X3-1-1-DNA重組技術(shù)的基本工具課件

1專題1基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具1專題1基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具1基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問(wèn)世7)PCR技術(shù)的發(fā)明基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體2角似鹿鼻似獅目似虎唇似牛爪似鷹髭似馬鱗似魚(yú)身似蛇角似鹿3設(shè)想一

能否培養(yǎng)出具有抗蟲(chóng)性狀的抗蟲(chóng)棉呢？設(shè)想一能否培養(yǎng)出具有抗蟲(chóng)4藍(lán)色玫瑰藍(lán)色玫瑰5能生產(chǎn)胰島素的大腸桿菌能生產(chǎn)胰島素的大腸桿菌6轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)基因鼠7能發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因豬能發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因豬89是指按照人們的意愿，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。

由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，又叫DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)。什么叫基因工程？生長(zhǎng)激素、胰島素9是指按照人們的意愿，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)910基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品（或基因產(chǎn)物）剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)實(shí)質(zhì)（原理）基因重組對(duì)基因工程概念的理解一種定向改造生物的新技術(shù)10基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人10第1節(jié)第1節(jié)11121.1DNA重組技術(shù)的基本工具121.1DNA重組技術(shù)的基本工具1213基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲(chóng)基因與載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)13基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云1314關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取。關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與載體DNA連接。關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因進(jìn)入棉細(xì)胞?；虻姆肿邮中g(shù)刀——限制性內(nèi)切酶。

基因的分子縫合針——DNA連接酶。

基因的分子運(yùn)輸車(chē)——載體。如何解決？抗蟲(chóng)棉培育14關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿基因的分子手術(shù)刀—14閱讀課本4-5頁(yè)“限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀”的相關(guān)內(nèi)容，填寫(xiě)下表自主學(xué)習(xí)一主要從原核生物中分離純化而來(lái)已經(jīng)分離出大約4000種1、識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列2、使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。形成兩種末端：黏性末端或平末端閱讀課本4-5頁(yè)“限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀”的相關(guān)內(nèi)容151’2’3’4’5’脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)1’2’3’4’5’脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)16G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯鍵3’端5’端3’端5’端磷酸二酯鍵G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,51718仔細(xì)觀察各限制酶識(shí)別的特定序列有何特點(diǎn)？限制酶的識(shí)別序列限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列18仔細(xì)觀察各限制酶識(shí)別的特定序列有何特點(diǎn)？限制酶的識(shí)別序18中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。EcoRI限制酶的作用中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能19

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。錯(cuò)位切黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割20SmaI只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。中軸線SmaI限制酶的作用在G與C之間切割SmaI只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。中軸線21平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中22限制酶作用特點(diǎn)1、限制酶識(shí)別特定的核苷酸序列——回文序列回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。2、限制酶斷開(kāi)磷酸二酯鍵限制酶作用特點(diǎn)1、限制酶識(shí)別特定的核苷酸序列——回文序列回文23你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？原核生物（主要是細(xì)菌）易受自然界外源DNA（噬菌體DNA）的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。尋根問(wèn)底你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？原核生物（主要24尋根問(wèn)底為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。尋根問(wèn)底為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，25261、要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。3、如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？

會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。2、要把目的基因插入運(yùn)載體的前提是什么必須用同一種限制酶來(lái)切割目的基因和運(yùn)載體。思考?261、要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？2627類型來(lái)源功能相同點(diǎn)差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體催化形成磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)閱讀課本第5頁(yè)“分子縫合針——DNA連接酶”的相關(guān)內(nèi)容，填寫(xiě)下表自主學(xué)習(xí)二27類型來(lái)源功能相同點(diǎn)差別E·coliDNA連接酶T4DNA2728基因工程的連接酶“DNA連接酶”將兩段DNA片段連接1．分類：根據(jù)酶的來(lái)源不同，可分為E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶兩類2．功能：恢復(fù)被限制酶切開(kāi)了的兩個(gè)核苷酸之間的

磷酸二酯鍵?！飪煞NDNA連接酶(E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶)的比較：①相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵②區(qū)別：E·coIiDNA連接酶來(lái)源于大腸桿菌，只能使黏性末端之間連接；

T4DNA連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端之間的效率較低。28基因工程的連接酶“DNA連接酶”將兩段DNA片段連接1．28把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來(lái)催化形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的作用把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接29兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來(lái)DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來(lái)DNA連接酶的縫合30DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低DNA連接酶的縫合作用DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可31AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用AATTGC32都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì) 不需要需要形成完整的重組D3334DNA連接酶的種類34DNA連接酶的種類34353535362個(gè)4個(gè)1、每連接兩個(gè)相同的黏性未端要連接幾個(gè)磷酸二酯鍵？

2、用限制酶切一個(gè)特定基因要切斷幾個(gè)磷酸二酯鍵？思考：362個(gè)4個(gè)思考：362.為什么限制酶和DNA連接酶在微生物中能夠分離到,而高等植物和動(dòng)物中沒(méi)有?

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制性核酸內(nèi)切酶就是細(xì)菌的防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，限制性核酸內(nèi)切酶會(huì)將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制性核酸內(nèi)切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而保護(hù)自身的作用。2.為什么限制酶和DNA連接酶在微生物中能夠分離到,而高等植37載體的作用載體的必要條件載體的種類閱讀課本第6頁(yè)“分子運(yùn)輸車(chē)——運(yùn)載體”的相關(guān)內(nèi)容，填寫(xiě)下表自主學(xué)習(xí)三1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行鑒定和選擇。4）必須是安全的，對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害。5）載體DNA分子應(yīng)大小適中，以便于提取和操作1）作為運(yùn)載工具，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中2）在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制①細(xì)菌的質(zhì)粒(由天然的改造而成)②病毒：λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒等。

載體的作用載體的必要條件載體的種類閱讀課本第6頁(yè)“分子運(yùn)輸車(chē)3839基因工程的載體目的基因指某些小型DNA分子能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)（每種限制酶切點(diǎn)最好只有一個(gè)）具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選條件39基因工程的載體目的基因指某些小型DNA分子能夠在宿主細(xì)3940常用的運(yùn)載體主要有兩類：

1）細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒

2）噬菌體或某些動(dòng)植物病毒40常用的運(yùn)載體主要有兩類：40有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點(diǎn)能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制質(zhì)?！懵兜摹⒔Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。最常用運(yùn)載體——質(zhì)粒實(shí)際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點(diǎn)能復(fù)制4142

質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、雙鏈環(huán)狀DNA分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中核以外的DNA分子。

質(zhì)粒Plasmids

質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒(méi)有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。42質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的裸露的、4243大腸桿菌的質(zhì)粒

最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素、氨芐青霉素的標(biāo)記基因。復(fù)制的形式：1、獨(dú)立自我復(fù)制2、整合到染色體上，隨染色體DNA同步復(fù)制。質(zhì)粒（人工改造的質(zhì)粒）是基因工程最常用的運(yùn)載體。43大腸桿菌的質(zhì)粒最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的4344ACGTGCAG標(biāo)記基因外源基因ACGTGCAT44ACGTGCAG標(biāo)記基因外源基因ACGTG4445抗四環(huán)素基因四環(huán)素生長(zhǎng)被抑制正常生活四環(huán)素重組DNA45抗四環(huán)素基因四環(huán)素生長(zhǎng)被抑制正常生活四環(huán)素重組DNA4546

例、已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因，現(xiàn)探討某細(xì)菌的質(zhì)粒中有無(wú)標(biāo)記基因或標(biāo)記基因是什么？請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素46例、已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素4647對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因只含有抗四環(huán)素基因只含有抗氨芐青霉素基因既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因47對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組4748重組DNA分子的模擬操作注意：這兩條DNA分子的堿基對(duì)不是隨意亂寫(xiě)的。首先，每個(gè)DNA分子上的兩條鏈上的堿基要互補(bǔ)配對(duì)；第二，每個(gè)DNA分子中每條鏈都存在一個(gè)G-A-A-T-T-C的堿基序列，也就是說(shuō)是EcoRI限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，并存在G-A的切割位點(diǎn)。48重組DNA分子的模擬操作注意：這兩條DNA分子的堿基對(duì)不4849天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨(dú)立于細(xì)菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。

是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：49天然的DNA分子可以直接用做基因工程提示：基因工程中作為49501）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。501）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目5051DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。51DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？迄今為5152思考：一、質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體，它的主要特點(diǎn)是（）1．能自我復(fù)制2、不能自我復(fù)制3、結(jié)構(gòu)很小4、成分是蛋白質(zhì)5、是環(huán)狀DNA分子6、是環(huán)狀RNA分子7、鏈狀DNA分子8、能友好地借居在宿主細(xì)胞中二、質(zhì)粒上會(huì)存在某些標(biāo)記基因，這些標(biāo)記基因有什么用途？1、3、5、8便于篩選、識(shí)別三、要想將某個(gè)特定基因與質(zhì)粒相連，需要用幾種限制性內(nèi)切酶和幾種DNA連接酶處理？為什么？一種52思考：1、3、5、8便于篩選、識(shí)別三、要想將某個(gè)特定5253例1、以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，試分析：①GC…②AATTC…③…GC④…CTTAACG…G……CG…G

(1)其中①和

是由一種限制酶切割形成的

末端，兩者要重組成一個(gè)DNA分子，所用DNA連接酶通常是

。(2)

和

是由另一種限制酶切割形成的

末端，兩者要形成重組DNA片段，所用的連接酶通常是

。③平T4DNA連接酶②④黏性E·coliDNA連接酶53例1、以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，③平T45354例2、某科學(xué)家從細(xì)菌中分離出耐高溫淀粉酶（Amy）基因a,通過(guò)基因工程的方法，將a轉(zhuǎn)到馬鈴薯植株中，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Amy在成熟塊莖細(xì)胞中存在。這一過(guò)程涉及A.目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，可隨著馬鈴薯的DNA分子的復(fù)制而復(fù)制，傳給子代細(xì)胞B.基因a導(dǎo)入成功后，將抑制細(xì)胞原有的新陳代謝，開(kāi)辟新的代謝途徑C.細(xì)菌的DNA分子較小，可直接作為目的基因，導(dǎo)入受體中不需要整合到馬鈴薯的DNA分子中D.目的基因來(lái)自細(xì)菌，可以不需要運(yùn)載體直接導(dǎo)入受體細(xì)胞A54例2、某科學(xué)家從細(xì)菌中分離出耐高溫淀粉酶（Amy）基54例：限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有一個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)。（1）請(qǐng)畫(huà)出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。（2）請(qǐng)畫(huà)出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接？為什么？

可以連接。因?yàn)橛缮鲜鰞煞N不同限制酶切割后形成相同的黏性末端（或是可以互補(bǔ)的）小試身手例：限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制55隨堂練習(xí)：1、關(guān)于限制酶的說(shuō)法中，正確的是（）A、限制酶是一種酶，只識(shí)別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是G—A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C隨堂練習(xí)：1、關(guān)于限制酶的說(shuō)法中，正確的是（）答案：56572、以下說(shuō)法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體

C、載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)C572、以下說(shuō)法正確的是（）C57583、下列不是基因載體具備的條件的是（）

A、能自我復(fù)制

B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD583、下列不是基因載體具備的條件的是（）D58594、有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái)

B、限制性核酸內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A594、有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）A59605、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D605、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）D60616、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因工程操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C616、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因工61A7、在將胰島素的基因與質(zhì)粒形成重組DNA分子的過(guò)程中，下列哪組是所需要的①同一種限制酶切割兩者；②不需同一種限制酶切割兩者；③加入適量的DNA連接酶；④不需加DNA連接酶A．①③ B．①④ C．②④ D．②③A7、在將胰島素的基因與質(zhì)粒形成重組DNA分子的過(guò)程中，下列628、（多選）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是A、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種B、重組DNA的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體答案：BD8、（多選）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是答案：BD639、下列四條DNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是

A．①②B．②③C．③④D．②④答案：D9、下列四條DNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是答案：D6410、下列黏性末端屬于同種內(nèi)切酶切割而成的是（）A、①②B、①③C、①④D、②③TCGAGCTTAAAGGTTCCAAGCTTCAGAATTCG③①②④11、下列哪一種酶是基因工程的工具酶A、DNA連接酶B、DNA酶C、RNA酶D、運(yùn)載體AA10、下列黏性末端屬于同種內(nèi)切酶切割而成的TC6512、下列不適合用于基因工程的運(yùn)載體是（）A、質(zhì)粒B、噬菌體C、細(xì)菌D、病毒C13、下列說(shuō)法正確的是：（）A、限制酶的切口一定是GAATTC堿基序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、重組技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶、運(yùn)載體D、利用運(yùn)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制的過(guò)程可稱為“克隆”D12、下列不適合用于基因工程的運(yùn)載體C13、下列說(shuō)法正確的是6614、在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因

的DNA片段，需使用（）同種限制酶B.兩種限制酶同種連接酶D.兩種連接酶15、基因工程常用的受體細(xì)胞有（）

(1)大腸桿菌（2）枯草桿菌（3）支原體（4）動(dòng)植物細(xì)胞A.（3）（4）B.（1）（2）（4）C.（2）（3）（4）D.（1）（2）（3）14、在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片6716、如圖為大腸桿菌及質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)模式圖，據(jù)圖回答下列問(wèn)題。16、如圖為大腸桿菌及質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)模式圖，據(jù)圖回答下68X3-1-1__DNA重組技術(shù)的基本工具課件69(3)氨芐青霉素抗性基因在質(zhì)粒DNA上稱為_(kāi)___________________，其作用是_________________________。(4)下列常在基因工程中用作載體的是(

)A．蘇云金芽孢桿菌抗蟲(chóng)基因B．土壤農(nóng)桿菌中的RNA分子C．大腸桿菌的質(zhì)粒D．動(dòng)物細(xì)胞的染色體(3)氨芐青霉素抗性基因在質(zhì)粒DNA上稱為_(kāi)________70【思路點(diǎn)撥】本題通過(guò)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的模式圖考查質(zhì)粒的功能和特點(diǎn)，分析如下：【思路點(diǎn)撥】本題通過(guò)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的模式圖考查質(zhì)粒的功能和特點(diǎn)，71X3-1-1__DNA重組技術(shù)的基本工具課件72

17、(2011年北大附中高二檢測(cè))下列關(guān)于DNA連接酶的敘述正確的是(

)①催化相同黏性末端的DNA片段之間的連接②催化不同黏性末端的DNA片段之間的連接③催化兩個(gè)黏性末端互補(bǔ)堿基間氫鍵的形成④催化DNA分子兩條鏈的脫氧核糖與磷酸之間磷酸二酯鍵的形成A．①③

B．②④C．②③D．①④

【嘗試解答】

D17、(2011年北大附中高二檢測(cè))下列關(guān)于DNA連接73

18

、(2011年雅禮中學(xué)高二檢測(cè))基因工程中，須使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是－G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是－↓GATC－。根據(jù)圖示判斷下列操作正確的是(

)18、(2011年雅禮中學(xué)高二檢測(cè))基因工程中，須74A．目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割B．目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅰ切割C．質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割D．質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割【嘗試解答】

DA．目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割75【解析】

首先把目的基因切下來(lái)要用到限制酶Ⅱ；如果再用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒，則2個(gè)標(biāo)記基因都被切開(kāi)，標(biāo)記基因?qū)⑹プ饔?。而用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒可保留一個(gè)標(biāo)記基因，而產(chǎn)生的黏性末端和限制酶Ⅱ切割下來(lái)的目的基因可以互補(bǔ)配對(duì)?！净?dòng)探究】上題中限制酶Ⅰ切開(kāi)化學(xué)鍵后產(chǎn)生哪種類型的末端？【解析】首先把目的基因切下來(lái)要用到限制酶Ⅱ；如果再用限制76【提示】黏性末端?！疽渍`警示】

(1)限制性核酸內(nèi)切酶是一類酶而不是一種酶。(2)限制性核酸內(nèi)切酶作用的化學(xué)鍵為磷酸二酯鍵，而不是氫鍵。(3)不同種類的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別與切割的位點(diǎn)不同，這與酶的專一性是一致的?！咎崾尽筐ば阅┒?。77總結(jié)規(guī)律限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。

思考與探究1．限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開(kāi)嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段：(1)…CTGCA

(2)…AC

(3)GC…

…G

…TG

CG…（4）…G

(5)

G…

(6)…GC

…CTTAA

ACGTC…

…CG(7)GT…

(8)AATTC…

CA…

G…你是否能將同種限制酶切割后產(chǎn)生的末端連接起來(lái)？總結(jié)規(guī)律限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)78比較有關(guān)的DNA酶（1）DNA水解酶：能夠?qū)NA水解成四種脫氧核苷酸，徹底水解成膦酸、脫氧核糖和含氮堿基（2）DNA解旋酶：能夠?qū)NA或DNA的某一段解成兩條長(zhǎng)鏈，作用的部位是堿基和堿基之間的氫鍵。注意：使DNA解成兩條長(zhǎng)鏈的方法除用解旋酶以外，在適當(dāng)?shù)母邷兀ㄈ?4℃）、重金屬鹽的作用下，也可使DNA解旋。（3）DNA聚合酶：能將單個(gè)的核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接成DNA長(zhǎng)鏈。（4）DNA連接酶：是通過(guò)磷酸二酯鍵連接雙鏈DNA的缺口。比較有關(guān)的DNA酶79【探規(guī)尋律】幾種酶的作用部位限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶作用于①部位,DNA解旋酶作用于②部位。【探規(guī)尋律】幾種酶的作用部位80演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！8182專題1基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具1專題1基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具82基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問(wèn)世7)PCR技術(shù)的發(fā)明基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體83角似鹿鼻似獅目似虎唇似牛爪似鷹髭似馬鱗似魚(yú)身似蛇角似鹿84設(shè)想一

能否培養(yǎng)出具有抗蟲(chóng)性狀的抗蟲(chóng)棉呢？設(shè)想一能否培養(yǎng)出具有抗蟲(chóng)85藍(lán)色玫瑰藍(lán)色玫瑰86能生產(chǎn)胰島素的大腸桿菌能生產(chǎn)胰島素的大腸桿菌87轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)基因鼠88能發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因豬能發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因豬8990是指按照人們的意愿，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。

由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，又叫DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)。什么叫基因工程？生長(zhǎng)激素、胰島素9是指按照人們的意愿，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)9091基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品（或基因產(chǎn)物）剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)實(shí)質(zhì)（原理）基因重組對(duì)基因工程概念的理解一種定向改造生物的新技術(shù)10基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人91第1節(jié)第1節(jié)92931.1DNA重組技術(shù)的基本工具121.1DNA重組技術(shù)的基本工具9394基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲(chóng)基因與載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)13基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云9495關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取。關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與載體DNA連接。關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因進(jìn)入棉細(xì)胞?；虻姆肿邮中g(shù)刀——限制性內(nèi)切酶。

基因的分子縫合針——DNA連接酶。

基因的分子運(yùn)輸車(chē)——載體。如何解決？抗蟲(chóng)棉培育14關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿基因的分子手術(shù)刀—95閱讀課本4-5頁(yè)“限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀”的相關(guān)內(nèi)容，填寫(xiě)下表自主學(xué)習(xí)一主要從原核生物中分離純化而來(lái)已經(jīng)分離出大約4000種1、識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列2、使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。形成兩種末端：黏性末端或平末端閱讀課本4-5頁(yè)“限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀”的相關(guān)內(nèi)容961’2’3’4’5’脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)1’2’3’4’5’脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)97G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯鍵3’端5’端3’端5’端磷酸二酯鍵G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,59899仔細(xì)觀察各限制酶識(shí)別的特定序列有何特點(diǎn)？限制酶的識(shí)別序列限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列18仔細(xì)觀察各限制酶識(shí)別的特定序列有何特點(diǎn)？限制酶的識(shí)別序99中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。EcoRI限制酶的作用中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能100

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。錯(cuò)位切黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割101SmaI只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。中軸線SmaI限制酶的作用在G與C之間切割SmaI只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。中軸線102平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中103限制酶作用特點(diǎn)1、限制酶識(shí)別特定的核苷酸序列——回文序列回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。2、限制酶斷開(kāi)磷酸二酯鍵限制酶作用特點(diǎn)1、限制酶識(shí)別特定的核苷酸序列——回文序列回文104你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？原核生物（主要是細(xì)菌）易受自然界外源DNA（噬菌體DNA）的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。尋根問(wèn)底你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？原核生物（主要105尋根問(wèn)底為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。尋根問(wèn)底為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，1061071、要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。3、如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？

會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。2、要把目的基因插入運(yùn)載體的前提是什么必須用同一種限制酶來(lái)切割目的基因和運(yùn)載體。思考?261、要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？107108類型來(lái)源功能相同點(diǎn)差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體催化形成磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)閱讀課本第5頁(yè)“分子縫合針——DNA連接酶”的相關(guān)內(nèi)容，填寫(xiě)下表自主學(xué)習(xí)二27類型來(lái)源功能相同點(diǎn)差別E·coliDNA連接酶T4DNA108109基因工程的連接酶“DNA連接酶”將兩段DNA片段連接1．分類：根據(jù)酶的來(lái)源不同，可分為E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶兩類2．功能：恢復(fù)被限制酶切開(kāi)了的兩個(gè)核苷酸之間的

磷酸二酯鍵?！飪煞NDNA連接酶(E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶)的比較：①相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵②區(qū)別：E·coIiDNA連接酶來(lái)源于大腸桿菌，只能使黏性末端之間連接；

T4DNA連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端之間的效率較低。28基因工程的連接酶“DNA連接酶”將兩段DNA片段連接1．109把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來(lái)催化形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的作用把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接110兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來(lái)DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來(lái)DNA連接酶的縫合111DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低DNA連接酶的縫合作用DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可112AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用AATTGC113都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì) 不需要需要形成完整的重組D114115DNA連接酶的種類34DNA連接酶的種類115116351161172個(gè)4個(gè)1、每連接兩個(gè)相同的黏性未端要連接幾個(gè)磷酸二酯鍵？

2、用限制酶切一個(gè)特定基因要切斷幾個(gè)磷酸二酯鍵？思考：362個(gè)4個(gè)思考：1172.為什么限制酶和DNA連接酶在微生物中能夠分離到,而高等植物和動(dòng)物中沒(méi)有?

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制性核酸內(nèi)切酶就是細(xì)菌的防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，限制性核酸內(nèi)切酶會(huì)將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制性核酸內(nèi)切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而保護(hù)自身的作用。2.為什么限制酶和DNA連接酶在微生物中能夠分離到,而高等植118載體的作用載體的必要條件載體的種類閱讀課本第6頁(yè)“分子運(yùn)輸車(chē)——運(yùn)載體”的相關(guān)內(nèi)容，填寫(xiě)下表自主學(xué)習(xí)三1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行鑒定和選擇。4）必須是安全的，對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害。5）載體DNA分子應(yīng)大小適中，以便于提取和操作1）作為運(yùn)載工具，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中2）在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制①細(xì)菌的質(zhì)粒(由天然的改造而成)②病毒：λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒等。

載體的作用載體的必要條件載體的種類閱讀課本第6頁(yè)“分子運(yùn)輸車(chē)119120基因工程的載體目的基因指某些小型DNA分子能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)（每種限制酶切點(diǎn)最好只有一個(gè)）具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選條件39基因工程的載體目的基因指某些小型DNA分子能夠在宿主細(xì)120121常用的運(yùn)載體主要有兩類：

1）細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒

2）噬菌體或某些動(dòng)植物病毒40常用的運(yùn)載體主要有兩類：121有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點(diǎn)能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制質(zhì)粒——裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。最常用運(yùn)載體——質(zhì)粒實(shí)際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點(diǎn)能復(fù)制122123

質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、雙鏈環(huán)狀DNA分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中核以外的DNA分子。

質(zhì)粒Plasmids

質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒(méi)有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。42質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的裸露的、123124大腸桿菌的質(zhì)粒

最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素、氨芐青霉素的標(biāo)記基因。復(fù)制的形式：1、獨(dú)立自我復(fù)制2、整合到染色體上，隨染色體DNA同步復(fù)制。質(zhì)粒（人工改造的質(zhì)粒）是基因工程最常用的運(yùn)載體。43大腸桿菌的質(zhì)粒最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的124125ACGTGCAG標(biāo)記基因外源基因ACGTGCAT44ACGTGCAG標(biāo)記基因外源基因ACGTG125126抗四環(huán)素基因四環(huán)素生長(zhǎng)被抑制正常生活四環(huán)素重組DNA45抗四環(huán)素基因四環(huán)素生長(zhǎng)被抑制正常生活四環(huán)素重組DNA126127

例、已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因，現(xiàn)探討某細(xì)菌的質(zhì)粒中有無(wú)標(biāo)記基因或標(biāo)記基因是什么？請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素46例、已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素127128對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因只含有抗四環(huán)素基因只含有抗氨芐青霉素基因既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因47對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組128129重組DNA分子的模擬操作注意：這兩條DNA分子的堿基對(duì)不是隨意亂寫(xiě)的。首先，每個(gè)DNA分子上的兩條鏈上的堿基要互補(bǔ)配對(duì)；第二，每個(gè)DNA分子中每條鏈都存在一個(gè)G-A-A-T-T-C的堿基序列，也就是說(shuō)是EcoRI限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，并存在G-A的切割位點(diǎn)。48重組DNA分子的模擬操作注意：這兩條DNA分子的堿基對(duì)不129130天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨(dú)立于細(xì)菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。

是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：49天然的DNA分子可以直接用做基因工程提示：基因工程中作為1301311）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。501）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目131132DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。51DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？迄今為132133思考：一、質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體，它的主要特點(diǎn)是（）1．能自我復(fù)制2、不能自我復(fù)制3、結(jié)構(gòu)很小4、成分是蛋白質(zhì)5、是環(huán)狀DNA分子6、是環(huán)狀RNA分子7、鏈狀DNA分子8、能友好地借居在宿主細(xì)胞中二、質(zhì)粒上會(huì)存在某些標(biāo)記基因，這些標(biāo)記基因有什么用途？1、3、5、8便于篩選、識(shí)別三、要想將某個(gè)特定基因與質(zhì)粒相連，需要用幾種限制性內(nèi)切酶和幾種DNA連接酶處理？為什么？一種52思考：1、3、5、8便于篩選、識(shí)別三、要想將某個(gè)特定133134例1、以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，試分析：①GC…②AATTC…③…GC④…CTTAACG…G……CG…G

(1)其中①和

是由一種限制酶切割形成的

末端，兩者要重組成一個(gè)DNA分子，所用DNA連接酶通常是

。(2)

和

是由另一種限制酶切割形成的

末端，兩者要形成重組DNA片段，所用的連接酶通常是

。③平T4DNA連接酶②④黏性E·coliDNA連接酶53例1、以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，③平T4134135例2、某科學(xué)家從細(xì)菌中分離出耐高溫淀粉酶（Amy）基因a,通過(guò)基因工程的方法，將a轉(zhuǎn)到馬鈴薯植株中，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Amy在成熟塊莖細(xì)胞中存在。這一過(guò)程涉及A.目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，可隨著馬鈴薯的DNA分子的復(fù)制而復(fù)制，傳給子代細(xì)胞B.基因a導(dǎo)入成功后，將抑制細(xì)胞原有的新陳代謝，開(kāi)辟新的代謝途徑C.細(xì)菌的DNA分子較小，可直接作為目的基因，導(dǎo)入受體中不需要整合到馬鈴薯的DNA分子中D.目的基因來(lái)自細(xì)菌，可以不需要運(yùn)載體直接導(dǎo)入受體細(xì)胞A54例2、某科學(xué)家從細(xì)菌中分離出耐高溫淀粉酶（Amy）基135例：限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有一個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)。（1）請(qǐng)畫(huà)出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。（2）請(qǐng)畫(huà)出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接？為什么？

可以連接。因?yàn)橛缮鲜鰞煞N不同限制酶切割后形成相同的黏性末端（或是可以互補(bǔ)的）小試身手例：限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制136隨堂練習(xí)：1、關(guān)于限制酶的說(shuō)法中，正確的是（）A、限制酶是一種酶，只識(shí)別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是G—A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C隨堂練習(xí)：1、關(guān)于限制酶的說(shuō)法中，正確的是（）答案：1371382、以下說(shuō)法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體

C、載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)C572、以下說(shuō)法正確的是（）C1381393、下列不是基因載體具備的條件的是（）

A、能自我復(fù)制

B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD583、下列不是基因載體具備的條件的是（）D1391404、有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái)

B、限制性核酸內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A594、有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）A1401415、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D605、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）D1411426、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因工程操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C616、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因工142A7、在將胰島素的基因與質(zhì)粒形成重組DNA分子的過(guò)程中，下列哪組是所需要的①同一種限制酶切割兩者；②不需同一種限制酶切割兩者；③加入適量的DNA連接酶；④不需加DNA連接酶A．①③ B．①④ C．②④ D．②③A7、在將胰島素的基因與質(zhì)粒形成重組DNA分子的過(guò)程中，下列1438、（多選）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是A、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種B、重組DNA的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體答案：BD8、（多選）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是答案：BD1449、下列四條DNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是

A．①②B．②③C．③④D．②④答案：D9、下列四條DNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是答案：D14510、下列黏性末端屬于同種內(nèi)切酶切割而成的是（）A、①②B、①③C、①④D、②③TCGAGCTTAAAGGTTCCAAGCTTCAGAATTCG③①②④11、下列哪一種酶是基因工程的工具酶A、DNA連接酶B、DNA酶C、RNA酶D、運(yùn)載體AA10、下列黏性末端屬于同種內(nèi)切酶切割而成的TC14612、下列不適合用于基因工程的運(yùn)載體是（）A、質(zhì)粒B、噬菌體C、細(xì)菌D、病毒C13、下列說(shuō)法正確的是：（