加。1983年，holgate等[12]將免疫金染色技術(shù)〔igs〕與銀顯影方法相結(jié)合創(chuàng)立了免疫金銀染色法〔immunogoldsilverstaining,igss〕，利用膠體金催化溶液中銀離子的復(fù)原，使金屬銀在膠體金外表聚集，而聚集的銀又起到了催化的作用，使得更多的銀被復(fù)原〔如此圖1〕。通過這種加強作用使得在光鏡下可視粒子的半徑比單獨的金顆粒增長了10～50倍，這樣能夠采取小顆粒〔＜15nm〕以增長標(biāo)記密度，進(jìn)而有效地提升了免疫膠體金標(biāo)記的靈敏度?？乖瞐ntigen〕;銀顆?！瞫ilvernanoparticle〕;金顆粒〔goldnanoparticle〕;抗體〔antibody〕.近年來，免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)得到了不斷地發(fā)展和改良，微波〔mw〕技術(shù)開始應(yīng)用其中。galvez等[13]在不改變其它實驗條件的情況下采取微波技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記，使標(biāo)記經(jīng)過中固定時間至少縮短20min。兩種技術(shù)的結(jié)合使標(biāo)記效果更好，背景清楚明晰，而且縮短染色時間。同時增長反應(yīng)強度后較慣例方法所需抗體濃度低，可節(jié)約價格昂貴的一抗。免疫層析法〔immunochromatography〕是2090年代興起的一種快速診斷技術(shù)，膠體金免疫層析技術(shù)〔gica〕就是利用膠體金自己的顯色特點結(jié)合免疫層析技術(shù)診斷特異性的待測物而發(fā)展起來的。這項技術(shù)既可采取雙抗體夾心法測抗原，又可用間接法、競爭法測抗體。在該技術(shù)基礎(chǔ)上研制的膠體金免疫層析試紙條、試劑盒操作起來方便快捷，應(yīng)用前景廣闊。免疫膠金標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展已不僅僅局限在其作為示蹤標(biāo)記物的功能方面，已有關(guān)于放大檢測信號方法研究的報道。生物素親和素系統(tǒng)應(yīng)用于免疫金標(biāo)記技術(shù)，帶正電荷的鏈霉親和素標(biāo)記在帶負(fù)電荷的膠體金顆粒上，又能與生物素嚴(yán)密結(jié)合，使檢測信號在只要膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上得到擴大[14]。hou等[15]利用縮氨酸與硝酸纖維素膜的互相作用固定生物素抗體于膜上，并分別采取有無銀加強金標(biāo)記技術(shù)檢測生物素化縮氨酸，無銀加強檢出限為100amol/ml，銀加強金標(biāo)記檢出限可達(dá)100zmol/ml。tanaka等[16]將一抗也標(biāo)記上膠體金，作為信號加強子進(jìn)而提升檢測的靈敏度，可檢測到人血清中10pg/mlhcg，到達(dá)了elisa方法檢測的靈敏度。ambrosi等[17]采取雙標(biāo)記方法將酶標(biāo)二抗標(biāo)記在膠體金上，一個15nm的膠體金顆粒上能夠標(biāo)記約10個酶標(biāo)二抗分子，其檢測靈敏度比慣例elisa方法更高層次。nam等[18]在免疫金標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了bca〔ｂiobarcodeamplification〕擴增技術(shù)，金顆粒外表修飾了起信號放大作用的條形碼dna和針對待測蛋白的抗體，磁微粒外表則修飾待測蛋白的另一種單克隆抗體。兩者與待測蛋白構(gòu)成復(fù)合構(gòu)造，復(fù)合物經(jīng)過磁場分離，金顆粒受熱變性釋放條形碼dna，通過對其進(jìn)行無pcr或pcr檢測，間接檢測目的蛋白，檢出限分別達(dá)30和3amol。經(jīng)太多次信號放大技術(shù)，克制了對酶促反應(yīng)的依靠，檢測靈敏度比elisa高103～106倍，并可同時檢測多個蛋白[19]。鐘曉琴等[20]在bca方法的基礎(chǔ)上，將膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)與酶免疫標(biāo)記技術(shù)有效地結(jié)合起來，制備酶標(biāo)金探針。其靈敏度高且步驟簡單，只需普通光學(xué)儀器即可檢測蛋白質(zhì)。通過對免疫金標(biāo)記技術(shù)研究工作的不斷深切進(jìn)入，必將使該技術(shù)的使用效果更佳，應(yīng)用于更多的研究領(lǐng)域。3免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展早期免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)重要應(yīng)用于光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞外表抗原進(jìn)行組化研究，但因靈敏度低而遭到限制。igss創(chuàng)立以后免疫金標(biāo)記技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。當(dāng)前，免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在組化中的應(yīng)用已日趨普遍，膠體金探針的種類也越來越多。由于膠體金的高電子密度使其在電鏡下清楚明晰可辨，因而該技術(shù)進(jìn)一步在電鏡上使用，由對組織細(xì)胞定位研究，進(jìn)一步深切進(jìn)入到了基因轉(zhuǎn)錄水平、基因表達(dá)的檢測、染色體的基因定位、特定核酸序列在細(xì)胞內(nèi)的空間分布分析及核酸復(fù)制經(jīng)過中的定性與定量分析等。3.1免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在免疫檢測中的應(yīng)用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的逐步發(fā)展使其在免疫檢測等很多領(lǐng)域已得到越來越多的應(yīng)用。wino等[21]分別制備核定位信號nls1及nls2抗體，電鏡檢測兩種金標(biāo)抗體在a流感病毒vrnp構(gòu)造中的位點，以了解二者運輸vrnp中的不同作用。檢測結(jié)果顯示:71%的vrnps上檢測到nls1抗體，低于10%vrnps上檢測到nls2抗體。jiang等[22]結(jié)合微陣列技術(shù)與免疫金標(biāo)記技術(shù)檢測弓形蟲感染、風(fēng)疹、巨細(xì)胞病毒、泡疹〔torch〕對妊娠期婦女及胎兒危害極大的病毒igm抗體，檢出限達(dá)0.24mg/l，操作方便。在腫瘤診斷方面應(yīng)用膠體金免疫電鏡技術(shù)結(jié)合生物體視學(xué)和圖像分析技術(shù)，討論良惡性腫瘤和癌前病變病理形態(tài)的定量診斷方法，使診斷的正確率明顯提升。由于膠體金具有肉眼可觀測的紅色，所以既可用于免疫電鏡、光鏡檢測，又能作為指導(dǎo)物結(jié)合固相載體用于體外免疫檢測抗原或抗體的存在。在檢測病原微生物方面，kalvatchev[23]最早利用膠體金標(biāo)記的抗立克次體的多克隆抗體、單克隆抗體及igy來檢測標(biāo)本中的斑點熱群立克次體。zhou等[24]用膠體金標(biāo)記的豬繁衍與呼吸綜合癥病毒(prrsv)蛋白m及蛋白n單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上與二抗構(gòu)造夾心構(gòu)造檢測prrsv，檢出限可達(dá)7.8×103～1.6×104tcid50/ml。在檢測疾病相關(guān)蛋白方面，guo等[25]綜合低密度蛋白陣列、銀離子加強及雙單克隆抗體夾心法對心肌鈣蛋白i〔ctni〕進(jìn)行免疫檢測，靈敏度接近elisa，并節(jié)省大量時間。cho等[26]優(yōu)化固相載體及抗體孵化條件，用5nm膠體金顆粒標(biāo)記ctni單克隆抗體，銀離子加強檢測效果后比慣例快速檢測方法靈敏度提升近51倍。hu等[27]研究了在單納米顆粒形式下，用電感耦合等離子質(zhì)譜技術(shù)〔icpms〕檢測微孔板中15nm金顆粒標(biāo)記的甲胎蛋白抗體，檢出限達(dá)0.016μg/l。檢測寄生蟲方面也有報道[28]，激素類及血、尿藥物濃度等免疫檢測項目國內(nèi)外有商品化膠體金試紙條或試劑盒供給。3.2免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在環(huán)境檢測中的應(yīng)用由于免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)不斷地發(fā)展改良及其各種技術(shù)優(yōu)勢，已不僅僅局限應(yīng)用在單一領(lǐng)域。近年來在環(huán)境學(xué)科中的報道逐步增加，重要具體表現(xiàn)出在兩方面：一是利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)結(jié)合電鏡等檢測技術(shù)，通過觀察所測物質(zhì)的微觀構(gòu)造形態(tài)、空間位點變化來揭示其作用機理或者檢測宏觀性能指標(biāo)；二是利用免疫層析技術(shù)制備免疫膠體金試紙條或試劑盒，現(xiàn)場快速檢測進(jìn)行定性、定量分析。殘留超標(biāo)不僅污染農(nóng)產(chǎn)品和生態(tài)環(huán)境，還將危及人體健康和生命安全。儀器分析農(nóng)藥殘留樣品前處理時間較長，并不適于現(xiàn)場檢測。利用膠體金制備的免疫層析試紙條或試劑盒以其快速、簡便、靈敏的特點已被逐步應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測。甲胺磷是一種高效有機磷農(nóng)藥和殺蟲劑，微量殘留也會給環(huán)境造成危害，shi等[29]制備的甲胺磷免疫層析金標(biāo)試紙條對甲胺磷有高度的檢測特異性，可檢測到1.0μg/ml的甲胺磷。羿國香等[30]利用小分子蛋白復(fù)合物及非均等競爭原理制備氯嘧磺隆膠體金免疫檢測試紙條，用于土壤中氯嘧磺隆除草劑殘留的現(xiàn)場快速檢測，檢出限可達(dá)100μg/l，有助于避免其殘留毒性使下茬敏感受害。wang等[31]將殺蟲劑西維因半抗原偶聯(lián)在klh上作為免疫原，制備直流式及側(cè)流式兩種免疫金標(biāo)檢測試紙條，在5min內(nèi)檢出限分別可達(dá)50及100μg/l。guo等[32]利用同時針對呋喃丹和三唑磷兩種物質(zhì)的雙特異性抗體，另外結(jié)合分別針對二者的單克隆抗體，制備了兩種類型的免疫金標(biāo)試紙條來同時檢測這兩種農(nóng)藥殘留物。結(jié)果顯示,兩種試紙條均有效，但第二種抗體制備的試紙條更為敏感，在水樣中對二者的檢出限分別可達(dá)32及4μg/l。kaur等[33]以牛血清蛋白為載體蛋白，經(jīng)其賴氨酸殘基聯(lián)合除草劑阿特拉津半抗原，并經(jīng)其半胱氨酸殘基聯(lián)合膠體金顆粒，利用這種半抗原蛋白金顆粒復(fù)合物構(gòu)造側(cè)流式免疫檢測試紙條可在5min內(nèi)檢測水樣中1.0μg/l級阿特拉津含量。水體環(huán)境質(zhì)量對人類生活有直接影響，操作簡便、檢測快速、靈敏度高及選擇性好的水質(zhì)檢測方法能極大提升檢測效率。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)便被逐步應(yīng)用在水質(zhì)檢測及有關(guān)污染物分析研究中。吲哚美辛是一種非甾體抗炎藥，長期將未代謝完的非甾體抗炎藥排入水體，將會對水生生物造成危害[34]。li等[35]制備的快速免疫層析金標(biāo)試紙條，在10min內(nèi)檢測水樣中吲哚美辛的檢出限達(dá)0.1ng/ml，且在室溫下可存放8星期，適應(yīng)于現(xiàn)場快速檢測。小球隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲會引起人類腸胃疾病，是水質(zhì)檢測的指標(biāo)。rule等[36]結(jié)合外表加強共振拉曼散射〔serrs〕與免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)檢測這兩種病原體，證明了兩種技術(shù)的結(jié)合進(jìn)行高靈敏度、多種物質(zhì)同時檢測的可行性。短裸甲藻毒素是一種與赤潮有關(guān)的神經(jīng)毒素。zhou等[37]利用膠體金標(biāo)記的單克隆短裸甲藻毒素抗體制備了快速免疫層析試紙條，在10min的現(xiàn)場檢測時間內(nèi)檢出限為20μg/l。檢測樣中短裸甲藻毒素濃度在10～4000μg/l的范圍內(nèi)，試紙條檢測區(qū)的顏色強度與短裸甲藻毒素濃度呈正相關(guān)。微囊藻毒素是由藍(lán)藻產(chǎn)生的一種七肽單環(huán)肝毒素，它通過食物鏈傳遞嚴(yán)重威脅人類健康。young等[38]將選取的一株藍(lán)藻用一系列梯度乙醇脫水處理后，用低溫切片機切片進(jìn)行金標(biāo)記后，利用透射電鏡檢測微囊藻毒素在藍(lán)藻細(xì)胞中的位點以獲取微囊藻毒素怎樣產(chǎn)生、作用機理及衰亡等信息。結(jié)果顯示微囊藻毒素分布在類囊體、細(xì)胞原生質(zhì)、多磷體邊沿及羧化體中，在細(xì)胞壁及多磷體內(nèi)部分布較少。gerbersdorf[39]利用純化的高特異性微囊藻毒素抗體對微囊藻毒素進(jìn)行免疫膠體金標(biāo)記定位，檢測在不同光強度、光密度、光譜范圍下生長的藍(lán)藻細(xì)胞中微囊藻毒素的密度，發(fā)現(xiàn)光合有效輻射對微囊藻毒素的生物合成影響很大。木質(zhì)素是農(nóng)作物秸桿及城市生活垃圾中一種常見的、難降解的物質(zhì)，處理欠妥會造成極大的資源浪費和環(huán)境污染。因而，木質(zhì)素的研究逐步引起人們的關(guān)注[40]。he等[41]利用紫外光顯微鏡、透射電鏡結(jié)合免疫膠體金標(biāo)記，檢測了杜仲次生木質(zhì)部分化經(jīng)過中木質(zhì)素等組分在細(xì)胞壁分布的動態(tài)變化，結(jié)果顯示隨著細(xì)胞次生壁的構(gòu)成與木質(zhì)化，木質(zhì)素的分布逐步擴展，其沉積出現(xiàn)不均勻的塊狀或片狀沉積形式。joseleau等[42]生物合成純化的紫丁香基脫氫多聚體以制備紫丁香基木質(zhì)素多克隆抗體，并利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)對植物細(xì)胞中紫丁香基木質(zhì)素進(jìn)行定位檢測，發(fā)現(xiàn)其在s1層中分布較少，而在次生細(xì)胞壁構(gòu)成后期分布較多。該小組還分別標(biāo)記木質(zhì)素抗體和紫丁香基木質(zhì)素抗體來檢測應(yīng)拉木中木質(zhì)素含量和構(gòu)造構(gòu)成的關(guān)系，以為應(yīng)拉木凝膠層中木質(zhì)素含量較少，但紫丁香基木質(zhì)素構(gòu)造含量較高[43]。研究表示清楚，白腐真菌是降解木質(zhì)素一類芳香化合物能力最強的微生物[44]。白腐真菌通過本身分泌的酶液的共同作用可迅速、有效地降解木質(zhì)素[45]。因而木質(zhì)素降解酶成為研究熱門，期望由此可了解微生物降解木質(zhì)素的機制。daniel等[46]將電鏡技術(shù)與免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，檢測白腐菌降解木質(zhì)素經(jīng)過中分泌的關(guān)鍵酶液的空間分布及木質(zhì)素的形態(tài)變化情況，結(jié)果顯示酶分布與細(xì)胞壁構(gòu)造的形態(tài)改變有關(guān)，檢測發(fā)現(xiàn)胞外粘液為酶液進(jìn)入細(xì)胞壁降解區(qū)域起了主要作用。4展望隨著城市化進(jìn)程的加快，有機固體廢物數(shù)量急劇上升。堆肥化是符合可連續(xù)發(fā)展的有機固體廢物處理方法，具有強大的生命力。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)以其制備簡單、適用范圍廣、安全等優(yōu)勢趨于商業(yè)化應(yīng)用，在免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域有著普遍應(yīng)用，但該技術(shù)應(yīng)用于堆肥環(huán)境研究的報道較少，十分是應(yīng)用于堆肥環(huán)境檢測的研究。堆肥化是微生物降解有機固體廢物的經(jīng)過，加強堆肥經(jīng)過中微生物對有機固體廢物的酶解作用便成為堆肥快速腐熟的關(guān)鍵。而堆肥經(jīng)過中微生物所產(chǎn)生的生物酶蛋白的研究還不完善，結(jié)合經(jīng)濟可行性考慮，免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在堆肥檢測中的應(yīng)用能夠從下面幾個方面開展研究：〔1〕溫度、ph值等環(huán)境因素會影響酶促反應(yīng)的效果，利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)對不同環(huán)境因素下酶蛋白進(jìn)行定位、定量檢測確定酶蛋白在堆肥基質(zhì)中的最佳作用條件；〔2〕微生物降解有機固體廢物經(jīng)過中分泌的酶液并不是單一的，采用雙重或多重免疫膠體金標(biāo)記檢測不同酶蛋白在堆肥經(jīng)過中作用的區(qū)別與聯(lián)絡(luò)，進(jìn)而揭示其微觀作用機理，確定協(xié)同作用效果最佳的酶液組合；〔3〕有機固體廢物降解是由酶液及多種小分子物質(zhì)共同協(xié)作完成。利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在含有小分子物質(zhì)類別及數(shù)量不等的基質(zhì)環(huán)境下對酶蛋白進(jìn)行檢測，確定小分子物質(zhì)與酶液在堆肥經(jīng)過中的協(xié)同作用機理，有助于提升酶液降解有機固體廢物的效率；〔4〕有機固體廢物在降解經(jīng)過中會發(fā)生物理形態(tài)等變化，實時檢測不同基質(zhì)條件變化下酶蛋白的作用位點及數(shù)量，對堆肥經(jīng)過酶促降解作用的研究具有積極意義。隨著技術(shù)的日趨成熟，進(jìn)一步提升免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的定位檢測特異性及定量檢測精到準(zhǔn)確性，將使該技術(shù)在深切進(jìn)入認(rèn)識生物酶蛋白作用機制等堆肥檢測任務(wù)中發(fā)揮主要作用?！疽韵聻閰⒖嘉墨I(xiàn)】1zenggm,huangdl,huanggh,hutj,jiangxy,fengcl,chenyn,tangl,liuhl.bioresourcetechnology,2007,98(2):320～326２krgers,setfordsj,turnerapf.anal.chem.,1998,70(23):5047～5053３vials,pastorizasantosi,pérezjustej,lizmarzánlm.langmuir,2007,23(8):4606～4611４jainpk,leeks,elsayedih,eisayedma.j.phys.chem.b,2006,110(14):7238～7248５huangcc,chiangck,linzh,leekh,changht.anal.chem.,2008,80(5):1497～1504６slotｊｗ,geuzeｈｊ.j．cellbiol．,1981,90(2):533～536７dongningguang(董寧光),chenmingyong(陳明勇),peidong(裴東).chinesebulletinoflifesciences(生命科學(xué)),2008,20(5)：742～748８sunxp,luoyl.materialsletters,2005,59(2930):4048～4050９links,mohamedmb,elsayedma.phys.chem.b.,1999,103(16):3073～3077１０l(fā)inks,elsayedma.phys.chem.b.,1999,103(21):4212～4217１１faulkwp,talorgm.immunochem,1971,8(11):1081～1083１２holgatecs,jacksonp,cowenpn.j．histochemcytochem,1983,31(7):38～44１３galvezjj,gibersonrt,cardiffrd.j.histotechnol,2006,29(2):113～121１４konglingqing(孔令青),liyong(李勇),gaohong(高洪),yanyulin(嚴(yán)玉霖).progressinveterinarymedicine(動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展),2008,29(4)：100～102１５housy,chenhk,chenghc,huangcy.anal.chem.,2007,79(3):980～985１６tanakar,yuhit,nagatanin,endot,kermank,takamuray,tamiyae.anal．bioanal．chem．,2006,385(8):1414～1420１７ambrosia,castanedamt,killardaj,smythmr,aleqrets,merkocia.anal.chem.,2007,79(14):5232～5240１８namjm,thaxtoncs,mirkinca.science,2003,301(5641):1884～1886１９jiachunping(賈春平),zhaojianｌong(趙建龍).chinesebulletinoflifesciences(生命科學(xué)),2008,20(5)：749～751２０zhongxiaoqin(鐘曉琴),liumeiying(劉美英),huangyunyan(黃云艷),jiachunping(賈春平),jinqinghui(金慶輝),zhａｏjianlong(趙建龍),lifengmin(李鳳民).chin．med．biotechnol．(生物技術(shù)),2009,4(3)：200～206２１wuwwh,weaverll,pantén.journalofmolecularbiology,2007,374(4):910～916２２jiangl,yuzb,duwd,tangzm,jiangt,zhangcx,luzh.biosensorsandbioelectronics,2008,24(3):376～382２３kalvatchevz.actavirol.,1993,37(2):184～186２４zhoush,cuisj,chencm,zhangfc,lij,zhous,ohjs.journalofvirologicalmethods,2009,160(12):178～184２５guoh,zhangj,yangd,xiaop,hen.colloidsurfaceb,2005,40(34):195～198２６choih,seosm,paekeh,paeksh.j.chromatogr.b,2010,878(2):271～277２７hus,liur,zhangs,huangz,xingz,zhangx.j.am.soc.massspectrom.,2009,20(6):1096～1103２８joachimr,gundelh,irmelam.parasitolｒes,2004,92(6):518～519２９shic,zhaos,zhangk,hongg,zhuz.journalofenvironmentalsciences,2008,20(11):1392～1397３０yiguoxiang(羿國香),zhaojing(趙靜),ligang(李剛),hesuping(何素平),liuwei(劉威),dengaixing(鄧艾興),nantiegui(南鐵貴),lizhaohu(李召虎),hezongpei(何鐘佩),wangbaomin(王保民).chinesej.anal.chem.(分析化學(xué)),2006,34(12)：1679～1682３１wangs,zhangc,wangjp,zhangy.anal．chim．a(chǎn)cta,2005,546(2):161～166３２guoyr,liusy,guiwj,zhugn.anal．biochem．,2009,389(1):32～39３３kaurj,singhkv,boror,thampikr,rajem,varshneygc,su