生物技術(shù)與疾病診斷課件

9.2-生物技術(shù)與疾病診斷

9.2-生物技術(shù)與疾病診斷1常見(jiàn)傳染病甲類傳染?。菏笠?、霍亂乙類傳染?。翰《拘愿窝?、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、傷寒、愛(ài)滋、淋病、梅毒、脊髓灰質(zhì)炎、白喉、百日咳、流行性腦脊髓膜炎、猩紅熱、腎綜合征出血熱、、鉤端螺旋體、布魯桿菌病、炭疽、流行性和地方性斑疹傷寒、流行性乙型腦炎、黑熱病、瘧疾、登革熱、肺結(jié)核、新生兒破傷風(fēng)。丙類傳染?。貉x(chóng)病、絳蟲(chóng)病、包蟲(chóng)病、麻風(fēng)病、流行性感冒、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、急性出血性結(jié)膜炎，除霍亂、痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

常見(jiàn)傳染病甲類傳染?。菏笠?、霍亂2海地霍亂生物技術(shù)與疾病診斷課件3鼠疫（黑死病）鼠疫（黑死?。?

傳統(tǒng)的傳染病診斷技術(shù):一是根據(jù)臨床癥狀判斷，但這必須要求被感染者發(fā)病，根據(jù)病狀進(jìn)行判斷，況且有些疾病臨床表現(xiàn)非常相似，不具有典型性狀，容易造成誤診！

5

二是先對(duì)病原物質(zhì)進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行生理生化檢驗(yàn)，從而確定病原體的種類。這種方法需要花費(fèi)較多時(shí)間，成本高速度慢效率低，另外，有些病毒類和衣原體類的病原體至今仍沒(méi)有有效的體外培養(yǎng)方法，從而影響了診斷.二是先對(duì)病原物質(zhì)進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行生理生化檢6

現(xiàn)代生物技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，為醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域提供了嶄新的診斷和監(jiān)測(cè)技術(shù)。人們對(duì)疾病，特別是傳染病的診斷，一個(gè)很重要的問(wèn)題就是如何盡早檢測(cè)感染因子的種類，因?yàn)樗鼘?duì)疾病的針對(duì)性治療及其預(yù)后有著極其重要的意義。DNA探針技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，為醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域提供了嶄新的診7一.ELISA技術(shù)與單克隆抗體

1.

ELISA技術(shù)

ELISA技術(shù)稱為酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(enzymelinked

immunosorbentassay)技術(shù)。

其原理是將酶與抗體(原)交聯(lián)形成酶-抗體(原)復(fù)合物。利用抗原與抗體的特異結(jié)合以及酶將無(wú)色底物催化成有色底物，并根據(jù)在一定范圍內(nèi)酶量與顏色呈正相關(guān)的關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)底物顏色的有無(wú)以及顏色的深淺可以判斷陰性或陽(yáng)性反應(yīng)以及反應(yīng)強(qiáng)度，可以用于定性或定量分析。一.ELISA技術(shù)與單克隆抗體1.ELISA技術(shù)82.常用的ELISA診斷技術(shù)測(cè)定抗體間的間接ELISA病原體或其他外源大分子物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后都可能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，所以可以通過(guò)檢測(cè)某種病原體的相應(yīng)抗體來(lái)判斷是否曾經(jīng)某種病原體所感染，達(dá)到診斷的目的。測(cè)定抗原的雙抗體夾心ELISA

病原體及其大分子物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后都可能成為一種抗原。所以檢測(cè)機(jī)體內(nèi)的抗原同樣可以判斷機(jī)體是否感染了相應(yīng)的抗原。

2.常用的ELISA診斷技術(shù)測(cè)定抗體間的間接ELISA9生物技術(shù)與疾病診斷課件10夾心法夾心法113.基因工程抗原

傳統(tǒng)抗原制備：

1.體外培養(yǎng)病原體。再將病原體收集，經(jīng)一系列處理后制成。

2.對(duì)于不能進(jìn)行體外培養(yǎng)的病原體，只能從受感染的動(dòng)物或患者的組織中分離收集病原體，再經(jīng)一系列處理后制成。

3.基因工程抗原傳統(tǒng)抗原制備：12缺點(diǎn)：首先，抗原生產(chǎn)過(guò)程本身就有很大的危險(xiǎn)。因?yàn)橹圃炜乖瓡r(shí)，要大量培養(yǎng)病原體，如果這些病原體逸出，將會(huì)造成很大危害；其次，產(chǎn)品的質(zhì)量難以控制，難以標(biāo)準(zhǔn)化，從而導(dǎo)致各批次產(chǎn)品質(zhì)量的差異；最后，生產(chǎn)費(fèi)用高，特別是那些體外不能培養(yǎng)的病原體更是如此。

缺點(diǎn)：13利用基因工程技術(shù)可以克服ELISA技術(shù)中需要制備抗體和抗原過(guò)程中的不足。

同疫苗生產(chǎn)一樣，將抗原基因克隆在細(xì)菌或真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，由這些表達(dá)系統(tǒng)可以生產(chǎn)大量抗原。而且生產(chǎn)過(guò)程不必接觸病原體，也便于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，成本低廉。利用基因工程技術(shù)可以克服ELISA技術(shù)中需14多克隆抗體與單克隆抗體ELISA技術(shù)除了要制備抗原檢測(cè)抗體外，有時(shí)還必須制備抗體，用于檢測(cè)抗原。

抗體的制備可以將制備的抗原直接免疫動(dòng)物，在被免疫的動(dòng)物的血清中將會(huì)含有相應(yīng)的抗體，通過(guò)一系列的純化技術(shù)就可獲得相應(yīng)的抗體。但由于一個(gè)抗原往往會(huì)有多個(gè)抗體的混合物，這種混合物稱之為多克隆抗體。

多克隆抗體與單克隆抗體ELISA技術(shù)除了要制備抗15利用多克隆抗體進(jìn)行疾病的診斷，至少有幾方面的缺點(diǎn)：

①特異性較低②產(chǎn)品質(zhì)量難于控制③生產(chǎn)過(guò)程費(fèi)時(shí)，步驟多且成本較高利用多克隆抗體進(jìn)行疾病的診斷，至少有幾方面的缺點(diǎn)：16單克隆抗體是利用細(xì)胞融合技術(shù)，在體外大量培養(yǎng)融合細(xì)胞，由融合細(xì)胞產(chǎn)生大量的抗體。由于單克隆抗體只識(shí)別某一特定的抗原決定簇，所以它旅游特異性強(qiáng)、成分均一、靈敏度高、產(chǎn)量大和容易標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。因此，明顯優(yōu)于多克隆抗體。

單克隆抗體是利用細(xì)胞融合技術(shù)，在體外大量培養(yǎng)融合細(xì)胞，由17單克隆抗體主要過(guò)程：1）免疫脾細(xì)胞的制備2）骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選3）細(xì)胞融合4）陽(yáng)性克隆的篩選5）克隆化6）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇7）大規(guī)模單克隆抗體的制備單克隆抗體主要過(guò)程：18

單克隆抗體雖然主要用于病原體感染的體外診斷，但其應(yīng)用遠(yuǎn)不僅于此，其應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛，包括：

1)鑒定微生物原體。2)確定激素水平。3)檢測(cè)腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)。

4)檢驗(yàn)血液中的藥物

5)腫瘤檢測(cè)

6)其他領(lǐng)域的應(yīng)用。

單克隆抗體雖然主要用于病原體感染的體外診斷，但其應(yīng)用遠(yuǎn)19二.DNA診斷技術(shù)1978年，Kan和Dozy首先應(yīng)用羊水細(xì)胞DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）做鐮狀細(xì)胞貧血癥的產(chǎn)前診斷，從而開(kāi)創(chuàng)了DNA診斷的新技術(shù)。主要包括：DNA探針雜交技術(shù)PCR技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)PCR-ASO技術(shù)PCR-ELISA技術(shù)PCR-SSCP技術(shù)PCR-DGGE技術(shù)LCR技術(shù)RFLP-探針技術(shù)生物芯片技術(shù)二.DNA診斷技術(shù)1978年，Kan和Dozy首先應(yīng)20DNA探針雜交技術(shù)技術(shù)根據(jù)：來(lái)源不同的DNA加熱變性后，只要兩條多核苷酸鏈的堿基有一定數(shù)量能彼此互補(bǔ)，就可以經(jīng)退火處理形成新的雜交體雙螺旋結(jié)構(gòu)。這種根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理而使兩條不同來(lái)源的、有部分互補(bǔ)序列的兩條單鏈相互結(jié)合形成異源雙鏈的技術(shù)稱為核酸雜交。核酸雜交不僅限于DNA和DNA之間，在RNA與DNA之間、RNA與RNA之間都可通過(guò)雜交形成雙鏈.

DNA探針雜交技術(shù)技術(shù)根據(jù)：21基因探針：將已知序列的特定基因用同位素、熒光素或酶進(jìn)行標(biāo)記，制備成一種診斷試劑。由于基因探針在適當(dāng)條件下可與同源序列互補(bǔ)形成雜交體，因此，使基因探針與待檢組織細(xì)胞內(nèi)的基因片段發(fā)生雜交反應(yīng)，通過(guò)探針上的標(biāo)記觀察探針是否與標(biāo)本DNA結(jié)合，從而可判斷標(biāo)本DNA中是否有與探針一致的片段，最終對(duì)標(biāo)本是否有遺傳疾病或是否被某種微生物感染做出診斷。

基因探針：將已知序列的特定基因用同位素、熒光素或酶進(jìn)行標(biāo)22生物技術(shù)與疾病診斷課件23PCR技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一項(xiàng)體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。除了可以用于基因工程目的基因的制備外，還可用于某些疾病的診斷。

尋找傳染性因子的特異DNA序列，以這段DNA序列作為靶序列，設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果檢測(cè)出了相應(yīng)的擴(kuò)增帶件事則判定為陽(yáng)性反應(yīng)。反之，無(wú)擴(kuò)增帶，則為陰性反應(yīng)。

PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一項(xiàng)體外擴(kuò)24生物技術(shù)與疾病診斷課件25PCR-RFLP技術(shù)

限制性片段多態(tài)性（RFLP）是指由于堿基的改變導(dǎo)致DNA上的某一限制性內(nèi)切核酸酶水解位點(diǎn)增加或減少。當(dāng)這種DNA用限制酶水解時(shí)，產(chǎn)生的DNA片段數(shù)將相應(yīng)的增加或減少，并且其DNA片段的分子質(zhì)量也發(fā)生相應(yīng)的改變。許多遺傳疾病就是由于DNA上堿基的變化引起的。如果這種改變正好增加或減少了DNA限制性內(nèi)切核酸酶的水解位點(diǎn)，那么就可以用PCR技術(shù)先擴(kuò)增包括之一突變位置在內(nèi)的DNA片段，獲得大量的DNA片段后通過(guò)RFLP方法進(jìn)行分析。PCR-RFLP技術(shù)

限制性片段多態(tài)性（RFLP）是指26PCR-ASO技術(shù)目前發(fā)現(xiàn)的遺傳病中，許多疾病并不是基因的缺失或限制性內(nèi)切核酸酶水解位點(diǎn)有關(guān)聯(lián)的點(diǎn)突變。絕大部分只是一些單純的堿基突變，所以不能用上述的PCR技術(shù)或者PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行診斷。但是每一種遺傳性疾病都有一些經(jīng)常發(fā)生突變的位點(diǎn)，稱為突變的熱點(diǎn)。利用這一特點(diǎn)可以進(jìn)行PCR-ASO分析。ASO稱為等位基因寡核苷酸。PCR-ASO的檢測(cè)方法就是將待測(cè)的樣品先經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得大量的待分析的DNA片段，然后將這些片段分別點(diǎn)樣在固相支持膜上。另一方面，人工合成包括突變熱點(diǎn)在內(nèi)的17～30個(gè)核苷酸的正常的和突變的寡核苷酸，并分別進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記稱為寡核苷酸探針。PCR-ASO技術(shù)目前發(fā)現(xiàn)的遺傳病中，27

利用這兩種探針?lè)謩e于膜上的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交。突變了的基因只能與突變的寡核苷酸雜交，而正常的基因只能與正常的個(gè)核苷酸探針雜交，通過(guò)放射自顯影技術(shù)便可判斷雜交的結(jié)果，從而判斷基因的突變與否。樣品PCR擴(kuò)增待分析DNA片段PCR固相支持膜正常寡核苷酸突變寡核苷酸同位素標(biāo)記同位素標(biāo)記放射自顯影檢測(cè)利用這兩種探針?lè)謩e于膜上的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交。突變了的28PCR-ELISA技術(shù)

PCR-ELISA技術(shù)是指將PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種檢驗(yàn)技術(shù)。在PCR的一對(duì)引物中，其中一條用生物素標(biāo)記，另一條用地高辛標(biāo)記，酶標(biāo)微孔板上用生物素的親和素標(biāo)記（生物素的親和素可以與生物素特異地結(jié)合）。PCR擴(kuò)增后經(jīng)過(guò)純化去除引物dNTP和引物二聚體等小分子后，將PCR擴(kuò)增后的純化片段加入到微孔板中。此時(shí)微孔板上包被的生物素親和素將與引物上的生物素結(jié)合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入堿性磷酸酯酶或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，該抗體將于另一引物上的地高辛結(jié)合從而形成生物素親和素-生物素-PCR片段-地高辛-抗地高辛抗體-酶的復(fù)合物。加入酶的相應(yīng)底物后進(jìn)行顯色，便可判斷PCR擴(kuò)增的有無(wú)。PCR-ELISA技術(shù)

PCR-ELISA技術(shù)是指將PC29PCR-SSCP技術(shù)

該方法稱為聚合酶鏈反應(yīng)-DNA單鏈構(gòu)型多態(tài)性。

原理是利用了正常的和突變的DNA單鏈在三維空間構(gòu)型上的差異，這種差異在電泳時(shí)將會(huì)有不同的電泳格局。

其方法是將正常和突變的DNA樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增得到正常和突變的DNA片段。將這兩種片段變性成為單鏈，兩樣品并行地進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。變性后的PCR產(chǎn)物的兩條單鏈DNA將按其核苷酸序列的特征形成三維結(jié)構(gòu)，并且突變樣品的三維結(jié)構(gòu)與正常樣品的三維結(jié)構(gòu)不同，從而形成不同的電泳格局。

PCR-SSCP技術(shù)該方法稱為聚合酶鏈反應(yīng)-DNA單30PCR-DGGE技術(shù)該方法稱聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù),是將正?；蚝屯蛔兓蚍謩e進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增后的兩種PCR產(chǎn)物混合后變性再?gòu)?fù)性。PCR-DGGE技術(shù)該方法稱聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技31LCR技術(shù)

LCR技術(shù)稱為連接酶鏈反應(yīng)。該方法的原理是設(shè)計(jì)兩對(duì)引物1、2和1`、2`。其中1和1`互補(bǔ)，2和2`互補(bǔ)，1和2又與待測(cè)模板DNA的一條鏈互補(bǔ)，1`和2`與另一條鏈互補(bǔ)。LCR技術(shù)

LCR技術(shù)稱為連接酶鏈反應(yīng)。32THANKS!THANKS!339.2-生物技術(shù)與疾病診斷

9.2-生物技術(shù)與疾病診斷34常見(jiàn)傳染病甲類傳染?。菏笠摺⒒魜y乙類傳染?。翰《拘愿窝?、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、傷寒、愛(ài)滋、淋病、梅毒、脊髓灰質(zhì)炎、白喉、百日咳、流行性腦脊髓膜炎、猩紅熱、腎綜合征出血熱、、鉤端螺旋體、布魯桿菌病、炭疽、流行性和地方性斑疹傷寒、流行性乙型腦炎、黑熱病、瘧疾、登革熱、肺結(jié)核、新生兒破傷風(fēng)。丙類傳染?。貉x(chóng)病、絳蟲(chóng)病、包蟲(chóng)病、麻風(fēng)病、流行性感冒、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、急性出血性結(jié)膜炎，除霍亂、痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

常見(jiàn)傳染病甲類傳染?。菏笠摺⒒魜y35海地霍亂生物技術(shù)與疾病診斷課件36鼠疫（黑死?。┦笠撸ê谒啦。?7

傳統(tǒng)的傳染病診斷技術(shù):一是根據(jù)臨床癥狀判斷，但這必須要求被感染者發(fā)病，根據(jù)病狀進(jìn)行判斷，況且有些疾病臨床表現(xiàn)非常相似，不具有典型性狀，容易造成誤診！

38

二是先對(duì)病原物質(zhì)進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行生理生化檢驗(yàn)，從而確定病原體的種類。這種方法需要花費(fèi)較多時(shí)間，成本高速度慢效率低，另外，有些病毒類和衣原體類的病原體至今仍沒(méi)有有效的體外培養(yǎng)方法，從而影響了診斷.二是先對(duì)病原物質(zhì)進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行生理生化檢39

現(xiàn)代生物技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，為醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域提供了嶄新的診斷和監(jiān)測(cè)技術(shù)。人們對(duì)疾病，特別是傳染病的診斷，一個(gè)很重要的問(wèn)題就是如何盡早檢測(cè)感染因子的種類，因?yàn)樗鼘?duì)疾病的針對(duì)性治療及其預(yù)后有著極其重要的意義。DNA探針技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，為醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域提供了嶄新的診40一.ELISA技術(shù)與單克隆抗體

1.

ELISA技術(shù)

ELISA技術(shù)稱為酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(enzymelinked

immunosorbentassay)技術(shù)。

其原理是將酶與抗體(原)交聯(lián)形成酶-抗體(原)復(fù)合物。利用抗原與抗體的特異結(jié)合以及酶將無(wú)色底物催化成有色底物，并根據(jù)在一定范圍內(nèi)酶量與顏色呈正相關(guān)的關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)底物顏色的有無(wú)以及顏色的深淺可以判斷陰性或陽(yáng)性反應(yīng)以及反應(yīng)強(qiáng)度，可以用于定性或定量分析。一.ELISA技術(shù)與單克隆抗體1.ELISA技術(shù)412.常用的ELISA診斷技術(shù)測(cè)定抗體間的間接ELISA病原體或其他外源大分子物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后都可能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，所以可以通過(guò)檢測(cè)某種病原體的相應(yīng)抗體來(lái)判斷是否曾經(jīng)某種病原體所感染，達(dá)到診斷的目的。測(cè)定抗原的雙抗體夾心ELISA

病原體及其大分子物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后都可能成為一種抗原。所以檢測(cè)機(jī)體內(nèi)的抗原同樣可以判斷機(jī)體是否感染了相應(yīng)的抗原。

2.常用的ELISA診斷技術(shù)測(cè)定抗體間的間接ELISA42生物技術(shù)與疾病診斷課件43夾心法夾心法443.基因工程抗原

傳統(tǒng)抗原制備：

1.體外培養(yǎng)病原體。再將病原體收集，經(jīng)一系列處理后制成。

2.對(duì)于不能進(jìn)行體外培養(yǎng)的病原體，只能從受感染的動(dòng)物或患者的組織中分離收集病原體，再經(jīng)一系列處理后制成。

3.基因工程抗原傳統(tǒng)抗原制備：45缺點(diǎn)：首先，抗原生產(chǎn)過(guò)程本身就有很大的危險(xiǎn)。因?yàn)橹圃炜乖瓡r(shí)，要大量培養(yǎng)病原體，如果這些病原體逸出，將會(huì)造成很大危害；其次，產(chǎn)品的質(zhì)量難以控制，難以標(biāo)準(zhǔn)化，從而導(dǎo)致各批次產(chǎn)品質(zhì)量的差異；最后，生產(chǎn)費(fèi)用高，特別是那些體外不能培養(yǎng)的病原體更是如此。

缺點(diǎn)：46利用基因工程技術(shù)可以克服ELISA技術(shù)中需要制備抗體和抗原過(guò)程中的不足。

同疫苗生產(chǎn)一樣，將抗原基因克隆在細(xì)菌或真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，由這些表達(dá)系統(tǒng)可以生產(chǎn)大量抗原。而且生產(chǎn)過(guò)程不必接觸病原體，也便于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，成本低廉。利用基因工程技術(shù)可以克服ELISA技術(shù)中需47多克隆抗體與單克隆抗體ELISA技術(shù)除了要制備抗原檢測(cè)抗體外，有時(shí)還必須制備抗體，用于檢測(cè)抗原。

抗體的制備可以將制備的抗原直接免疫動(dòng)物，在被免疫的動(dòng)物的血清中將會(huì)含有相應(yīng)的抗體，通過(guò)一系列的純化技術(shù)就可獲得相應(yīng)的抗體。但由于一個(gè)抗原往往會(huì)有多個(gè)抗體的混合物，這種混合物稱之為多克隆抗體。

多克隆抗體與單克隆抗體ELISA技術(shù)除了要制備抗48利用多克隆抗體進(jìn)行疾病的診斷，至少有幾方面的缺點(diǎn)：

①特異性較低②產(chǎn)品質(zhì)量難于控制③生產(chǎn)過(guò)程費(fèi)時(shí)，步驟多且成本較高利用多克隆抗體進(jìn)行疾病的診斷，至少有幾方面的缺點(diǎn)：49單克隆抗體是利用細(xì)胞融合技術(shù)，在體外大量培養(yǎng)融合細(xì)胞，由融合細(xì)胞產(chǎn)生大量的抗體。由于單克隆抗體只識(shí)別某一特定的抗原決定簇，所以它旅游特異性強(qiáng)、成分均一、靈敏度高、產(chǎn)量大和容易標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。因此，明顯優(yōu)于多克隆抗體。

單克隆抗體是利用細(xì)胞融合技術(shù)，在體外大量培養(yǎng)融合細(xì)胞，由50單克隆抗體主要過(guò)程：1）免疫脾細(xì)胞的制備2）骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選3）細(xì)胞融合4）陽(yáng)性克隆的篩選5）克隆化6）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇7）大規(guī)模單克隆抗體的制備單克隆抗體主要過(guò)程：51

單克隆抗體雖然主要用于病原體感染的體外診斷，但其應(yīng)用遠(yuǎn)不僅于此，其應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛，包括：

1)鑒定微生物原體。2)確定激素水平。3)檢測(cè)腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)。

4)檢驗(yàn)血液中的藥物

5)腫瘤檢測(cè)

6)其他領(lǐng)域的應(yīng)用。

單克隆抗體雖然主要用于病原體感染的體外診斷，但其應(yīng)用遠(yuǎn)52二.DNA診斷技術(shù)1978年，Kan和Dozy首先應(yīng)用羊水細(xì)胞DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）做鐮狀細(xì)胞貧血癥的產(chǎn)前診斷，從而開(kāi)創(chuàng)了DNA診斷的新技術(shù)。主要包括：DNA探針雜交技術(shù)PCR技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)PCR-ASO技術(shù)PCR-ELISA技術(shù)PCR-SSCP技術(shù)PCR-DGGE技術(shù)LCR技術(shù)RFLP-探針技術(shù)生物芯片技術(shù)二.DNA診斷技術(shù)1978年，Kan和Dozy首先應(yīng)53DNA探針雜交技術(shù)技術(shù)根據(jù)：來(lái)源不同的DNA加熱變性后，只要兩條多核苷酸鏈的堿基有一定數(shù)量能彼此互補(bǔ)，就可以經(jīng)退火處理形成新的雜交體雙螺旋結(jié)構(gòu)。這種根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理而使兩條不同來(lái)源的、有部分互補(bǔ)序列的兩條單鏈相互結(jié)合形成異源雙鏈的技術(shù)稱為核酸雜交。核酸雜交不僅限于DNA和DNA之間，在RNA與DNA之間、RNA與RNA之間都可通過(guò)雜交形成雙鏈.

DNA探針雜交技術(shù)技術(shù)根據(jù)：54基因探針：將已知序列的特定基因用同位素、熒光素或酶進(jìn)行標(biāo)記，制備成一種診斷試劑。由于基因探針在適當(dāng)條件下可與同源序列互補(bǔ)形成雜交體，因此，使基因探針與待檢組織細(xì)胞內(nèi)的基因片段發(fā)生雜交反應(yīng)，通過(guò)探針上的標(biāo)記觀察探針是否與標(biāo)本DNA結(jié)合，從而可判斷標(biāo)本DNA中是否有與探針一致的片段，最終對(duì)標(biāo)本是否有遺傳疾病或是否被某種微生物感染做出診斷。

基因探針：將已知序列的特定基因用同位素、熒光素或酶進(jìn)行標(biāo)55生物技術(shù)與疾病診斷課件56PCR技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一項(xiàng)體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。除了可以用于基因工程目的基因的制備外，還可用于某些疾病的診斷。

尋找傳染性因子的特異DNA序列，以這段DNA序列作為靶序列，設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果檢測(cè)出了相應(yīng)的擴(kuò)增帶件事則判定為陽(yáng)性反應(yīng)。反之，無(wú)擴(kuò)增帶，則為陰性反應(yīng)。

PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一項(xiàng)體外擴(kuò)57生物技術(shù)與疾病診斷課件58PCR-RFLP技術(shù)

限制性片段多態(tài)性（RFLP）是指由于堿基的改變導(dǎo)致DNA上的某一限制性內(nèi)切核酸酶水解位點(diǎn)增加或減少。當(dāng)這種DNA用限制酶水解時(shí)，產(chǎn)生的DNA片段數(shù)將相應(yīng)的增加或減少，并且其DNA片段的分子質(zhì)量也發(fā)生相應(yīng)的改變。許多遺傳疾病就是由于DNA上堿基的變化引起的。如果這種改變正好增加或減少了DNA限制性內(nèi)切核酸酶的水解位點(diǎn)，那么就可以用PCR技術(shù)先擴(kuò)增包括之一突變位置在內(nèi)的DNA片段，獲得大量的DNA片段后通過(guò)RFLP方法進(jìn)行分析。PCR-RFLP技術(shù)

限制性片段多態(tài)性（RFLP）是指59PCR-ASO技術(shù)目前發(fā)現(xiàn)的遺傳病中，許多疾病并不是基因的缺失或限制性內(nèi)切核酸酶水解位點(diǎn)有關(guān)聯(lián)的點(diǎn)突變。絕大部分只是一些單純的堿基突變，所以不能用上述的PCR技術(shù)或者PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行診斷。但是每一種遺傳性疾病都有一些經(jīng)常發(fā)生突變的位點(diǎn)，稱為突變的熱點(diǎn)。利用這一特點(diǎn)可以進(jìn)行PCR-ASO分析。ASO稱為等位基因寡核苷酸。PCR-ASO的檢測(cè)方法就是將待測(cè)的樣品先經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得大量的待分析的DNA片段，然后將這些片段分別點(diǎn)樣在固相支持膜上。另一方面，人工合成包括突變熱點(diǎn)在內(nèi)的17～30個(gè)核苷酸的正常的和突變的寡核苷酸，并分別進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記稱為寡核苷酸探針。PCR-ASO技術(shù)目前發(fā)現(xiàn)的遺傳病中，60

利用這兩種探針?lè)謩e于膜上的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交。突變了的基因只能與突變的寡核苷酸雜交，而正常的基因只能與正常的個(gè)核苷酸探針雜交，通過(guò)放射自顯