工具酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程的誕生課件

三文魚原是西餐和日本料理的主要原料，不僅味道鮮美，而且富含有益心血管健康的奧米伽-3脂肪酸。三文魚種類不少，在國內(nèi)市場上最常見的是大西洋鮭，野生的大西洋鮭因?yàn)檫^度捕撈，已瀕臨滅絕，市場上賣的大西洋鮭99％以上是人工養(yǎng)殖的。

大西洋鮭的生長速度緩慢，第一年體重只增加20～30克，一般要養(yǎng)三年才能上市。因此可以給大西洋鮭轉(zhuǎn)入體型最大的三文魚——大鱗大麻哈魚的生長激素基因。

轉(zhuǎn)基因魚

三文魚原是西餐和日本料理的主要原料，不僅味道1剪切拼接導(dǎo)入表達(dá)（三）將重組DNA分子導(dǎo)入（四）目的基因的檢測和表達(dá)轉(zhuǎn)基因魚的構(gòu)建（一）獲得大麻哈魚生長激素基因

目的基因（二）形成大西洋鮭受精卵受體細(xì)胞魚類因其產(chǎn)卵量大且體外受精而成為研究轉(zhuǎn)基因動物的最佳入選動物。（外源基因）運(yùn)載體DNA+目的基因重組DNA分子剪切拼接導(dǎo)入表達(dá)（三）將重組DNA分子導(dǎo)入（四）目的基因的檢2把生物的遺傳物質(zhì)DNA分離出來，在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行剪切、拼接，對生物的基因進(jìn)行改造和重組，然后將重組的DNA（基因）導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞內(nèi)，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需的基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)、多肽、酶等）。基因工程的概念其核心是構(gòu)建重組DNA分子廣義：把一種生物的基因轉(zhuǎn)入另一種生物體中，使其產(chǎn)生我們需要的基因產(chǎn)物，或者讓它獲得新的遺傳性狀。（重組DNA技術(shù)）把生物的遺傳物質(zhì)DNA分離出來，在生物體外，通過對3生物體外基因分子水平產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物基因重組操作環(huán)境：操作對象：操作水平：基本原理：工程結(jié)果：讓目的基因在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定高效地表達(dá)操作目的：基本過程：剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)從此大西洋鮭的身上得到了世界上從沒有過的基因？（不產(chǎn)生新基因，產(chǎn)生新物種嗎？）生物體外基因分子水平產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物基因重組操作環(huán)境：4經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。理論基礎(chǔ)DNA是遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立遺傳信息傳遞方式(中心法則)的認(rèn)定—使來自異種生物的DNA拼接成為可能——使基因在異種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成為可能基因工程的誕生技術(shù)保障基因工程工具的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶載體DNA工具酶經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可5思考：如何將大馬哈魚細(xì)胞內(nèi)的生長素基因從它的DNA分子中切割下來？

如何將切下來的生長素基因與運(yùn)載體DNA連接起來？

如何將重組的DNA運(yùn)送到大西洋鮭細(xì)胞？

需要切割DNA的工具（分子手術(shù)刀）需要連接DNA片斷的工具

（分子縫合針）需要基因轉(zhuǎn)移的工具（分子運(yùn)輸車）

——限制性核酸內(nèi)切酶——DNA連接酶——基因載體工具酶思考：如何將大馬哈魚細(xì)胞內(nèi)的生長素基因從它的DNA分子中切割6最初從原核生物中分離，后來在酵母菌中也有發(fā)現(xiàn)(針對外來DNA，保護(hù)自身免受外源DNA入侵)4000種，常用200多種。

1、來源：

2、種類：3、作用：一、限制性核酸內(nèi)切酶—

“分子手術(shù)刀”（簡稱限制酶）對DNA特定的核苷酸序列進(jìn)行識別和切割基因工程的基本工具

能夠識別和切割DNA分子內(nèi)一小段特殊核苷酸序列的酶。思考能否切割煙草花葉病毒上人們想要的目的基因？最初從原核生物中分離，后來在酵母菌中也有發(fā)現(xiàn)(針對外來DNA7重播4、作用部位：磷酸二酯鍵專一性--識別特定的序列、有特定的切點(diǎn)5、作用特點(diǎn)：EcoRI識別GAATTC序列，并在G和A之間切開限制酶在切斷DNA時(shí)，可在切口處帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間堿基正好互補(bǔ)配對，因此稱這些片斷為粘性末端。5′5′3′3′重播4、作用部位：磷酸二酯鍵專一性--識別特定的序列、有特定8專一性--識別特定的序列、有特定的切點(diǎn)回文序列專一性--識別特定的序列、有特定的切點(diǎn)回文序列9平末端：平切粘性末端：錯(cuò)切作用結(jié)果：平末端：平切粘性末端：錯(cuò)切作用結(jié)果：10下列有關(guān)基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的描述，錯(cuò)誤的是() A．一種限制性內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列 B．限制性內(nèi)切酶的活性受溫度影響 C．限制性內(nèi)切酶能識別和切割RNA D．限制性內(nèi)切酶可從原核生物中提取C下列有關(guān)基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的描述，錯(cuò)誤的是(11假設(shè)某病毒的一段序列如下圖所示，其中某部位可被限制性內(nèi)切酶A識別并切割，則限制性內(nèi)切酶A識別的序列為以下哪個(gè)？

CGTCATCGATGATGCAGCTCGCAGTAGCTACTACGTCGAG

(A)ATGATG(B)ATCGAT(C)TGCAGC(D)CAGCTC【答案：B】假設(shè)某病毒的一段序列如下圖所示，其中某部位可被12（多選）某DNA分子中含有某限制性核酸內(nèi)切酶的一個(gè)識別序列，用該限制酶切割該DNA分子，可能形成的兩個(gè)DNA片段是（）CD（多選）某DNA分子中含有某限制性核酸內(nèi)切酶的一個(gè)識別序列，13工具酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程的誕生課件14DNA5′3′3′5′外源基因GCATTGCAACGTCGTAGCATTGCA5′3′3′5′注意：一般情況下，在獲得目的基因的過程中，用一種或兩種的限制性內(nèi)切酶來酶切。DNA5′3′3′5′外源基因GCATTGCAAC15思考：要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制性核酸內(nèi)切酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產(chǎn)生相同的黏性末端。如果讓兩者的黏性末端通過氫鍵連接起來，是否就可以形成重組的DNA分子了？

思考：要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制性核酸內(nèi)切酶切幾16基因工程的基本工具2、DNA連接酶（T4噬菌體、大腸桿菌）兩條鏈的骨架部分，形成磷酸二酯鍵

連接部位：具有相同黏性末端的兩個(gè)DNA片段連接起來，形成重組DNA分子。結(jié)果：限制酶和DNA連接酶的作用部位都是磷酸二酯鍵，只是一個(gè)是切開，一個(gè)是連接注意：CGGCCGTTAAAATTGCTATA氫鍵的斷裂與形成與限制酶、DNA連接酶無關(guān)。專一性？基因工程的基本工具2、DNA連接酶（T4噬菌體、大腸桿菌）兩17CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATA用同一種限制酶來切割兩種來源不同的DNA，會產(chǎn)生相同的黏性末端。CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATA18思考：用DNA連接酶連接兩個(gè)相同的黏性未端要形成幾個(gè)磷酸二酯鍵？2個(gè)用限制酶切一個(gè)特定基因要切斷幾個(gè)磷酸二酯鍵？4個(gè)外源基因（如生長激素基因）怎樣才能運(yùn)送到受體細(xì)胞（如大西洋鮭魚細(xì)胞）？需要“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體思考：用DNA連接酶連接兩個(gè)相同的黏性未端要形成幾2個(gè)19基因工程的基本工具3、基因載體（運(yùn)載體）

作為運(yùn)載工具，將外源基因送入受體細(xì)胞。

作用：條件：⑶能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制并穩(wěn)定地保存⑴有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，可使外源基因插入

其中

⑷具有某些遺傳標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選⑵對受體細(xì)胞無害

質(zhì)粒（最常用）、噬菌體和某些動植物病毒種類：基因工程的基本工具3、基因載體（運(yùn)載體）作為運(yùn)載工具，將外20啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因載體擴(kuò)增啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合21思考：假如外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制會怎樣？作為載體如果沒有限制酶切割位點(diǎn)將怎樣？外源基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何去察覺？如果載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？會在細(xì)胞增殖中丟失

外源的基因不可能插入

如果載體上有遺傳標(biāo)記基因，就可通過標(biāo)記基因的表達(dá)來檢測。

將影響受體細(xì)胞新陳代謝，進(jìn)而使轉(zhuǎn)入的外源基因也可能無法表達(dá)。思考：假如外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制會怎樣？會在細(xì)胞增殖22質(zhì)粒細(xì)菌及酵母菌等。最常用的是大腸桿菌的質(zhì)粒。來源：本質(zhì)：特點(diǎn)：染色體外的小型雙鏈環(huán)狀DNA分子。能自我復(fù)制；常具有抗生素抗性基因(標(biāo)記基因)；其存在對宿主細(xì)胞無影響。可以檢測質(zhì)粒是否導(dǎo)入了受體細(xì)胞思考：質(zhì)粒上存在的標(biāo)記基因有什么用途？要想將某個(gè)特定基因與質(zhì)粒相連，需要用幾種限制性核酸內(nèi)切酶處理？

同1種或同兩種質(zhì)粒細(xì)菌及酵母菌等。最常用的是大腸桿菌的質(zhì)粒。來源：本質(zhì)23練習(xí)：1、科學(xué)家們經(jīng)過多年努力，創(chuàng)立了一種新興生物技術(shù)——基因工程，實(shí)施該工程的最終目的是A.定向提取生物體的DNA分子B.定向地對DNA分子進(jìn)行“剪切”C.在生物體外對DNA分子進(jìn)行改造D.定向地改造生物的遺傳性狀【答案：D】2、以下說法正確的是A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來【答案：C】練習(xí)：1、科學(xué)家們經(jīng)過多年努力，創(chuàng)立了一種新興生物技術(shù)——基24練習(xí)：4、基因工程又叫重組DNA技術(shù)。假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為基因載體，并以同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割載體與目的基因，將切割后的載體與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有

種環(huán)狀DNA分子(假設(shè)兩兩結(jié)合)，它們分別是：

3運(yùn)載體與運(yùn)載體相連、目的基因與目的基因相連、運(yùn)載體與目的基因相連3、人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因的主要作用是A.提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B.有利于對目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行檢測C.增加質(zhì)粒分子的分子量D.便于與外源基因連接【答案：B】練習(xí)：4、基因工程又叫重組DNA技術(shù)。假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為255、下圖是將人的生長激素基因?qū)隑細(xì)胞內(nèi)制造“工程菌”示意圖，所用載體為質(zhì)粒A。已知細(xì)菌B細(xì)胞內(nèi)不含質(zhì)粒A，也不含質(zhì)粒A上的基因，質(zhì)粒A導(dǎo)入細(xì)菌B后，其上的基因能得到表達(dá)。請回答下列問題：(1)若把通過鑒定證明導(dǎo)入了普通質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒的細(xì)菌放在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，會發(fā)生的現(xiàn)象是：

其原理是：

(2)導(dǎo)入B細(xì)胞中的目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志是：有的能生長,有的不能生長普通質(zhì)粒含氨芐青霉素基因；重組質(zhì)粒氨芐青霉素基因被破壞。能合成人的生長激素5、下圖是將人的生長激素基因?qū)隑細(xì)胞內(nèi)制造“工程菌”示意圖26限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)。

①請畫出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

②請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。③在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接起來？為什么？能。因?yàn)橛蓛煞N限制性切割后所形成的粘性末端是相同的。限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)27練習(xí)1、下圖表示一項(xiàng)重要的生物技術(shù)，對圖中物質(zhì)a、b、c、d的描述，判斷正誤

A．a(chǎn)通常存在于細(xì)菌體內(nèi)，目前尚未發(fā)現(xiàn)真核生物體內(nèi)有類似的結(jié)構(gòu)B．b識別特定的核苷酸序列，并將A與T之間的氫鍵切開C．c連接雙鏈間的A和T，使黏性末端處堿基互補(bǔ)配對×××練習(xí)1、下圖表示一項(xiàng)重要的生物技術(shù)，對圖中物質(zhì)a、b、c、d28抗生素抗性基因SmaIBamHIHindIIIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIHindIIISmaI目的基因質(zhì)粒1.圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒,能不能使用SmaI切割?為什么?思考2.若將圖中的目的基因插入載體,需要用哪一種限制酶同時(shí)切割載體和目的基因?3.與只使用EcoRI相比較,使用BamHI和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？抗生素抗性基因SmaIBamHIHindIIIEcoR29AATTCG…………GCTTAA用兩種限制酶防止目的基因與載體的自身環(huán)化。GAATTCCTGAATGATCCG…………ATTCGA1、只使用EcoRI2、使用BamHI和HindⅢAATTCG…………GCTTAA用兩種限制酶30GCTTAAAATTCG載體AATTCG…………GCTTAA目的基因ATCTAG5533…………目的基因GATCTA5AATTCGCTTAAG335使用兩種限制酶，防止載體與目的基因反向連接GCTTAAAATTCG載體AATT31有關(guān)DNA酶將兩個(gè)DNA片段通過磷酸二酯鍵連接。DNA水解酶：DNA解旋酶：限制性核酸內(nèi)切酶：DNA聚合酶：DNA連接酶：將DNA水解成四種脫氧核苷酸，徹底水解時(shí)生成磷酸、脫氧核糖和含氮堿基。使DNA解旋成單鏈，作用部位是堿基與堿基之間的氫鍵。（在適當(dāng)?shù)母邷亍⒅亟饘冫}的作用下，也可使DNA解旋）以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成互補(bǔ)DNA鏈。將DNA切成片斷，作用部位是磷酸二酯鍵。

有關(guān)DNA酶將兩個(gè)DNA片段通過磷酸二酯鍵連接。DNA水解酶32

轉(zhuǎn)基因魚的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀為水產(chǎn)業(yè)提供了巨大的發(fā)展?jié)摿?但轉(zhuǎn)基因魚釋放到自然環(huán)境后的生態(tài)效應(yīng)則引起了很多爭議。轉(zhuǎn)基因魚的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀為水產(chǎn)業(yè)提供了巨大的發(fā)33人們對轉(zhuǎn)基因魚的一些觀點(diǎn)Q1:有人擔(dān)心吃轉(zhuǎn)基因魚會引起過敏？Q2:轉(zhuǎn)基因魚逃到野外，與野生魚交配，會把野生魚的基因給“污染”了？Q3:轉(zhuǎn)基因魚在野外與野生魚爭奪食物和配偶，有可能導(dǎo)致野生魚滅絕？Q4:養(yǎng)殖轉(zhuǎn)基因魚對環(huán)境的正面的影響？

人們對轉(zhuǎn)基因魚的一些觀點(diǎn)Q1:有人擔(dān)心吃轉(zhuǎn)基因魚會引起過敏？34基因工程的誕生時(shí)間：1972年，斯坦福大學(xué)合成第一個(gè)人工DNA重組產(chǎn)物1973年，斯坦福大學(xué)實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌之間的性狀轉(zhuǎn)移

——標(biāo)志基因工程的誕生20世紀(jì)70年代

不同生物的DNA能拼接在一起基因工程的成功能說明哪些問題？說明所有生物的DNA都具有相同的化學(xué)組成(四種脫氧核苷酸)和空間結(jié)構(gòu)(雙螺旋結(jié)構(gòu))

一種生物的基因能夠在另一種生物體內(nèi)表達(dá)說明基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段，具有一定的獨(dú)立性，同時(shí)也說明各種生物共用一套遺傳密碼基因工程的誕生時(shí)間：1972年，斯坦福大學(xué)合成第一個(gè)35

三文魚原是西餐和日本料理的主要原料，不僅味道鮮美，而且富含有益心血管健康的奧米伽-3脂肪酸。三文魚種類不少，在國內(nèi)市場上最常見的是大西洋鮭，野生的大西洋鮭因?yàn)檫^度捕撈，已瀕臨滅絕，市場上賣的大西洋鮭99％以上是人工養(yǎng)殖的。

大西洋鮭的生長速度緩慢，第一年體重只增加20～30克，一般要養(yǎng)三年才能上市。因此可以給大西洋鮭轉(zhuǎn)入體型最大的三文魚——大鱗大麻哈魚的生長激素基因。

轉(zhuǎn)基因魚

三文魚原是西餐和日本料理的主要原料，不僅味道36剪切拼接導(dǎo)入表達(dá)（三）將重組DNA分子導(dǎo)入（四）目的基因的檢測和表達(dá)轉(zhuǎn)基因魚的構(gòu)建（一）獲得大麻哈魚生長激素基因

目的基因（二）形成大西洋鮭受精卵受體細(xì)胞魚類因其產(chǎn)卵量大且體外受精而成為研究轉(zhuǎn)基因動物的最佳入選動物。（外源基因）運(yùn)載體DNA+目的基因重組DNA分子剪切拼接導(dǎo)入表達(dá)（三）將重組DNA分子導(dǎo)入（四）目的基因的檢37把生物的遺傳物質(zhì)DNA分離出來，在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行剪切、拼接，對生物的基因進(jìn)行改造和重組，然后將重組的DNA（基因）導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞內(nèi)，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需的基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)、多肽、酶等）?；蚬こ痰母拍钇浜诵氖菢?gòu)建重組DNA分子廣義：把一種生物的基因轉(zhuǎn)入另一種生物體中，使其產(chǎn)生我們需要的基因產(chǎn)物，或者讓它獲得新的遺傳性狀。（重組DNA技術(shù)）把生物的遺傳物質(zhì)DNA分離出來，在生物體外，通過對38生物體外基因分子水平產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物基因重組操作環(huán)境：操作對象：操作水平：基本原理：工程結(jié)果：讓目的基因在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定高效地表達(dá)操作目的：基本過程：剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)從此大西洋鮭的身上得到了世界上從沒有過的基因？（不產(chǎn)生新基因，產(chǎn)生新物種嗎？）生物體外基因分子水平產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物基因重組操作環(huán)境：39經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。理論基礎(chǔ)DNA是遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立遺傳信息傳遞方式(中心法則)的認(rèn)定—使來自異種生物的DNA拼接成為可能——使基因在異種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成為可能基因工程的誕生技術(shù)保障基因工程工具的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶載體DNA工具酶經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可40思考：如何將大馬哈魚細(xì)胞內(nèi)的生長素基因從它的DNA分子中切割下來？

如何將切下來的生長素基因與運(yùn)載體DNA連接起來？

如何將重組的DNA運(yùn)送到大西洋鮭細(xì)胞？

需要切割DNA的工具（分子手術(shù)刀）需要連接DNA片斷的工具

（分子縫合針）需要基因轉(zhuǎn)移的工具（分子運(yùn)輸車）

——限制性核酸內(nèi)切酶——DNA連接酶——基因載體工具酶思考：如何將大馬哈魚細(xì)胞內(nèi)的生長素基因從它的DNA分子中切割41最初從原核生物中分離，后來在酵母菌中也有發(fā)現(xiàn)(針對外來DNA，保護(hù)自身免受外源DNA入侵)4000種，常用200多種。

1、來源：

2、種類：3、作用：一、限制性核酸內(nèi)切酶—

“分子手術(shù)刀”（簡稱限制酶）對DNA特定的核苷酸序列進(jìn)行識別和切割基因工程的基本工具

能夠識別和切割DNA分子內(nèi)一小段特殊核苷酸序列的酶。思考能否切割煙草花葉病毒上人們想要的目的基因？最初從原核生物中分離，后來在酵母菌中也有發(fā)現(xiàn)(針對外來DNA42重播4、作用部位：磷酸二酯鍵專一性--識別特定的序列、有特定的切點(diǎn)5、作用特點(diǎn)：EcoRI識別GAATTC序列，并在G和A之間切開限制酶在切斷DNA時(shí)，可在切口處帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間堿基正好互補(bǔ)配對，因此稱這些片斷為粘性末端。5′5′3′3′重播4、作用部位：磷酸二酯鍵專一性--識別特定的序列、有特定43專一性--識別特定的序列、有特定的切點(diǎn)回文序列專一性--識別特定的序列、有特定的切點(diǎn)回文序列44平末端：平切粘性末端：錯(cuò)切作用結(jié)果：平末端：平切粘性末端：錯(cuò)切作用結(jié)果：45下列有關(guān)基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的描述，錯(cuò)誤的是() A．一種限制性內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列 B．限制性內(nèi)切酶的活性受溫度影響 C．限制性內(nèi)切酶能識別和切割RNA D．限制性內(nèi)切酶可從原核生物中提取C下列有關(guān)基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的描述，錯(cuò)誤的是(46假設(shè)某病毒的一段序列如下圖所示，其中某部位可被限制性內(nèi)切酶A識別并切割，則限制性內(nèi)切酶A識別的序列為以下哪個(gè)？

CGTCATCGATGATGCAGCTCGCAGTAGCTACTACGTCGAG

(A)ATGATG(B)ATCGAT(C)TGCAGC(D)CAGCTC【答案：B】假設(shè)某病毒的一段序列如下圖所示，其中某部位可被47（多選）某DNA分子中含有某限制性核酸內(nèi)切酶的一個(gè)識別序列，用該限制酶切割該DNA分子，可能形成的兩個(gè)DNA片段是（）CD（多選）某DNA分子中含有某限制性核酸內(nèi)切酶的一個(gè)識別序列，48工具酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程的誕生課件49DNA5′3′3′5′外源基因GCATTGCAACGTCGTAGCATTGCA5′3′3′5′注意：一般情況下，在獲得目的基因的過程中，用一種或兩種的限制性內(nèi)切酶來酶切。DNA5′3′3′5′外源基因GCATTGCAAC50思考：要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制性核酸內(nèi)切酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產(chǎn)生相同的黏性末端。如果讓兩者的黏性末端通過氫鍵連接起來，是否就可以形成重組的DNA分子了？

思考：要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制性核酸內(nèi)切酶切幾51基因工程的基本工具2、DNA連接酶（T4噬菌體、大腸桿菌）兩條鏈的骨架部分，形成磷酸二酯鍵

連接部位：具有相同黏性末端的兩個(gè)DNA片段連接起來，形成重組DNA分子。結(jié)果：限制酶和DNA連接酶的作用部位都是磷酸二酯鍵，只是一個(gè)是切開，一個(gè)是連接注意：CGGCCGTTAAAATTGCTATA氫鍵的斷裂與形成與限制酶、DNA連接酶無關(guān)。專一性？基因工程的基本工具2、DNA連接酶（T4噬菌體、大腸桿菌）兩52CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATA用同一種限制酶來切割兩種來源不同的DNA，會產(chǎn)生相同的黏性末端。CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATA53思考：用DNA連接酶連接兩個(gè)相同的黏性未端要形成幾個(gè)磷酸二酯鍵？2個(gè)用限制酶切一個(gè)特定基因要切斷幾個(gè)磷酸二酯鍵？4個(gè)外源基因（如生長激素基因）怎樣才能運(yùn)送到受體細(xì)胞（如大西洋鮭魚細(xì)胞）？需要“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體思考：用DNA連接酶連接兩個(gè)相同的黏性未端要形成幾2個(gè)54基因工程的基本工具3、基因載體（運(yùn)載體）

作為運(yùn)載工具，將外源基因送入受體細(xì)胞。

作用：條件：⑶能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制并穩(wěn)定地保存⑴有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，可使外源基因插入

其中

⑷具有某些遺傳標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選⑵對受體細(xì)胞無害

質(zhì)粒（最常用）、噬菌體和某些動植物病毒種類：基因工程的基本工具3、基因載體（運(yùn)載體）作為運(yùn)載工具，將外55啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因載體擴(kuò)增啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合56思考：假如外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制會怎樣？作為載體如果沒有限制酶切割位點(diǎn)將怎樣？外源基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何去察覺？如果載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？會在細(xì)胞增殖中丟失

外源的基因不可能插入

如果載體上有遺傳標(biāo)記基因，就可通過標(biāo)記基因的表達(dá)來檢測。

將影響受體細(xì)胞新陳代謝，進(jìn)而使轉(zhuǎn)入的外源基因也可能無法表達(dá)。思考：假如外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制會怎樣？會在細(xì)胞增殖57質(zhì)粒細(xì)菌及酵母菌等。最常用的是大腸桿菌的質(zhì)粒。來源：本質(zhì)：特點(diǎn)：染色體外的小型雙鏈環(huán)狀DNA分子。能自我復(fù)制；常具有抗生素抗性基因(標(biāo)記基因)；其存在對宿主細(xì)胞無影響。可以檢測質(zhì)粒是否導(dǎo)入了受體細(xì)胞思考：質(zhì)粒上存在的標(biāo)記基因有什么用途？要想將某個(gè)特定基因與質(zhì)粒相連，需要用幾種限制性核酸內(nèi)切酶處理？

同1種或同兩種質(zhì)粒細(xì)菌及酵母菌等。最常用的是大腸桿菌的質(zhì)粒。來源：本質(zhì)58練習(xí)：1、科學(xué)家們經(jīng)過多年努力，創(chuàng)立了一種新興生物技術(shù)——基因工程，實(shí)施該工程的最終目的是A.定向提取生物體的DNA分子B.定向地對DNA分子進(jìn)行“剪切”C.在生物體外對DNA分子進(jìn)行改造D.定向地改造生物的遺傳性狀【答案：D】2、以下說法正確的是A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來【答案：C】練習(xí)：1、科學(xué)家們經(jīng)過多年努力，創(chuàng)立了一種新興生物技術(shù)——基59練習(xí)：4、基因工程又叫重組DNA技術(shù)。假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為基因載體，并以同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割載體與目的基因，將切割后的載體與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有

種環(huán)狀DNA分子(假設(shè)兩兩結(jié)合)，它們分別是：

3運(yùn)載體與運(yùn)載體相連、目的基因與目的基因相連、運(yùn)載體與目的基因相連3、人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因的主要作用是A.提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B.有利于對目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行檢測C.增加質(zhì)粒分子的分子量D.便于與外源基因連接【答案：B】練習(xí)：4、基因工程又叫重組DNA技術(shù)。假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為605、下圖是將人的生長激素基因?qū)隑細(xì)胞內(nèi)制造“工程菌”示意圖，所用載體為質(zhì)粒A。已知細(xì)菌B細(xì)胞內(nèi)不含質(zhì)粒A，也不含質(zhì)粒A上的基因，質(zhì)粒A導(dǎo)入細(xì)菌B后，其上的基因能得到表達(dá)。請回答下列問題：(1)若把通過鑒定證明導(dǎo)入了普通質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒的細(xì)菌放在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，會發(fā)生的現(xiàn)象是：

其原理是：

(2)導(dǎo)入B細(xì)胞中的目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志是：有的能生長,有的不能生長普通質(zhì)粒含氨芐青霉素基因；重組質(zhì)粒氨芐青霉素基因被破壞。能合成人的生長激素5、下圖是將人的生長激素基因?qū)隑細(xì)胞內(nèi)制造“工程菌”示意圖61限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)。

①請畫出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

②請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。③在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接起來？為什么？能。因?yàn)橛蓛煞N限制性切割后所形成的粘性末端是相同的。限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)62練習(xí)1、下圖表示一項(xiàng)重要的生物技術(shù)，對圖中物質(zhì)a、b、c、d的描述，判斷正誤

A．a(chǎn)通常存在于細(xì)菌體內(nèi)，目前尚未發(fā)現(xiàn)真核生物體內(nèi)有類似的結(jié)構(gòu)B．b識別特定的核苷酸序列，并將A與T之間的氫鍵切開C．c連接雙鏈間的A和T，使黏性末端處堿基互補(bǔ)配對×××練習(xí)1、下圖表示一項(xiàng)重要的生物技術(shù)，對圖中物質(zhì)a、b、c、d63抗生素抗性基因SmaIBam