線粒體復合體Ⅰ活性檢測試劑盒說明書-微量法UPLC-MS-4580

電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網址：本產品僅供科學研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！-上海液質檢測技術有限公司第第頁線粒體復合體Ⅰ活性檢測試劑盒說明書貨號：UPLC-MS-4580規(guī)格：100T/96S

微量法產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系工作人員。試劑名稱規(guī)格保存條件提取液液體75mL×2瓶4℃保存試劑一液體20mL×1瓶4℃保存試劑二粉劑×1支4℃保存試劑三粉劑×1支-20℃保存試劑四粉劑×1瓶-20℃保存溶液的配制：1、試劑二：臨用前加入1mL丙酮；2、試劑三：溶于1mL丙酮，可分裝后-20℃保存。臨用前再用丙酮100倍稀釋后使用，現用現配；3、試劑四：臨用前加入2mL蒸餾水，現配現用；4、工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三1:1混合，現配現用。產品說明：復合體Ⅰ（EC）H-CoQH脫氫酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細NADHCoQO2還原O2-而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。復合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD+，在340nm下測定NADH的氧化速率計算出該酶活性的大小。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV版）、研缽/勻漿器、丙酮、冰和蒸餾水。操作步驟：一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）0.1g5001.0mL提取液，用勻漿器或研缽于冰上勻漿。4℃600g10min。將上清液移至另一離心管中，411000g15min。上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅰ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。400μL（20%51015次Ⅰ活性測定，并且用于蛋白含量測定。二、測定步驟紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。試劑一37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）預熱15min。操作表：在微量石英比色皿/96孔板（UV版）中分別加入試劑名稱（μL）測定管樣本10試劑一154工作液20試劑四16將上述試劑分別加入比色皿/9610s的吸光值37℃（哺乳動物或25℃（其他物種環(huán)境中準確反應22min時的吸光度2三、復合體Ⅰ活力單位的計算以微量石英比色皿計算：mg1nmolNADH定義為一個酶活力單位。復合體Ⅰ活力（U/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷TV反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V0.01mLT2minCprg/mL1091mol=109nmol。以96孔板計算：將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。注意事項：1-2（1.5ΔA0.4，需將樣本稀釋適當倍數（計算公式中乘以相應稀釋倍數）；ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高靈敏度。樣本蛋白濃度需自行測定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（1mg/mL，所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。100管反應。附：使用樣本重量計算公式：（100T/48S）A、上清中復合體I活力的計算：單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活力單位。復合體I活性（U/g質量）=[ΔA1×V反總÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1608×ΔA1÷WΔA1：上清測定值；V反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V1mL0.01mL；T樣本重量，g；109：單位換算系數，1mol=109nmol。B、沉淀中復合體I活力的計算:單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活力單位。I活性（U/g質量）=[ΔA2×V反總÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V樣)）÷T=643×ΔA2÷WΔA2：沉淀測定值；V反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：沉淀重懸體積，0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應時間，2min；W：樣本重量，g；109：單位換算系數，1mo