第十四章基因重組和基因工程課件

生物化學(xué)考試前答疑

時(shí)間：本周四、周五進(jìn)行。

地點(diǎn)：生化樓

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時(shí)間：本周四、周五進(jìn)行。

地點(diǎn)：生化樓

DNA重組和重組DNA技術(shù)DNARecombinationandRecombinantDNATechnology第21章DNA重組和重組DNA技術(shù)第21章第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequently

inNature第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的

DNDNA的特性：保守性，變異性，流動(dòng)性DNA重組是指不同的DNA分子斷裂并連接，從而產(chǎn)生DNA片段的交換并構(gòu)成新的DNA分子的過程。DNA的特性：保守性，變異性，流動(dòng)性DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

(transduction)轉(zhuǎn)座

(transposition)同源重組

(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(t發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。一、同源重組是最基本的DNA重組方式發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrHolliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；一個(gè)DNA的一條鏈斷裂；5′3′5′3′5′3′5′3′

內(nèi)切酶

(recBCD)5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′Holliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：兩個(gè)同源染色體DNA排3′5′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′分支遷移

(recA)通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA；3′5′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′3′3′5′3′5′3′

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)5′3′3′3′5′3′5′3′內(nèi)切酶DNA5′3

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′內(nèi)切酶DNA侵?jǐn)_分支遷移內(nèi)切酶DNA5′3′片段重組體：重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。

片段重組體：拼接重組體：Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組有四種方式（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組有四種方式（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)?？山雍腺|(zhì)粒如F因子(Ffactor)細(xì)菌染色體外的小（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

(transformation)。（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)三、位點(diǎn)特異重組，即特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合位點(diǎn)特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。三、位點(diǎn)特異重組，即特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合位點(diǎn)特異重組(sitλ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；細(xì)菌附著位點(diǎn)(attB)和噬菌體附著位點(diǎn)(attP)都含有相同的核心序列，稱為O區(qū)，該區(qū)由15bp組成：5’GCTTTTTTATACTAA3’3’CGAAAAAATATGATT5’（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性第十四章基因重組和基因工程課件反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號(hào)序列基因片段重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接免疫球蛋白基因重排過程V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置。這些可移動(dòng)的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(插入序列(IS)是從細(xì)菌的乳糖操縱子中發(fā)現(xiàn)了一段自發(fā)的插入序列，阻止了被插入的基因的轉(zhuǎn)錄，所以稱為插入序列(IS)。轉(zhuǎn)座是罕見事件，與自發(fā)突變率處于同一數(shù)量級(jí)，約為每代10-6一10-7。插入序列(IS)是從細(xì)菌的乳糖操縱子中發(fā)現(xiàn)了一段自發(fā)的插入

插入序列(insertionsequences,IS)組成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個(gè)分離的反向重復(fù)(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復(fù)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因插入序列(insertionsequences,IS插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservative插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成：

反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移

細(xì)菌的可流動(dòng)性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個(gè)相同的插入序列IS10L

由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

又稱DNA克隆或分子克隆

DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

又稱DNA克隆或分子克隆DN技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）

克隆(clone):源于希臘文klone，原意是指以無性繁殖或營養(yǎng)繁殖的方式培育植物。一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）DNA克隆技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)克隆(c應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的片段與載體DNA連接，形成成一具有自我復(fù)制能力的重組DNA分子，繼而在宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增，從而獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的片段與載體DNA連接，形成成一具

工具酶目的DNA片段載體DNA宿主細(xì)胞DNA克隆的基本要素工具酶DNA克隆的基本要素重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類DNA內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonucleⅠ型限制酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用；通常其切割位距離認(rèn)知位可達(dá)數(shù)千個(gè)堿基之遠(yuǎn)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：作用：Ⅰ型限制酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用；通常其切割位距離認(rèn)知Ⅲ型限制酶與第一型限制酶類似，同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用?？烧J(rèn)知短的不對稱序列，切割位與認(rèn)知序列約距24-26個(gè)堿基對。Ⅱ型限制酶只具有認(rèn)知切割的作用。所認(rèn)知的位置多為短的回文序列；所剪切的堿基序列通常即為所認(rèn)知的序列。Ⅲ型限制酶與第一型限制酶類似，同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用。生理意義：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。生理意義：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DN第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；命名：HindⅢⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶：來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)（三）目的基因(targetgene)

cDNA(complementaryDNA)

指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA。

基因組DNA(genomicDNA)

指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。

（三）目的基因(targetgene)cDNA(com

化學(xué)合成從基因組DNA文庫或cDNA文庫中獲得PCR或RT-PCR獲得目的基因的策略化學(xué)合成獲得目的基因的策略（四）基因載體

定義為攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)其在宿主細(xì)胞中無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA（四）基因載體定義常用載體克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體?？寺≥d體(cloningvector)表達(dá)載體(expre載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；第十四章基因重組和基因工程課件第十四章基因重組和基因工程課件

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。?/p>

EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)噬菌體(phage)λ噬菌體的基因組λ噬菌體的基因組λgt系列載體將外來序列插中段，可插入5-7kb外來DNA。EMBL系列載體用外來DNA替代中段，可插入5-20kb外來DNA。λ噬菌體載體可插入的DNA長；轉(zhuǎn)染大腸桿菌的效率；可用于構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫。λ噬菌體載體的容量λ噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)λgt系列載體將外來序列插中段，可插入5-7kb外來DNA。

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

粘性質(zhì)粒(cosmid)cos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等，就可構(gòu)成粘性質(zhì)粒載體。粘性質(zhì)粒可插入45kb長的外源DNA粘性質(zhì)粒(cosmid)cos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)

酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)

動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他酵母人工染色體其他二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程以（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)(見第22章)（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列?；瘜W(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。

從基因組DNA文庫獲取目的基因基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制

從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTTmRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接

(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接粘BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端適用于：平端連接限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端適用于：目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEcoTT+AATaq酶在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3’末端會(huì)多加一個(gè)A，形成僅一個(gè)突出A的粘性末端。

T載體有一個(gè)T核苷酸突出性末端，這樣單個(gè)T和單個(gè)A通過粘末端連接在一起。拓?fù)洚悩?gòu)酶連接酶T載體連接TT+AATaq酶在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3’末端會(huì)多加一個(gè)A，拓受體菌條件：安全宿主菌DNA、蛋白降解系統(tǒng)缺陷重組酶缺陷導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌受體菌條件：導(dǎo)入方式：（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌轉(zhuǎn)化：

/wiki/%E7%B4%B0%E8%83%9E通過攝取外源DNA而發(fā)生遺傳學(xué)改變的過程。轉(zhuǎn)染：真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程。感染：以病毒顆粒感染方式將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)染：感染：借助遺傳標(biāo)志篩選(1)抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)序列特異性篩選RE酶切法PCR法核酸雜交法測序法3.親和篩選法如免疫印跡法（五）重組體的篩選借助遺傳標(biāo)志篩選（五）重組體的篩選(插入失活法)

抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)α互補(bǔ)利用α互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18α互補(bǔ)利用α互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18

原位雜交原位雜交

Southern印跡Southern印跡雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學(xué)方法雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學(xué)方法重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體

重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：小結(jié)分分離目的基因切重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源表達(dá)體系的建立：表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)表達(dá)體系的建立：（六）克隆基因的表達(dá)

標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn)

E.coli表達(dá)體系的不足：不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

；很難表達(dá)大量可溶性蛋白。1.原核表達(dá)體系(E.coli表達(dá)體系最為常用)標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子1.原核大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)和分泌 大鼠胰島素原cDNA第十四章基因重組和基因工程課件

優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA

可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)

轉(zhuǎn)染

——將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染

DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射2.真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞）優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA轉(zhuǎn)染——表達(dá)載體pFASTBACI的物理圖譜表達(dá)載體pFASTBACI的物理圖譜表達(dá)載體YEpIPT的物理圖譜表達(dá)載體YEpIPT的物理圖譜第三節(jié)

重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大DNARecombinationTechniqueisCloslyRelatedwithMedicineandhasaGoodPerspective第三節(jié)DNARecombinationTechnique一、人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃是一項(xiàng)規(guī)模宏大，跨國跨學(xué)科的科學(xué)探索工程。其宗旨在于測定組成人類染色體的核苷酸序列，從而繪制人類基因組圖譜，并且辨識(shí)其載有的基因及其序列，達(dá)到破譯人類遺傳信息的最終目的?；蚪M計(jì)劃是是繼曼哈頓計(jì)劃和阿波羅登月計(jì)劃之后，人類科學(xué)史上的又一個(gè)偉大工程。一、人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃是一項(xiàng)規(guī)模宏大，跨國跨學(xué)科的二、生物制藥利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項(xiàng)重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。美國EliLilly公司于1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場，標(biāo)志著生物工程藥物時(shí)代的開始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個(gè)巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。二、生物制藥利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！生物化學(xué)考試前答疑

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DNA重組和重組DNA技術(shù)DNARecombinationandRecombinantDNATechnology第21章DNA重組和重組DNA技術(shù)第21章第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequently

inNature第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的

DNDNA的特性：保守性，變異性，流動(dòng)性DNA重組是指不同的DNA分子斷裂并連接，從而產(chǎn)生DNA片段的交換并構(gòu)成新的DNA分子的過程。DNA的特性：保守性，變異性，流動(dòng)性DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

(transduction)轉(zhuǎn)座

(transposition)同源重組

(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(t發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。一、同源重組是最基本的DNA重組方式發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrHolliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；一個(gè)DNA的一條鏈斷裂；5′3′5′3′5′3′5′3′

內(nèi)切酶

(recBCD)5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′Holliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：兩個(gè)同源染色體DNA排3′5′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′分支遷移

(recA)通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA；3′5′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′3′3′5′3′5′3′

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)5′3′3′3′5′3′5′3′內(nèi)切酶DNA5′3

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′內(nèi)切酶DNA侵?jǐn)_分支遷移內(nèi)切酶DNA5′3′片段重組體：重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。

片段重組體：拼接重組體：Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組有四種方式（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組有四種方式（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)細(xì)菌染色體外的?。ǘ┺D(zhuǎn)化作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

(transformation)。（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)三、位點(diǎn)特異重組，即特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合位點(diǎn)特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。三、位點(diǎn)特異重組，即特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合位點(diǎn)特異重組(sitλ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；細(xì)菌附著位點(diǎn)(attB)和噬菌體附著位點(diǎn)(attP)都含有相同的核心序列，稱為O區(qū)，該區(qū)由15bp組成：5’GCTTTTTTATACTAA3’3’CGAAAAAATATGATT5’（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性第十四章基因重組和基因工程課件反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號(hào)序列基因片段重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接免疫球蛋白基因重排過程V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置。這些可移動(dòng)的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(插入序列(IS)是從細(xì)菌的乳糖操縱子中發(fā)現(xiàn)了一段自發(fā)的插入序列，阻止了被插入的基因的轉(zhuǎn)錄，所以稱為插入序列(IS)。轉(zhuǎn)座是罕見事件，與自發(fā)突變率處于同一數(shù)量級(jí)，約為每代10-6一10-7。插入序列(IS)是從細(xì)菌的乳糖操縱子中發(fā)現(xiàn)了一段自發(fā)的插入

插入序列(insertionsequences,IS)組成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個(gè)分離的反向重復(fù)(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復(fù)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因插入序列(insertionsequences,IS插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservative插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成：

反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移

細(xì)菌的可流動(dòng)性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個(gè)相同的插入序列IS10L

由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

又稱DNA克隆或分子克隆

DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

又稱DNA克隆或分子克隆DN技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）

克隆(clone):源于希臘文klone，原意是指以無性繁殖或營養(yǎng)繁殖的方式培育植物。一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）DNA克隆技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)克隆(c應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的片段與載體DNA連接，形成成一具有自我復(fù)制能力的重組DNA分子，繼而在宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增，從而獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的片段與載體DNA連接，形成成一具

工具酶目的DNA片段載體DNA宿主細(xì)胞DNA克隆的基本要素工具酶DNA克隆的基本要素重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類DNA內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonucleⅠ型限制酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用；通常其切割位距離認(rèn)知位可達(dá)數(shù)千個(gè)堿基之遠(yuǎn)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：作用：Ⅰ型限制酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用；通常其切割位距離認(rèn)知Ⅲ型限制酶與第一型限制酶類似，同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用?？烧J(rèn)知短的不對稱序列，切割位與認(rèn)知序列約距24-26個(gè)堿基對。Ⅱ型限制酶只具有認(rèn)知切割的作用。所認(rèn)知的位置多為短的回文序列；所剪切的堿基序列通常即為所認(rèn)知的序列。Ⅲ型限制酶與第一型限制酶類似，同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用。生理意義：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。生理意義：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DN第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；命名：HindⅢⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶：來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)（三）目的基因(targetgene)

cDNA(complementaryDNA)

指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA。

基因組DNA(genomicDNA)

指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。

（三）目的基因(targetgene)cDNA(com

化學(xué)合成從基因組DNA文庫或cDNA文庫中獲得PCR或RT-PCR獲得目的基因的策略化學(xué)合成獲得目的基因的策略（四）基因載體

定義為攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)其在宿主細(xì)胞中無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA（四）基因載體定義常用載體克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體?？寺≥d體(cloningvector)表達(dá)載體(expre載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；第十四章基因重組和基因工程課件第十四章基因重組和基因工程課件

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。?/p>

EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)噬菌體(phage)λ噬菌體的基因組λ噬菌體的基因組λgt系列載體將外來序列插中段，可插入5-7kb外來DNA。EMBL系列載體用外來DNA替代中段，可插入5-20kb外來DNA。λ噬菌體載體可插入的DNA長；轉(zhuǎn)染大腸桿菌的效率；可用于構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫。λ噬菌體載體的容量λ噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)λgt系列載體將外來序列插中段，可插入5-7kb外來DNA。

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

粘性質(zhì)粒(cosmid)cos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等，就可構(gòu)成粘性質(zhì)粒載體。粘性質(zhì)?？刹迦?5kb長的外源DNA粘性質(zhì)粒(cosmid)cos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)

酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)

動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他酵母人工染色體其他二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程以（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列?；蚪MDNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)(見第22章)（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列?；瘜W(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列?；蚪MDNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。

從基因組DNA文庫獲取目的基因基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制

從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTTmRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接

(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接粘BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端適用于：平端連接限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端適用于：目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(