處理加熱過的肌肉蛋白質(zhì)來(lái)識(shí)別肉的種類以及加熱肉品終點(diǎn)溫度的確定課件

通過單克隆抗體技術(shù)處理加熱過的肌肉蛋白質(zhì)來(lái)識(shí)別肉的種類以及加熱肉品終點(diǎn)溫度的確定

Y-H.P.Hsieh,F.C.Chen,和N.djurdjevic

Auburn大學(xué)食品科學(xué)和營(yíng)養(yǎng)系

AuburnAlabana36849

通過單克隆抗體技術(shù)處理加熱過的肌肉蛋白質(zhì)來(lái)識(shí)別肉的種類以及加1肉制品的質(zhì)量和安全已引起消費(fèi)者以及管理機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注。在生肉制品質(zhì)量控制，加強(qiáng)食物安全和分類管理方面酶連免疫吸附技術(shù)(ELISA)被認(rèn)為是一種十分有效和適合的檢測(cè)分析方法，為了定量的確定加熱產(chǎn)品中攙雜肉的全部種類,在ELAISA技術(shù)中,許多單抗體已經(jīng)被逐漸探索應(yīng)用。在作用于加熱處理過的肌肉蛋白質(zhì)的過程中，單抗體技術(shù)已經(jīng)得到發(fā)展.隨著加熱終點(diǎn)溫度的增ELISA反應(yīng)的程度也隨之增加，可以用MABS肉制品的質(zhì)量和安全已引起消費(fèi)者以及管理機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)2(單克隆抗體技術(shù))來(lái)檢測(cè)肉品中特定的肉種類。因此,MABS可以用作決定預(yù)煮肉品的最大內(nèi)部加熱溫度，以此來(lái)確保產(chǎn)品的安全性.在本節(jié)中主要介紹了現(xiàn)行的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作過程,特點(diǎn)以及MABS的應(yīng)用。(單克隆抗體技術(shù))來(lái)檢測(cè)肉品中特定的肉種類。因此,MA31．

介紹

因?yàn)榻?jīng)濟(jì)的損失，食物過敏及宗教信仰方面的因素，肉品中攙雜不明肉類在很大程度上欺騙了消費(fèi)者。聯(lián)邦法律要求肉制品必須貼上標(biāo)簽以證明包含肉的種類。在許多國(guó)家已報(bào)道了肉類替代現(xiàn)象，例如在英國(guó)馬肉被用作牛肉羊肉。馬肉和袋鼠肉在加拿大發(fā)現(xiàn)被用作出口的牛肉。豬肉被用作牛肉和羊肉出口到中東地區(qū)。隨著食品企業(yè)中機(jī)械去骨肉使用量的增加，最近,人們已越發(fā)的關(guān)注多種加工過程和預(yù)煮1．

介紹

因?yàn)榻?jīng)濟(jì)的損失，食物過4肉類以及分割肉產(chǎn)品。美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全和檢測(cè)服務(wù)局（USDFA-FSIS）的管理?xiàng)l例中對(duì)使用機(jī)械分割肉做了如下的規(guī)定：只要求使用一類肉的肉制品中不要包含任何別的種類的機(jī)械分割肉。然而，由于不正當(dāng)?shù)慕灰缀腿珖?guó)性經(jīng)濟(jì)欺騙現(xiàn)象的存在，國(guó)內(nèi)零售市場(chǎng)中在魚及陸生動(dòng)物肉類產(chǎn)品中混入不知名的雜肉已成為一種普遍現(xiàn)象。研究表明煮制品比原料制品存在更高的攙雜現(xiàn)象，在一種產(chǎn)品中加入多種不知名的肉類也是一個(gè)十分普遍的現(xiàn)象。肉類以及分割肉產(chǎn)品。美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全和檢測(cè)服務(wù)局（U5肉類應(yīng)被煮制足夠的時(shí)間，有利于人類的消化吸收，也可以確保消滅其中的病原微生物。在食用鮮肉和禽類制品時(shí)不正當(dāng)?shù)呐胝{(diào)被認(rèn)為是引起傳染疾病的一個(gè)主要因素。USDA-FSIS已特別規(guī)定肉制品加熱過程的指導(dǎo)方針,對(duì)于每種肉應(yīng)有多種預(yù)煮制品。例如，未干制的禽類制品中心溫度必須加熱到71.1℃，而干制的禽類制品也必須加熱到68.3℃來(lái)殺死沙門氏菌.為了確保消除大腸桿菌O157，烤牛肉的PH值.應(yīng)控制在7左右加熱溫度肉類應(yīng)被煮制足夠的時(shí)間，有利于人類的消化吸收668.3℃。別的制品PH值為7，加熱溫度為71.7℃。鮮豬肉加熱時(shí)內(nèi)部溫度應(yīng)達(dá)到76.7℃，而且殺死旋毛蟲溫度應(yīng)至少比此溫度再高17℃。然而，一旦肉品中攙雜了別的不知名肉類，由于不知名肉類的存在對(duì)于特定種類的最低內(nèi)部加熱溫度也就失效了。為了阻止肉類的攙雜和減少由于不足夠加熱過程引起的食物傳染疾病的危害，對(duì)于管理監(jiān)督部門來(lái)講,采用可靠分析方法來(lái)執(zhí)行肉類管理程序是十分必要的。68.3℃。別的制品PH值為7，加熱溫度為71.7最理想的方法具有特定，反應(yīng)靈敏，快速，經(jīng)濟(jì)性，高檢測(cè)率的特點(diǎn)，并且能夠提供量性的結(jié)果。盡管在每一種條件下單一的方法并不一定能夠滿足所有的要求，但選擇ELISA用于肉類的檢測(cè)可以滿足最多的要求。多克隆抗（PABS）和單克隆抗體（MABS）技術(shù)都已用在ELISA中，MABS比PABS有更多的優(yōu)點(diǎn)：連續(xù)使用，穩(wěn)定的特性和免疫試劑相近性。在免疫分析中使用MABS可以提供獨(dú)一無(wú)二的試劑，并且可以減少分析最理想的方法具有特定，反應(yīng)靈敏，快速，經(jīng)濟(jì)性，8的費(fèi)用，MABS已被用在原料肉種類的鑒定。因?yàn)樽饔糜谡顟B(tài)下蛋白質(zhì)的抗體在大多情況下不能識(shí)別加熱處理后肉中的蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)室中使用MABS來(lái)檢測(cè)加熱肉品中攙雜的肉的種類。在全部加熱處理過的肉品混合物中MABS可以對(duì)目標(biāo)品種的含量就行定量檢測(cè)，而且可以決定預(yù)煮肉的最大中心加熱溫度。我們主要討論MABS的實(shí)驗(yàn)操作過程特性和它的應(yīng)用.在本章中也對(duì)這兩種領(lǐng)域內(nèi)的現(xiàn)行方法進(jìn)行了大概的評(píng)價(jià)的費(fèi)用，MABS已被用在原料肉種類的鑒定。因?yàn)樽饔糜谡?2攙雜肉品種類的確認(rèn)\

2.1非免疫學(xué)方法

在過去的二十年中，許多用于確認(rèn)肉品種類的非免疫方法例如電泳和色譜層析已經(jīng)有了很大的發(fā)展。對(duì)于蛋白質(zhì)的分離電泳技術(shù)是十分有效的，不同的肌肉蛋白質(zhì)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）經(jīng)常產(chǎn)生相同的蛋白類型，所以在肉種類確認(rèn)方面它的可信度十分的小。等吸附技術(shù)基于蛋白質(zhì)不同的等電點(diǎn)可以把蛋白質(zhì)依據(jù)不同種類而分開，這種技術(shù)被廣泛用于確認(rèn)2攙雜肉品種類的確認(rèn)\

2.1非免疫學(xué)方法

10魚肉的種類，也可以用于區(qū)分不同種類的原料肉。但是，當(dāng)混合肉中存在多種肉或蛋白添加劑時(shí),很難解釋其檢測(cè)結(jié)果。色譜法如氣相色譜,液體色譜和高精度色譜已經(jīng)被廣泛用于肉種類的確認(rèn)，這種方法是基于對(duì)肉樣中脂肪酸成分，組氨基酸或蛋白質(zhì)形狀的檢驗(yàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些方法可以區(qū)分不同個(gè)體肉的種類，但是由于色譜類型復(fù)雜度的增加，這些方法在檢測(cè)復(fù)合肉品中摻雜肉的種類時(shí)會(huì)失效。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，包括魚肉的種類，也可以用于區(qū)分不同種類的原料肉。但是，當(dāng)混合肉中11DNA雜交技術(shù)，聚合酶鏈反應(yīng)和碎片分析技術(shù)已對(duì)法醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了革命性的變革，對(duì)于食品科學(xué)也是如此。DNA雜交技術(shù)已被用于多中肉類品種的確認(rèn),下一步準(zhǔn)備也進(jìn)行基因組DNA或克隆DNA同目標(biāo)DNA的雜交，同時(shí)用顏色或自行x射線照相技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)工作。這些方法在用于煮制肉類品種確認(rèn)方面是獨(dú)特的并且十分有用,但是在確認(rèn)聯(lián)系密切肉類時(shí)效果不好下一步準(zhǔn)備顯示牛，綿羊，山羊DNA雜交技術(shù)，聚合酶鏈反應(yīng)和碎片分析技術(shù)已對(duì)法醫(yī)學(xué)12基因組DNA水平上的相互交叉反應(yīng)。通過混合未標(biāo)記DNA修飾DNA雜交可以減少交叉反應(yīng)，從而可以從交叉雜交種類中區(qū)分綿羊和山羊，大約有10﹪的區(qū)別限度。綿羊和山羊肉類的區(qū)分是使用直接連續(xù)技術(shù)來(lái)對(duì)比核苷酸的次序而實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)也分析了限制核苷酸內(nèi)切酶聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物，由于費(fèi)用高和操作的復(fù)雜性，這些基于DNA水平的技術(shù)未被常規(guī)分析方法所采納?；蚪MDNA水平上的相互交叉反應(yīng)。通過混合未標(biāo)記DNA修飾132.2免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法是基于特定抗體－抗原反應(yīng)，它適用于分析復(fù)雜混合物中的成分，同時(shí)此成分有最低的檢測(cè)量。從本世紀(jì)開始，免疫技術(shù)已被用于動(dòng)物肉類品種的確認(rèn)。免疫技術(shù)的先進(jìn)之處在于它可以在很大程度是提高檢測(cè)的敏感性和結(jié)果的準(zhǔn)確性。沉淀環(huán)實(shí)驗(yàn)是免疫分析方法的一個(gè)簡(jiǎn)單形式，它的原理是在實(shí)驗(yàn)管中抗血清和肉的抗原相匯處可產(chǎn)生可2.2免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法是基于特定抗體－抗原反14見的環(huán)。血凝抑制實(shí)驗(yàn)是基于阻止抗原血清和它的同類抗原之間積極的反應(yīng)，而此同種類抗原被同種外來(lái)羊的紅血細(xì)胞所包裹。瓊脂膠體免疫擴(kuò)散，雙層免疫擴(kuò)散技術(shù)起源于Ouchyeriony(1948)的描述，同時(shí)也涉及抗血清和抗原在半固體瓊脂膠體中的擴(kuò)散。經(jīng)過隔夜培養(yǎng)后在抗體和它對(duì)應(yīng)的抗原相匯處形成一個(gè)可見的不透光的帶。USDA-FSIS肉類檢查員對(duì)這種技術(shù)做了一定的修繕，使用標(biāo)定的試劑紙片和提前準(zhǔn)備的瓊脂平板使此種見的環(huán)。血凝抑制實(shí)驗(yàn)是基于阻止抗原血清和它的同類抗原15技術(shù)在檢測(cè)原料肉的種類時(shí)更加便利.由于瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)靈敏性易變化，培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)，并且非肉的成分干擾大，所以限制了它在完整鮮肉分析中的應(yīng)用。免疫分析經(jīng)常用在臨床處置中，但是一項(xiàng)研究指出,用I標(biāo)記免疫試劑檢測(cè)出牛肉中存在5﹪的其他成分。由于放射免疫分析技術(shù)要用有害的放射材料，并且要用閃爍計(jì)數(shù)器，所以限制了它在日常檢驗(yàn)和檢測(cè)肉種類中的應(yīng)用。ELISA由于下面的優(yōu)點(diǎn)而在肉種類技術(shù)在檢測(cè)原料肉的種類時(shí)更加便利.由于瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)靈16的確認(rèn)中得到了十分廣泛的應(yīng)用：不用太貴的科學(xué)儀器，易于操作，免疫試劑用量小，可應(yīng)用于大數(shù)量，寬領(lǐng)域的檢測(cè)。經(jīng)常應(yīng)用的有三種類型:間接ELISA競(jìng)爭(zhēng)，ELISA,夾心ELISA。間接ELISA,先把抗原吸入一個(gè)微量平板上，之后相反動(dòng)物的抗體與抗原結(jié)合吸附在固體層上，通過二者與隨后加入的反免疫球蛋白的結(jié)合，通過外來(lái)添加酶而形成的顏色.它可以檢測(cè)到抗原與抗體的結(jié)合物。競(jìng)爭(zhēng)ELISA技術(shù)是基于提取樣品中有限的抗的確認(rèn)中得到了十分廣泛的應(yīng)用：不用太貴的科學(xué)儀器，易于操作，17體，而自由抗原和與固體相結(jié)合的抗原與抗體競(jìng)爭(zhēng)相結(jié)合。固體相抗原結(jié)合的特定種類抗原的限制數(shù)同液體相中的抗原數(shù)成正比。夾心ELISA使用固體相上的抗體作為結(jié)合抗體。另一種抗體用作檢測(cè)抗體。所以，這便形成了一個(gè)夾心，抗原位于中間，抗體在抗原分子的兩側(cè)。在表1中對(duì)不同類型ELISA用各種肉的抗原對(duì)原料肉的確認(rèn)進(jìn)行了總結(jié)。最近，單抗體技術(shù)也應(yīng)用在ELISA中來(lái)對(duì)原料肉進(jìn)行確認(rèn)，ELISA也用于煮制肉品種類的確認(rèn)中。體，而自由抗原和與固體相結(jié)合的抗原與抗體競(jìng)爭(zhēng)相結(jié)合。固體相182.3抗體的來(lái)源

在使用酶免疫測(cè)定來(lái)確認(rèn)肉的種類成功的發(fā)展的過程中，最重要的是特定種類的抗體，不同種動(dòng)物需要不同的免疫試劑。傳統(tǒng)的來(lái)講，在ELISA中應(yīng)用的單抗體來(lái)自免疫動(dòng)物的血清。多克隆抗體技術(shù)在自然界中是外源的，亞群和特定種類抗原或相反種類抗原相結(jié)合。因此可以十分容易的觀測(cè)到血清和相關(guān)種類抗原的交叉反應(yīng)。在檢測(cè)程度標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)展過程中，一組抗體親和力和結(jié)合2.3抗體的來(lái)源

在使用酶免疫測(cè)定來(lái)確認(rèn)肉的種類19特性的變化也引起了人們的關(guān)注。同多克隆抗體技術(shù)相反，單克隆抗體技術(shù)的來(lái)源－單細(xì)胞鏈在自然界中是同源的。它們來(lái)自融化得抗體分泌物Blymphocytes,而這種分泌物又來(lái)自患有骨髓瘤的免疫老鼠。融化的產(chǎn)物叫雜交細(xì)胞，可以在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且可以繼續(xù)的分泌抗體。經(jīng)過仔細(xì)的鏡檢和亞克隆后，可以挑選出穩(wěn)定的雜交細(xì)胞鏈，它可以分泌出針對(duì)某一特定抗原的抗體，而且產(chǎn)生抗體十分頻繁。采用單抗體的方法來(lái)對(duì)特性的變化也引起了人們的關(guān)注。同多克隆抗體技術(shù)相反，單克隆抗20肉的種類進(jìn)行免疫分析時(shí)，應(yīng)保證連續(xù)供應(yīng)統(tǒng)一的免疫試劑，也應(yīng)減少標(biāo)準(zhǔn)分析程序。肉的種類進(jìn)行免疫分析時(shí)，應(yīng)保證連續(xù)供應(yīng)統(tǒng)一的免疫試劑，也應(yīng)減212.4抗原的選擇大多數(shù)對(duì)于原料肉種類的免疫檢測(cè)方法都采用多克隆方法來(lái)處理整個(gè)血清或血清蛋白。因?yàn)檠宓鞍椎拇嬖诳赡苁潜仨毜?，肌肉組織中殘余的血漿成分會(huì)發(fā)生變化，那么便意味著肌肉組織的存在，進(jìn)而可以得出結(jié)論：用這些多克隆技術(shù)來(lái)定量的估計(jì)攙雜物的量是不可靠的。肌肉蛋白質(zhì)的存在是顯著的,預(yù)示了雞肉2.4抗原的選擇大多22組織存在的可能性比血清蛋白存在的可能性要大。對(duì)于肉種類的多克隆技術(shù)已用于可溶性粗蛋白的分析中或凈化肌肉成分，例如肌鈣蛋白和肌紅蛋白。這些檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于容易獲得提取樣品，更重要的一點(diǎn)在于對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的改進(jìn)與發(fā)展。不溶性肌肉蛋白如連接蛋白也可以用于單抗體的分析方法中，來(lái)確認(rèn)原料禽肉的種類。然而不溶性蛋白的提取需要特殊的步驟。這些方法毫無(wú)疑問的可以應(yīng)用于法律事件的檢測(cè)中，但組織存在的可能性比血清蛋白存在的可能性要大。對(duì)于肉種類的多克23不適用于常規(guī)檢驗(yàn)分析或產(chǎn)地檢驗(yàn)。因?yàn)橥ㄟ^加熱處理后，大多的蛋白質(zhì)變性并且成為不可溶的，所以使用抗體來(lái)處置本源蛋白質(zhì)的方法不可以用于加熱處理過的肉類。對(duì)于加熱的肉類的確認(rèn)也應(yīng)用熱穩(wěn)定蛋白。在解決特定種類熱穩(wěn)定性組成方面已做了十分大的努力。用IEF方法，Jones和Mortiner(1985)說明了來(lái)自腎上腺和肌肉組織的BE抗原蛋白具有熱穩(wěn)定性。但是不同類型BE抗原的特性是顯著不同的，Sherikar使用SDS-聚不適用于常規(guī)檢驗(yàn)分析或產(chǎn)地檢驗(yàn)。24丙稀酰胺凝膠電泳的方法檢測(cè)了不同種類的BE抗原，并且得出結(jié)論在BE蛋白中肌鈣蛋白T屬于特定種類蛋白部分。沒有經(jīng)過加熱處理的從肌肉組織中分離的具有抗熱性的糖蛋白應(yīng)用于多克隆抗體技術(shù)中。這些抗體已應(yīng)用于夾心ELISA中用于鑒別加熱和罐裝肉類食物中。這些方法在商業(yè)檢測(cè)中是十分有效的，并且也應(yīng)用于USDA對(duì)加熱肉品種類確認(rèn)的調(diào)查中。大多對(duì)于加熱肉品種類的確認(rèn)中大都使用多克隆抗體技術(shù)方法.最近在丙稀酰胺凝膠電泳的方法檢測(cè)了不同種類的BE抗原，并且得出結(jié)25我們實(shí)驗(yàn)室中對(duì)單克隆抗體技術(shù)確認(rèn)加熱肉種類的研究中也取得了一定的進(jìn)展。用于加熱處理肉類蛋白鑒別的單克隆抗體技術(shù)也可用于原料肉的鑒別中，因?yàn)樵跍?zhǔn)備檢測(cè)樣品時(shí)這些原料肉可以十分容易的被加熱處理。我們實(shí)驗(yàn)室中對(duì)單克隆抗體技術(shù)確認(rèn)加熱肉種類的研究中也263單克隆抗體技術(shù)用于加熱處理肌肉蛋白的確認(rèn)

3.1單克隆抗體介紹

用于熱穩(wěn)定性或抗熱性蛋白的不同抗原已經(jīng)用于發(fā)展抗體技術(shù)來(lái)確認(rèn)加熱肉品的種類。熱穩(wěn)定性這一個(gè)詞在字典中被十分清晰的定義，大多情況下，它指經(jīng)過加熱處理的肉類浸提物中保持可溶性和抗原性的完整蛋白或蛋白碎片。如果一種特定分析蛋白已知應(yīng)用于一種特定的種類確認(rèn),那么在免疫分析技術(shù)中3單克隆抗體技術(shù)用于加熱處理肌肉蛋白的確認(rèn)

3.1單克隆27使用提純蛋白可以增加對(duì)于特定種類抗原決定基的免疫反應(yīng)機(jī)會(huì)。然而對(duì)于雜交瘤的分泌物并不一定完全需要提純蛋白作為抗原，由于在挑選適宜特定種類蛋白主要方面缺少足夠多的知識(shí)技術(shù)，所以在單克隆抗體技術(shù)中我們使用加熱處理過的可溶性粗肌肉蛋白作為免疫源。在加熱之后，純的肉類蛋白質(zhì)顯著減少，這樣在提取物中只有熱穩(wěn)定性或熱抗性的部分蛋白質(zhì)仍保持可溶性。對(duì)期望的特性應(yīng)用MABS（單克隆抗體技術(shù)）檢測(cè)使用提純蛋白可以增加對(duì)于特定種類抗原決定基的免疫反應(yīng)機(jī)會(huì)。然28時(shí)應(yīng)選擇雜交克隆分泌物，而且必須要經(jīng)過仔細(xì)的鏡檢和亞克隆。對(duì)于準(zhǔn)備抗原有兩種方法:1)用蒸餾水或鹽水對(duì)粗瘦肉進(jìn)行攪拌，過濾物可以作為免疫原。2）瘦肉混于0.15MNACL中，沸水加熱并且離心.上層液121℃30分鐘高溫滅菌過濾，用90﹪乙醇進(jìn)行萃取，沉淀，干燥物溶于鹽溶液中備用。來(lái)自免疫老鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后可作為雜交產(chǎn)物。在我們的實(shí)驗(yàn)室中，遵守由Kohler和Milstern描述的一般程序，那便是在隨后時(shí)應(yīng)選擇雜交克隆分泌物，而且必須要經(jīng)過仔細(xì)的鏡檢和亞克隆。對(duì)29的步驟中要進(jìn)行必要的修飾。ELISA鏡檢是用于經(jīng)過選擇實(shí)驗(yàn)的與抗原對(duì)應(yīng)的克隆體，同時(shí)用異種的浸提物和別的食物蛋白通過交叉反應(yīng)來(lái)穩(wěn)定雜交物。雜交產(chǎn)物具有我們所期望的特性，之后通過限定性稀釋程序?qū)χ寺≈辽賰纱我垣@得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞鏈。SDS和免疫點(diǎn)技術(shù)用于確認(rèn)每種單克隆肉類浸提物種抗原的成分。的步驟中要進(jìn)行必要的修飾。ELISA鏡檢是用于經(jīng)過選擇實(shí)驗(yàn)的303.2單克隆抗體的特點(diǎn)

目前為止，五種免疫球蛋白單克隆抗體技術(shù)在實(shí)驗(yàn)中已用于摻雜肉種類的檢測(cè)。單克隆抗體2F8同五種經(jīng)過加熱的哺乳動(dòng)物肉發(fā)生十分強(qiáng)烈的反應(yīng)，但不同任何加熱的禽肉發(fā)生反應(yīng)。3E12同禽肉反應(yīng)，5D2主要用于雞和火雞的鑒別中。9C6只特定于雞，5H9只用于豬肉。第一組四種單克隆抗體技術(shù)用于經(jīng)水或鹽水浸提過的經(jīng)過加熱處理的肌肉蛋白，它們同3.2單克隆抗體的特點(diǎn)

目前為止，五種免疫球蛋白單31特別的加熱肉提取物發(fā)生了強(qiáng)烈的反應(yīng)，但不同原料肉和加熱處理后的肉相作用。免疫印跡結(jié)果表明所有的單克隆抗體同加熱處理肉提取物中兩條或更多條蛋白帶發(fā)生反應(yīng)，除了5H9以外，但它可檢測(cè)豬肉浸提物中單一帶。5H9也同原料豬肉浸提物的三個(gè)蛋白帶發(fā)生反應(yīng)，帶有24KD的蛋白質(zhì)可以被確認(rèn)為豬肉特定的熱穩(wěn)定肌肉蛋白。特別的加熱肉提取物發(fā)生了強(qiáng)烈的反應(yīng)，但不同原料肉和加熱處理后32所有的單克隆抗體也發(fā)展成對(duì)骨骼肌具有特定的反應(yīng)。表3說明了5H9對(duì)于不同豬肉組織和食物蛋白的免疫反應(yīng)，也同時(shí)說明了5D2的特性反應(yīng).這些單克隆抗體對(duì)于特定骨骼肌而具有的特點(diǎn)不同于別的已報(bào)道的結(jié)果，別的報(bào)道講已觀察到這些抗體對(duì)器官，心肌，或平滑肌的交叉反應(yīng)?；谔囟∪獾膯慰寺】贵w分析可以對(duì)樣品中瘦肉進(jìn)行定量分析檢測(cè)。對(duì)于定量分析來(lái)講抗原均勻的分布在不同動(dòng)物的半天肌肉組織中是十分所有的單克隆抗體也發(fā)展成對(duì)骨骼肌具有特定的反應(yīng)。表33重要的，所以抗原的量決定于同樣品中一定目標(biāo)肌肉組織的分析反應(yīng)，而不用考慮肌肉切面的位置。單克隆抗體5H9用于定量檢測(cè)牛肉制品中不同切面的豬肉含量。無(wú)論是使用間接非競(jìng)爭(zhēng)還是競(jìng)爭(zhēng)性ELISA技術(shù)，都表示在肉不同的切面整個(gè)浸提物蛋白濃度和豬肌肉組織得測(cè)定數(shù)量水平?jīng)]有不同。這些結(jié)果暗示，由單克隆抗體5H9所檢測(cè)得抗原組成對(duì)于制造商十分的適用，它可用于定量檢測(cè)肉樣中豬瘦肉。重要的，所以抗原的量決定于同樣品中一定目標(biāo)肌肉組織的分析反應(yīng)34表4確認(rèn)加熱肉種類時(shí)作用于加熱處理蛋白質(zhì)的單克隆抗體的鑒別特性

單克隆抗體類型亞型鑒別種類抗原蛋白質(zhì)分子重量（kD)2F8IgG2b牛肉，豬肉，羊肉，馬肉，鹿肉

18.5－26.53E12IgG1雞肉，火雞肉，鴨肉

22－345D2IgG1雞肉，火雞肉

22－35表4確認(rèn)加熱肉種類時(shí)作用于加熱處理蛋白質(zhì)的單克隆抗體的鑒359C6IgG1雞肉

120，33.55H9IgG1豬肉

249C6IgG1雞肉120，33.55H9IgG1363.3摻雜肉類的檢測(cè)

如表5所示，間接ELISA反應(yīng)的吸光度或者競(jìng)爭(zhēng)性ELISA反應(yīng)所表達(dá)的抑制百分率和牛肉中豬肉的百分量對(duì)數(shù)之間存在線形關(guān)系。表6所展示的是使用間接和競(jìng)爭(zhēng)ELISA應(yīng)用單克隆抗體5D2來(lái)定量檢測(cè)豬肉中雞肉含量的藥劑反應(yīng)水平曲線,應(yīng)用間接和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)我們的單克隆抗體可以得到一致的結(jié)果，說明這些單克隆抗體在肉制品的快速檢測(cè)或者摻雜肉種類的確認(rèn)方面是十分有效的。3.3摻雜肉類的檢測(cè)

如表5所示，間接ELISA反37檢樣摻雜違規(guī)程度的判斷受限于分析方法所能達(dá)到的最低檢測(cè)水平，應(yīng)用傳統(tǒng)的瓊脂膠體檢測(cè)方法，它的最低檢測(cè)量通常在5－10﹪。ELISA的應(yīng)用已經(jīng)提高了檢測(cè)能力，但不能檢測(cè)肉樣中含量十分低的摻雜肉類。采用了我們的分析程序，這些分析方法對(duì)于摻雜種類含量的檢測(cè)能力在0.5－1﹪之間,可以同大多的已報(bào)道的用于肉種類確認(rèn)的ELISA方法相比。對(duì)于實(shí)際應(yīng)用來(lái)講，摻雜肉1﹪的檢測(cè)能力對(duì)于官方的常規(guī)分析檢測(cè)已足夠。檢樣摻雜違規(guī)程度的判斷受限于分析方法所能達(dá)到的最低檢測(cè)水平38現(xiàn)在確認(rèn)肉種類的商業(yè)ELISA方法一次只能對(duì)單一的種類進(jìn)行定量檢測(cè)。如果把之應(yīng)用到管理當(dāng)中，使用這些ELISA方法來(lái)檢測(cè)大量樣品中復(fù)雜的肉種類是十分費(fèi)時(shí)的而且花費(fèi)十分大，如果用單一檢測(cè)方法來(lái)區(qū)分不同肉的種類會(huì)更昂貴更費(fèi)力。例如應(yīng)用單克隆抗體2F8來(lái)檢測(cè)加熱家禽肉制品中普通的哺乳動(dòng)物肉的種類，應(yīng)用單克隆抗體3E12對(duì)加熱的牛肉或豬肉中的禽肉進(jìn)行單一檢測(cè)，為了進(jìn)一步的確認(rèn)，從最初的檢測(cè)中得到現(xiàn)在確認(rèn)肉種類的商業(yè)ELISA方法一次只能對(duì)39的明確的樣品，接下來(lái)可以用單種類的分析方法進(jìn)行來(lái)確認(rèn)存在的特定種類。的明確的樣品，接下來(lái)可以用單種類的分析方法進(jìn)行來(lái)確認(rèn)存在的特403.4未來(lái)的發(fā)展

單種類的單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展比多種類的發(fā)展更難，主要因?yàn)閷?duì)于特定種類抗原確認(rèn)所檢測(cè)的天然蛋白抗原比動(dòng)物學(xué)相關(guān)種類的檢測(cè)蛋白抗原更稀少。對(duì)于包括特定種類抗體的肌肉蛋白的確認(rèn)可以為單種類單克隆抗體的有效產(chǎn)物提供有價(jià)值的信息。豬類中24kd熱穩(wěn)定肌肉蛋白的發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)單一體的應(yīng)用，來(lái)確認(rèn)特定種類肌肉蛋白同別的種類相似3.4未來(lái)的發(fā)展

單種類的單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展比41或一致。對(duì)于恢復(fù)多種類的抗原有很多影響因素，例如PH值，鹽含量，加熱方法，而且為了獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果也應(yīng)對(duì)基質(zhì)進(jìn)行仔細(xì)的研究。與此同時(shí)也應(yīng)大力推進(jìn)基于單一體的傳感和別的免疫測(cè)定方法和發(fā)展，例如用一步分析可以用于確認(rèn)攙雜的水平。或一致。對(duì)于恢復(fù)多種類的抗原有很多影響因素，例如PH值，鹽含424加熱終點(diǎn)溫度的確認(rèn)

4.1非免疫方法

美國(guó)農(nóng)業(yè)部使用基于減少蛋白溶解性或是酶活性的各種方法來(lái)驗(yàn)證肉制品是否加熱到所需的最低終點(diǎn)溫度。依據(jù)產(chǎn)物的類型和所需的終點(diǎn)加熱溫度來(lái)選擇使用的方法?，F(xiàn)行的方法包括凝結(jié)實(shí)驗(yàn)，作用于加熱溫度低于65℃的牛肉和豬肉產(chǎn)品，酸性磷酸鹽反應(yīng)方法作用于灌裝漢堡，后蝤肉和午餐肉.牛過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)作用于數(shù)量十分少的烘烤和加熱牛肉4加熱終點(diǎn)溫度的確認(rèn)

4.1非免疫方法

美國(guó)農(nóng)業(yè)43，但這些方法自身由于其經(jīng)驗(yàn)主義和主觀主義而受到批評(píng)。在提高現(xiàn)有方法方面已做了十分多的嘗試而且已形成了新的方法可以更準(zhǔn)確的確定加熱終點(diǎn)溫度。許多技術(shù)，例如電泳法，色譜法，微分掃描測(cè)熱計(jì)以及近紅外線光譜法也在嘗試著應(yīng)用在加熱終點(diǎn)溫度確定過程中。大部分這些方法主要的影響因素是解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果的困難性,加熱終點(diǎn)溫度相對(duì)精確的估計(jì)，但這些方法自身由于其經(jīng)驗(yàn)主義和主觀主義而受到批評(píng)。在提高現(xiàn)44，并且需要高尖的設(shè)備，操作人員要進(jìn)行培訓(xùn)。Callins等認(rèn)為乳酸脫氫酶在豬肉和牛肉加熱終點(diǎn)溫度確定中可作為分析檢測(cè)指標(biāo)，因?yàn)槊傅幕钚酝訜嶂薪K點(diǎn)溫度和攙雜肉的加熱終點(diǎn)溫度呈反比例的關(guān)系。另外，許多方法對(duì)內(nèi)源酶的剩余放射性進(jìn)行檢測(cè)，如磷酸激酶，丙酮酸激酶，轉(zhuǎn)氨酶，氨基葡糖酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶，同時(shí)這些檢測(cè)方法也被推薦用于準(zhǔn)確的控制肉制品的加熱過程。，并且需要高尖的設(shè)備，操作人員要進(jìn)行培訓(xùn)。Callins等認(rèn)454.2免疫方法

4.2.1乳酸脫氫酶的抗體

禽類制品所需的加熱終點(diǎn)溫度.火雞胸脯肉足夠加熱過程的指標(biāo)建議是乳酸替代了檢測(cè)酶活性ELISA應(yīng)用單克隆和多克隆抗體檢測(cè)本源乳酸脫氫酶的方法已運(yùn)用到定量測(cè)定減少酶的濃度，進(jìn)而可以確定火雞和牛肉制品的終點(diǎn)加熱溫度，這個(gè)方法可以區(qū)分1℃以下和71.1℃以上加工的火雞胸脯肉的乳酸脫氫酶的濃度，這正是非干制脫氫酶，它最合理4.2免疫方法

4.2.1乳酸脫氫酶的抗體

46的濃度為0.3㎎/kg肉.其結(jié)果不受鹽含量，產(chǎn)品包裝尺寸，煙熏時(shí)間表或是加熱過程之前肉經(jīng)過冷凍貯藏的影響。然而，這種方法在區(qū)分加熱68.9℃和71.1℃火雞大腿肉時(shí)效果不好。因?yàn)樵陔u胸脯和大腿肉中存在的酶有不同的熱穩(wěn)定性。因?yàn)榧∪忸愋秃唾A存條件會(huì)影響個(gè)體酶的數(shù)量和穩(wěn)定性，所以大多方法會(huì)在使用時(shí)遇到困難，這些方法基于的濃度為0.3㎎/kg肉.其結(jié)果不受鹽含量，產(chǎn)品包裝尺寸47特殊酶的濃度或活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而分布在肌肉組織中個(gè)體酶時(shí)變化的。特殊酶的濃度或活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而分布在肌肉組織中個(gè)體酶時(shí)變化的484.2肌肉蛋白質(zhì)的單克隆抗體

基于監(jiān)控平均分布的肌肉蛋白質(zhì)反應(yīng)的方法，可以更好的確定加熱終點(diǎn)溫度。同加熱肉品反應(yīng)的單克隆抗體指示在不同溫度下同加熱肉品產(chǎn)生的不同反應(yīng)，這一觀察結(jié)果暗示了使用單克隆抗體來(lái)檢測(cè)肌肉蛋白質(zhì)熱變性而作為肉制品足夠加熱過程的指示指標(biāo)的潛在性，因?yàn)樵诖朔椒ㄖ惺褂玫腗ABS便是為了應(yīng)用于加熱處理的肌肉蛋白質(zhì)。我們應(yīng)用4.2肌肉蛋白質(zhì)的單克隆抗體

基于監(jiān)控平均分布49ELISA技術(shù)分別使用單克隆抗體2f8和單克隆抗體5d2來(lái)研究不同內(nèi)部加熱溫度的牛肉和雞肉。如表7所示，當(dāng)樣品加熱到60℃或更低時(shí)和可溶牛肉蛋白質(zhì)浸提物相結(jié)合的單克隆抗體2f8是十分少的。當(dāng)加熱溫度從60℃升到66℃時(shí)ELISA反應(yīng)只有輕微的增強(qiáng)。在表7a可以看到牛肉加熱在60－66℃和80℃之間時(shí)免疫方法顯著的增加。在60－66℃范圍內(nèi)ELISA反應(yīng)和加熱樣品溫度是線形ELISA技術(shù)分別使用單克隆抗體2f8和單克隆抗體5d2來(lái)研50關(guān)系，從而這種方法可以預(yù)測(cè)加熱牛肉的加熱終點(diǎn)溫度并且在樣品中有95﹪的可信度，誤差為±1℃。在加熱雞胸脯肉中也觀測(cè)到了單克隆抗體5D2的相同對(duì)應(yīng)溫度但同之呈線性系的溫度范圍為60－74℃.同一定酶或蛋白質(zhì)可溶性減少或活性削減典型測(cè)定相比這種方法有更好的應(yīng)用性，因?yàn)樗梢酝ㄟ^檢測(cè)隨著加熱溫度的增加一定肌肉蛋白質(zhì)的反應(yīng)關(guān)系，從而這種方法可以預(yù)測(cè)加熱牛肉的加熱終點(diǎn)溫度并且在51活性增加來(lái)確定加熱處理的溫度，從對(duì)照曲線中可以得到低于和高于必須為難度的終點(diǎn)加熱溫度。另外，這些單克隆抗體表現(xiàn)出同加熱溫度和持續(xù)的時(shí)間有一定關(guān)系根據(jù)不同終點(diǎn)加熱溫度維持不同時(shí)間所總結(jié)出的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢源_認(rèn)在不同加熱條件下特定肉樣的足夠加熱溫度。然而，對(duì)于單克隆抗體的免疫反應(yīng)和加熱條件同內(nèi)源熱反應(yīng)的關(guān)系還會(huì)在應(yīng)用此技術(shù)時(shí)得到進(jìn)一步的發(fā)展和完善?；钚栽黾觼?lái)確定加熱處理的溫度，從對(duì)照曲線中可以得到低于524.3未來(lái)的發(fā)展

單克隆抗體被認(rèn)為是在加熱變性過程中檢測(cè)蛋白質(zhì)信息微秒變化的十分有用的工具(Collawnetal1988)，通過使用特定變性卵清蛋白的單克隆抗體已經(jīng)確認(rèn)了卵清蛋白熱誘導(dǎo)抗原決定基的不同，表明可以應(yīng)用單克隆抗體來(lái)決定加熱卵清蛋白的溫度。除了決定終點(diǎn)加熱溫度外，應(yīng)用單克隆抗體同加熱處理蛋白質(zhì)4.3未來(lái)的發(fā)展

單克隆抗體被認(rèn)為是在加熱變性過程53相作用對(duì)于研究加熱對(duì)結(jié)構(gòu)的改變是一種十分好的方法，這些架構(gòu)改變同重要食物蛋白質(zhì)的功能特性相關(guān)。我們正在對(duì)使用單克隆抗體監(jiān)測(cè)的加熱終點(diǎn)溫度的機(jī)制進(jìn)行研究。無(wú)論是單克隆抗體認(rèn)識(shí)到的由加熱所引發(fā)的蛋白質(zhì)分子信息的逐漸改變，還是在肉浸提物中觀察到的抗原蛋白質(zhì)分子碎片數(shù)量的增長(zhǎng)，二者都不是十分確定的。未來(lái)的研究應(yīng)該去探索和了解在加熱終點(diǎn)溫度下蛋白質(zhì)標(biāo)記的特性，同時(shí)也應(yīng)找到在不同處理相作用對(duì)于研究加熱對(duì)結(jié)構(gòu)的改變是一種十分好的方法，這些架構(gòu)改54條件下對(duì)于各種肉類足夠加熱的均衡點(diǎn)。條件下對(duì)于各種肉類足夠加熱的均衡點(diǎn)。555結(jié)論

開發(fā)適合的蛋白質(zhì)標(biāo)記來(lái)發(fā)展單克隆抗體，從而可以檢測(cè)不同種類的肉和確認(rèn)預(yù)煮肉品的終點(diǎn)加熱溫度，這對(duì)于食品免疫化學(xué)來(lái)講仍是一個(gè)挑戰(zhàn)，一旦其得到發(fā)展單克隆抗體技術(shù)便可以應(yīng)用在各種免疫檢測(cè)中，而且成功的可能性十分大。十分希望采用新出現(xiàn)的生物技術(shù)，如CDNA資料庫(kù)和抗體連接技術(shù)，有效的應(yīng)用到單克隆抗體中使結(jié)果更準(zhǔn)確并5結(jié)論

開發(fā)適合的蛋白質(zhì)標(biāo)記來(lái)發(fā)展單克隆抗體，從而56可以得到期望的特性。單克隆抗體發(fā)展可以用于檢測(cè)熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，使用一種單克隆抗體試劑探針能夠確認(rèn)原料肉和加熱肉品的種類。單克隆抗體和熱變性可溶蛋白質(zhì)相作用可以應(yīng)用于更寬領(lǐng)域的加熱終點(diǎn)溫度的確認(rèn)中。我們希望未來(lái)發(fā)展可以產(chǎn)生有效的方法從而能夠應(yīng)用在食品工業(yè)中，并且管理機(jī)構(gòu)可以用此來(lái)確保原料肉和加熱肉品的質(zhì)量和安全性。可以得到期望的特性。單克隆抗體發(fā)展可以用于檢測(cè)熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)57

謝謝收看！處理加熱過的肌肉蛋白質(zhì)來(lái)識(shí)別肉的種類以及加熱肉品終點(diǎn)溫度的確定課件58通過單克隆抗體技術(shù)處理加熱過的肌肉蛋白質(zhì)來(lái)識(shí)別肉的種類以及加熱肉品終點(diǎn)溫度的確定

Y-H.P.Hsieh,F.C.Chen,和N.djurdjevic

Auburn大學(xué)食品科學(xué)和營(yíng)養(yǎng)系

AuburnAlabana36849

通過單克隆抗體技術(shù)處理加熱過的肌肉蛋白質(zhì)來(lái)識(shí)別肉的種類以及加59肉制品的質(zhì)量和安全已引起消費(fèi)者以及管理機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注。在生肉制品質(zhì)量控制，加強(qiáng)食物安全和分類管理方面酶連免疫吸附技術(shù)(ELISA)被認(rèn)為是一種十分有效和適合的檢測(cè)分析方法，為了定量的確定加熱產(chǎn)品中攙雜肉的全部種類,在ELAISA技術(shù)中,許多單抗體已經(jīng)被逐漸探索應(yīng)用。在作用于加熱處理過的肌肉蛋白質(zhì)的過程中，單抗體技術(shù)已經(jīng)得到發(fā)展.隨著加熱終點(diǎn)溫度的增ELISA反應(yīng)的程度也隨之增加，可以用MABS肉制品的質(zhì)量和安全已引起消費(fèi)者以及管理機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)60(單克隆抗體技術(shù))來(lái)檢測(cè)肉品中特定的肉種類。因此,MABS可以用作決定預(yù)煮肉品的最大內(nèi)部加熱溫度，以此來(lái)確保產(chǎn)品的安全性.在本節(jié)中主要介紹了現(xiàn)行的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作過程,特點(diǎn)以及MABS的應(yīng)用。(單克隆抗體技術(shù))來(lái)檢測(cè)肉品中特定的肉種類。因此,MA611．

介紹

因?yàn)榻?jīng)濟(jì)的損失，食物過敏及宗教信仰方面的因素，肉品中攙雜不明肉類在很大程度上欺騙了消費(fèi)者。聯(lián)邦法律要求肉制品必須貼上標(biāo)簽以證明包含肉的種類。在許多國(guó)家已報(bào)道了肉類替代現(xiàn)象，例如在英國(guó)馬肉被用作牛肉羊肉。馬肉和袋鼠肉在加拿大發(fā)現(xiàn)被用作出口的牛肉。豬肉被用作牛肉和羊肉出口到中東地區(qū)。隨著食品企業(yè)中機(jī)械去骨肉使用量的增加，最近,人們已越發(fā)的關(guān)注多種加工過程和預(yù)煮1．

介紹

因?yàn)榻?jīng)濟(jì)的損失，食物過62肉類以及分割肉產(chǎn)品。美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全和檢測(cè)服務(wù)局（USDFA-FSIS）的管理?xiàng)l例中對(duì)使用機(jī)械分割肉做了如下的規(guī)定：只要求使用一類肉的肉制品中不要包含任何別的種類的機(jī)械分割肉。然而，由于不正當(dāng)?shù)慕灰缀腿珖?guó)性經(jīng)濟(jì)欺騙現(xiàn)象的存在，國(guó)內(nèi)零售市場(chǎng)中在魚及陸生動(dòng)物肉類產(chǎn)品中混入不知名的雜肉已成為一種普遍現(xiàn)象。研究表明煮制品比原料制品存在更高的攙雜現(xiàn)象，在一種產(chǎn)品中加入多種不知名的肉類也是一個(gè)十分普遍的現(xiàn)象。肉類以及分割肉產(chǎn)品。美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全和檢測(cè)服務(wù)局（U63肉類應(yīng)被煮制足夠的時(shí)間，有利于人類的消化吸收，也可以確保消滅其中的病原微生物。在食用鮮肉和禽類制品時(shí)不正當(dāng)?shù)呐胝{(diào)被認(rèn)為是引起傳染疾病的一個(gè)主要因素。USDA-FSIS已特別規(guī)定肉制品加熱過程的指導(dǎo)方針,對(duì)于每種肉應(yīng)有多種預(yù)煮制品。例如，未干制的禽類制品中心溫度必須加熱到71.1℃，而干制的禽類制品也必須加熱到68.3℃來(lái)殺死沙門氏菌.為了確保消除大腸桿菌O157，烤牛肉的PH值.應(yīng)控制在7左右加熱溫度肉類應(yīng)被煮制足夠的時(shí)間，有利于人類的消化吸收6468.3℃。別的制品PH值為7，加熱溫度為71.7℃。鮮豬肉加熱時(shí)內(nèi)部溫度應(yīng)達(dá)到76.7℃，而且殺死旋毛蟲溫度應(yīng)至少比此溫度再高17℃。然而，一旦肉品中攙雜了別的不知名肉類，由于不知名肉類的存在對(duì)于特定種類的最低內(nèi)部加熱溫度也就失效了。為了阻止肉類的攙雜和減少由于不足夠加熱過程引起的食物傳染疾病的危害，對(duì)于管理監(jiān)督部門來(lái)講,采用可靠分析方法來(lái)執(zhí)行肉類管理程序是十分必要的。68.3℃。別的制品PH值為7，加熱溫度為71.65最理想的方法具有特定，反應(yīng)靈敏，快速，經(jīng)濟(jì)性，高檢測(cè)率的特點(diǎn)，并且能夠提供量性的結(jié)果。盡管在每一種條件下單一的方法并不一定能夠滿足所有的要求，但選擇ELISA用于肉類的檢測(cè)可以滿足最多的要求。多克隆抗（PABS）和單克隆抗體（MABS）技術(shù)都已用在ELISA中，MABS比PABS有更多的優(yōu)點(diǎn)：連續(xù)使用，穩(wěn)定的特性和免疫試劑相近性。在免疫分析中使用MABS可以提供獨(dú)一無(wú)二的試劑，并且可以減少分析最理想的方法具有特定，反應(yīng)靈敏，快速，經(jīng)濟(jì)性，66的費(fèi)用，MABS已被用在原料肉種類的鑒定。因?yàn)樽饔糜谡顟B(tài)下蛋白質(zhì)的抗體在大多情況下不能識(shí)別加熱處理后肉中的蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)室中使用MABS來(lái)檢測(cè)加熱肉品中攙雜的肉的種類。在全部加熱處理過的肉品混合物中MABS可以對(duì)目標(biāo)品種的含量就行定量檢測(cè)，而且可以決定預(yù)煮肉的最大中心加熱溫度。我們主要討論MABS的實(shí)驗(yàn)操作過程特性和它的應(yīng)用.在本章中也對(duì)這兩種領(lǐng)域內(nèi)的現(xiàn)行方法進(jìn)行了大概的評(píng)價(jià)的費(fèi)用，MABS已被用在原料肉種類的鑒定。因?yàn)樽饔糜谡?72攙雜肉品種類的確認(rèn)\

2.1非免疫學(xué)方法

在過去的二十年中，許多用于確認(rèn)肉品種類的非免疫方法例如電泳和色譜層析已經(jīng)有了很大的發(fā)展。對(duì)于蛋白質(zhì)的分離電泳技術(shù)是十分有效的，不同的肌肉蛋白質(zhì)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）經(jīng)常產(chǎn)生相同的蛋白類型，所以在肉種類確認(rèn)方面它的可信度十分的小。等吸附技術(shù)基于蛋白質(zhì)不同的等電點(diǎn)可以把蛋白質(zhì)依據(jù)不同種類而分開，這種技術(shù)被廣泛用于確認(rèn)2攙雜肉品種類的確認(rèn)\

2.1非免疫學(xué)方法

68魚肉的種類，也可以用于區(qū)分不同種類的原料肉。但是，當(dāng)混合肉中存在多種肉或蛋白添加劑時(shí),很難解釋其檢測(cè)結(jié)果。色譜法如氣相色譜,液體色譜和高精度色譜已經(jīng)被廣泛用于肉種類的確認(rèn)，這種方法是基于對(duì)肉樣中脂肪酸成分，組氨基酸或蛋白質(zhì)形狀的檢驗(yàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些方法可以區(qū)分不同個(gè)體肉的種類，但是由于色譜類型復(fù)雜度的增加，這些方法在檢測(cè)復(fù)合肉品中摻雜肉的種類時(shí)會(huì)失效。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，包括魚肉的種類，也可以用于區(qū)分不同種類的原料肉。但是，當(dāng)混合肉中69DNA雜交技術(shù)，聚合酶鏈反應(yīng)和碎片分析技術(shù)已對(duì)法醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了革命性的變革，對(duì)于食品科學(xué)也是如此。DNA雜交技術(shù)已被用于多中肉類品種的確認(rèn),下一步準(zhǔn)備也進(jìn)行基因組DNA或克隆DNA同目標(biāo)DNA的雜交，同時(shí)用顏色或自行x射線照相技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)工作。這些方法在用于煮制肉類品種確認(rèn)方面是獨(dú)特的并且十分有用,但是在確認(rèn)聯(lián)系密切肉類時(shí)效果不好下一步準(zhǔn)備顯示牛，綿羊，山羊DNA雜交技術(shù)，聚合酶鏈反應(yīng)和碎片分析技術(shù)已對(duì)法醫(yī)學(xué)70基因組DNA水平上的相互交叉反應(yīng)。通過混合未標(biāo)記DNA修飾DNA雜交可以減少交叉反應(yīng)，從而可以從交叉雜交種類中區(qū)分綿羊和山羊，大約有10﹪的區(qū)別限度。綿羊和山羊肉類的區(qū)分是使用直接連續(xù)技術(shù)來(lái)對(duì)比核苷酸的次序而實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)也分析了限制核苷酸內(nèi)切酶聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物，由于費(fèi)用高和操作的復(fù)雜性，這些基于DNA水平的技術(shù)未被常規(guī)分析方法所采納?；蚪MDNA水平上的相互交叉反應(yīng)。通過混合未標(biāo)記DNA修飾712.2免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法是基于特定抗體－抗原反應(yīng)，它適用于分析復(fù)雜混合物中的成分，同時(shí)此成分有最低的檢測(cè)量。從本世紀(jì)開始，免疫技術(shù)已被用于動(dòng)物肉類品種的確認(rèn)。免疫技術(shù)的先進(jìn)之處在于它可以在很大程度是提高檢測(cè)的敏感性和結(jié)果的準(zhǔn)確性。沉淀環(huán)實(shí)驗(yàn)是免疫分析方法的一個(gè)簡(jiǎn)單形式，它的原理是在實(shí)驗(yàn)管中抗血清和肉的抗原相匯處可產(chǎn)生可2.2免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法是基于特定抗體－抗原反72見的環(huán)。血凝抑制實(shí)驗(yàn)是基于阻止抗原血清和它的同類抗原之間積極的反應(yīng)，而此同種類抗原被同種外來(lái)羊的紅血細(xì)胞所包裹。瓊脂膠體免疫擴(kuò)散，雙層免疫擴(kuò)散技術(shù)起源于Ouchyeriony(1948)的描述，同時(shí)也涉及抗血清和抗原在半固體瓊脂膠體中的擴(kuò)散。經(jīng)過隔夜培養(yǎng)后在抗體和它對(duì)應(yīng)的抗原相匯處形成一個(gè)可見的不透光的帶。USDA-FSIS肉類檢查員對(duì)這種技術(shù)做了一定的修繕，使用標(biāo)定的試劑紙片和提前準(zhǔn)備的瓊脂平板使此種見的環(huán)。血凝抑制實(shí)驗(yàn)是基于阻止抗原血清和它的同類抗原73技術(shù)在檢測(cè)原料肉的種類時(shí)更加便利.由于瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)靈敏性易變化，培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)，并且非肉的成分干擾大，所以限制了它在完整鮮肉分析中的應(yīng)用。免疫分析經(jīng)常用在臨床處置中，但是一項(xiàng)研究指出,用I標(biāo)記免疫試劑檢測(cè)出牛肉中存在5﹪的其他成分。由于放射免疫分析技術(shù)要用有害的放射材料，并且要用閃爍計(jì)數(shù)器，所以限制了它在日常檢驗(yàn)和檢測(cè)肉種類中的應(yīng)用。ELISA由于下面的優(yōu)點(diǎn)而在肉種類技術(shù)在檢測(cè)原料肉的種類時(shí)更加便利.由于瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)靈74的確認(rèn)中得到了十分廣泛的應(yīng)用：不用太貴的科學(xué)儀器，易于操作，免疫試劑用量小，可應(yīng)用于大數(shù)量，寬領(lǐng)域的檢測(cè)。經(jīng)常應(yīng)用的有三種類型:間接ELISA競(jìng)爭(zhēng)，ELISA,夾心ELISA。間接ELISA,先把抗原吸入一個(gè)微量平板上，之后相反動(dòng)物的抗體與抗原結(jié)合吸附在固體層上，通過二者與隨后加入的反免疫球蛋白的結(jié)合，通過外來(lái)添加酶而形成的顏色.它可以檢測(cè)到抗原與抗體的結(jié)合物。競(jìng)爭(zhēng)ELISA技術(shù)是基于提取樣品中有限的抗的確認(rèn)中得到了十分廣泛的應(yīng)用：不用太貴的科學(xué)儀器，易于操作，75體，而自由抗原和與固體相結(jié)合的抗原與抗體競(jìng)爭(zhēng)相結(jié)合。固體相抗原結(jié)合的特定種類抗原的限制數(shù)同液體相中的抗原數(shù)成正比。夾心ELISA使用固體相上的抗體作為結(jié)合抗體。另一種抗體用作檢測(cè)抗體。所以，這便形成了一個(gè)夾心，抗原位于中間，抗體在抗原分子的兩側(cè)。在表1中對(duì)不同類型ELISA用各種肉的抗原對(duì)原料肉的確認(rèn)進(jìn)行了總結(jié)。最近，單抗體技術(shù)也應(yīng)用在ELISA中來(lái)對(duì)原料肉進(jìn)行確認(rèn)，ELISA也用于煮制肉品種類的確認(rèn)中。體，而自由抗原和與固體相結(jié)合的抗原與抗體競(jìng)爭(zhēng)相結(jié)合。固體相762.3抗體的來(lái)源

在使用酶免疫測(cè)定來(lái)確認(rèn)肉的種類成功的發(fā)展的過程中，最重要的是特定種類的抗體，不同種動(dòng)物需要不同的免疫試劑。傳統(tǒng)的來(lái)講，在ELISA中應(yīng)用的單抗體來(lái)自免疫動(dòng)物的血清。多克隆抗體技術(shù)在自然界中是外源的，亞群和特定種類抗原或相反種類抗原相結(jié)合。因此可以十分容易的觀測(cè)到血清和相關(guān)種類抗原的交叉反應(yīng)。在檢測(cè)程度標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)展過程中，一組抗體親和力和結(jié)合2.3抗體的來(lái)源

在使用酶免疫測(cè)定來(lái)確認(rèn)肉的種類77特性的變化也引起了人們的關(guān)注。同多克隆抗體技術(shù)相反，單克隆抗體技術(shù)的來(lái)源－單細(xì)胞鏈在自然界中是同源的。它們來(lái)自融化得抗體分泌物Blymphocytes,而這種分泌物又來(lái)自患有骨髓瘤的免疫老鼠。融化的產(chǎn)物叫雜交細(xì)胞，可以在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且可以繼續(xù)的分泌抗體。經(jīng)過仔細(xì)的鏡檢和亞克隆后，可以挑選出穩(wěn)定的雜交細(xì)胞鏈，它可以分泌出針對(duì)某一特定抗原的抗體，而且產(chǎn)生抗體十分頻繁。采用單抗體的方法來(lái)對(duì)特性的變化也引起了人們的關(guān)注。同多克隆抗體技術(shù)相反，單克隆抗78肉的種類進(jìn)行免疫分析時(shí)，應(yīng)保證連續(xù)供應(yīng)統(tǒng)一的免疫試劑，也應(yīng)減少標(biāo)準(zhǔn)分析程序。肉的種類進(jìn)行免疫分析時(shí)，應(yīng)保證連續(xù)供應(yīng)統(tǒng)一的免疫試劑，也應(yīng)減792.4抗原的選擇大多數(shù)對(duì)于原料肉種類的免疫檢測(cè)方法都采用多克隆方法來(lái)處理整個(gè)血清或血清蛋白。因?yàn)檠宓鞍椎拇嬖诳赡苁潜仨毜模∪饨M織中殘余的血漿成分會(huì)發(fā)生變化，那么便意味著肌肉組織的存在，進(jìn)而可以得出結(jié)論：用這些多克隆技術(shù)來(lái)定量的估計(jì)攙雜物的量是不可靠的。肌肉蛋白質(zhì)的存在是顯著的,預(yù)示了雞肉2.4抗原的選擇大多80組織存在的可能性比血清蛋白存在的可能性要大。對(duì)于肉種類的多克隆技術(shù)已用于可溶性粗蛋白的分析中或凈化肌肉成分，例如肌鈣蛋白和肌紅蛋白。這些檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于容易獲得提取樣品，更重要的一點(diǎn)在于對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的改進(jìn)與發(fā)展。不溶性肌肉蛋白如連接蛋白也可以用于單抗體的分析方法中，來(lái)確認(rèn)原料禽肉的種類。然而不溶性蛋白的提取需要特殊的步驟。這些方法毫無(wú)疑問的可以應(yīng)用于法律事件的檢測(cè)中，但組織存在的可能性比血清蛋白存在的可能性要大。對(duì)于肉種類的多克81不適用于常規(guī)檢驗(yàn)分析或產(chǎn)地檢驗(yàn)。因?yàn)橥ㄟ^加熱處理后，大多的蛋白質(zhì)變性并且成為不可溶的，所以使用抗體來(lái)處置本源蛋白質(zhì)的方法不可以用于加熱處理過的肉類。對(duì)于加熱的肉類的確認(rèn)也應(yīng)用熱穩(wěn)定蛋白。在解決特定種類熱穩(wěn)定性組成方面已做了十分大的努力。用IEF方法，Jones和Mortiner(1985)說明了來(lái)自腎上腺和肌肉組織的BE抗原蛋白具有熱穩(wěn)定性。但是不同類型BE抗原的特性是顯著不同的，Sherikar使用SDS-聚不適用于常規(guī)檢驗(yàn)分析或產(chǎn)地檢驗(yàn)。82丙稀酰胺凝膠電泳的方法檢測(cè)了不同種類的BE抗原，并且得出結(jié)論在BE蛋白中肌鈣蛋白T屬于特定種類蛋白部分。沒有經(jīng)過加熱處理的從肌肉組織中分離的具有抗熱性的糖蛋白應(yīng)用于多克隆抗體技術(shù)中。這些抗體已應(yīng)用于夾心ELISA中用于鑒別加熱和罐裝肉類食物中。這些方法在商業(yè)檢測(cè)中是十分有效的，并且也應(yīng)用于USDA對(duì)加熱肉品種類確認(rèn)的調(diào)查中。大多對(duì)于加熱肉品種類的確認(rèn)中大都使用多克隆抗體技術(shù)方法.最近在丙稀酰胺凝膠電泳的方法檢測(cè)了不同種類的BE抗原，并且得出結(jié)83我們實(shí)驗(yàn)室中對(duì)單克隆抗體技術(shù)確認(rèn)加熱肉種類的研究中也取得了一定的進(jìn)展。用于加熱處理肉類蛋白鑒別的單克隆抗體技術(shù)也可用于原料肉的鑒別中，因?yàn)樵跍?zhǔn)備檢測(cè)樣品時(shí)這些原料肉可以十分容易的被加熱處理。我們實(shí)驗(yàn)室中對(duì)單克隆抗體技術(shù)確認(rèn)加熱肉種類的研究中也843單克隆抗體技術(shù)用于加熱處理肌肉蛋白的確認(rèn)

3.1單克隆抗體介紹

用于熱穩(wěn)定性或抗熱性蛋白的不同抗原已經(jīng)用于發(fā)展抗體技術(shù)來(lái)確認(rèn)加熱肉品的種類。熱穩(wěn)定性這一個(gè)詞在字典中被十分清晰的定義，大多情況下，它指經(jīng)過加熱處理的肉類浸提物中保持可溶性和抗原性的完整蛋白或蛋白碎片。如果一種特定分析蛋白已知應(yīng)用于一種特定的種類確認(rèn),那么在免疫分析技術(shù)中3單克隆抗體技術(shù)用于加熱處理肌肉蛋白的確認(rèn)

3.1單克隆85使用提純蛋白可以增加對(duì)于特定種類抗原決定基的免疫反應(yīng)機(jī)會(huì)。然而對(duì)于雜交瘤的分泌物并不一定完全需要提純蛋白作為抗原，由于在挑選適宜特定種類蛋白主要方面缺少足夠多的知識(shí)技術(shù)，所以在單克隆抗體技術(shù)中我們使用加熱處理過的可溶性粗肌肉蛋白作為免疫源。在加熱之后，純的肉類蛋白質(zhì)顯著減少，這樣在提取物中只有熱穩(wěn)定性或熱抗性的部分蛋白質(zhì)仍保持可溶性。對(duì)期望的特性應(yīng)用MABS（單克隆抗體技術(shù)）檢測(cè)使用提純蛋白可以增加對(duì)于特定種類抗原決定基的免疫反應(yīng)機(jī)會(huì)。然86時(shí)應(yīng)選擇雜交克隆分泌物，而且必須要經(jīng)過仔細(xì)的鏡檢和亞克隆。對(duì)于準(zhǔn)備抗原有兩種方法:1)用蒸餾水或鹽水對(duì)粗瘦肉進(jìn)行攪拌，過濾物可以作為免疫原。2）瘦肉混于0.15MNACL中，沸水加熱并且離心.上層液121℃30分鐘高溫滅菌過濾，用90﹪乙醇進(jìn)行萃取，沉淀，干燥物溶于鹽溶液中備用。來(lái)自免疫老鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后可作為雜交產(chǎn)物。在我們的實(shí)驗(yàn)室中，遵守由Kohler和Milstern描述的一般程序，那便是在隨后時(shí)應(yīng)選擇雜交克隆分泌物，而且必須要經(jīng)過仔細(xì)的鏡檢和亞克隆。對(duì)87的步驟中要進(jìn)行必要的修飾。ELISA鏡檢是用于經(jīng)過選擇實(shí)驗(yàn)的與抗原對(duì)應(yīng)的克隆體，同時(shí)用異種的浸提物和別的食物蛋白通過交叉反應(yīng)來(lái)穩(wěn)定雜交物。雜交產(chǎn)物具有我們所期望的特性，之后通過限定性稀釋程序?qū)χ寺≈辽賰纱我垣@得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞鏈。SDS和免疫點(diǎn)技術(shù)用于確認(rèn)每種單克隆肉類浸提物種抗原的成分。的步驟中要進(jìn)行必要的修飾。ELISA鏡檢是用于經(jīng)過選擇實(shí)驗(yàn)的883.2單克隆抗體的特點(diǎn)

目前為止，五種免疫球蛋白單克隆抗體技術(shù)在實(shí)驗(yàn)中已用于摻雜肉種類的檢測(cè)。單克隆抗體2F8同五種經(jīng)過加熱的哺乳動(dòng)物肉發(fā)生十分強(qiáng)烈的反應(yīng)，但不同任何加熱的禽肉發(fā)生反應(yīng)。3E12同禽肉反應(yīng)，5D2主要用于雞和火雞的鑒別中。9C6只特定于雞，5H9只用于豬肉。第一組四種單克隆抗體技術(shù)用于經(jīng)水或鹽水浸提過的經(jīng)過加熱處理的肌肉蛋白，它們同3.2單克隆抗體的特點(diǎn)

目前為止，五種免疫球蛋白單89特別的加熱肉提取物發(fā)生了強(qiáng)烈的反應(yīng)，但不同原料肉和加熱處理后的肉相作用。免疫印跡結(jié)果表明所有的單克隆抗體同加熱處理肉提取物中兩條或更多條蛋白帶發(fā)生反應(yīng)，除了5H9以外，但它可檢測(cè)豬肉浸提物中單一帶。5H9也同原料豬肉浸提物的三個(gè)蛋白帶發(fā)生反應(yīng)，帶有24KD的蛋白質(zhì)可以被確認(rèn)為豬肉特定的熱穩(wěn)定肌肉蛋白。特別的加熱肉提取物發(fā)生了強(qiáng)烈的反應(yīng)，但不同原料肉和加熱處理后90所有的單克隆抗體也發(fā)展成對(duì)骨骼肌具有特定的反應(yīng)。表3說明了5H9對(duì)于不同豬肉組織和食物蛋白的免疫反應(yīng)，也同時(shí)說明了5D2的特性反應(yīng).這些單克隆抗體對(duì)于特定骨骼肌而具有的特點(diǎn)不同于別的已報(bào)道的結(jié)果，別的報(bào)道講已觀察到這些抗體對(duì)器官，心肌，或平滑肌的交叉反應(yīng)?；谔囟∪獾膯慰寺】贵w分析可以對(duì)樣品中瘦肉進(jìn)行定量分析檢測(cè)。對(duì)于定量分析來(lái)講抗原均勻的分布在不同動(dòng)物的半天肌肉組織中是十分所有的單克隆抗體也發(fā)展成對(duì)骨骼肌具有特定的反應(yīng)。表91重要的，所以抗原的量決定于同樣品中一定目標(biāo)肌肉組織的分析反應(yīng)，而不用考慮肌肉切面的位置。單克隆抗體5H9用于定量檢測(cè)牛肉制品中不同切面的豬肉含量。無(wú)論是使用間接非競(jìng)爭(zhēng)還是競(jìng)爭(zhēng)性ELISA技術(shù)，都表示在肉不同的切面整個(gè)浸提物蛋白濃度和豬肌肉組織得測(cè)定數(shù)量水平?jīng)]有不同。這些結(jié)果暗示，由單克隆抗體5H9所檢測(cè)得抗原組成對(duì)于制造商十分的適用，它可用于定量檢測(cè)肉樣中豬瘦肉。重要的，所以抗原的量決定于同樣品中一定目標(biāo)肌肉組織的分析反應(yīng)92表4確認(rèn)加熱肉種類時(shí)作用于加熱處理蛋白質(zhì)的單克隆抗體的鑒別特性

單克隆抗體類型亞型鑒別種類抗原蛋白質(zhì)分子重量（kD)2F8IgG2b牛肉，豬肉，羊肉，馬肉，鹿肉

18.5－26.53E12IgG1雞肉，火雞肉，鴨肉

22－345D2IgG1雞肉，火雞肉

22－35表4確認(rèn)加熱肉種類時(shí)作用于加熱處理蛋白質(zhì)的單克隆抗體的鑒939C6IgG1雞肉

120，33.55H9IgG1豬肉

249C6IgG1雞肉120，33.55H9IgG1943.3摻雜肉類的檢測(cè)

如表5所示，間接ELISA反應(yīng)的吸光度或者競(jìng)爭(zhēng)性ELISA反應(yīng)所表達(dá)的抑制百分率和牛肉中豬肉的百分量對(duì)數(shù)之間存在線形關(guān)系。表6所展示的是使用間接和競(jìng)爭(zhēng)ELISA應(yīng)用單克隆抗體5D2來(lái)定量檢測(cè)豬肉中雞肉含量的藥劑反應(yīng)水平曲線,應(yīng)用間接和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)我們的單克隆抗體可以得到一致的結(jié)果，說明這些單克隆抗體在肉制品的快速檢測(cè)或者摻雜肉種類的確認(rèn)方面是十分有效的。3.3摻雜肉類的檢測(cè)

如表5所示，間接ELISA反95檢樣摻雜違規(guī)程度的判斷受限于分析方法所能達(dá)到的最低檢測(cè)水平，應(yīng)用傳統(tǒng)的瓊脂膠體檢測(cè)方法，它的最低檢測(cè)量通常在5－10﹪。ELISA的應(yīng)用已經(jīng)提高了檢測(cè)能力，但不能檢測(cè)肉樣中含量十分低的摻雜肉類。采用了我們的分析程序，這些分析方法對(duì)于摻雜種類含量的檢測(cè)能力在0.5－1﹪之間,可以同大多的已報(bào)道的用于肉種類確認(rèn)的ELISA方法相比。對(duì)于實(shí)際應(yīng)用來(lái)講，摻雜肉1﹪的檢測(cè)能力對(duì)于官方的常規(guī)分析檢測(cè)已足夠。檢樣摻雜違規(guī)程度的判斷受限于分析方法所能達(dá)到的最低檢測(cè)水平96現(xiàn)在確認(rèn)肉種類的商業(yè)ELISA方法一次只能對(duì)單一的種類進(jìn)行定量檢測(cè)。如果把之應(yīng)用到管理當(dāng)中，使用這些ELISA方法來(lái)檢測(cè)大量樣品中復(fù)雜的肉種類是十分費(fèi)時(shí)的而且花費(fèi)十分大，如果用單一檢測(cè)方法來(lái)區(qū)分不同肉的種類會(huì)更昂貴更費(fèi)力。例如應(yīng)用單克隆抗體2F8來(lái)檢測(cè)加熱家禽肉制品中普通的哺乳動(dòng)物肉的種類，應(yīng)用單克隆抗體3E12對(duì)加熱的牛肉或豬肉中的禽肉進(jìn)行單一檢測(cè)，為了進(jìn)一步的確認(rèn)，從最初的檢測(cè)中得到現(xiàn)在確認(rèn)肉種類的商業(yè)ELISA方法一次只能對(duì)97的明確的樣品，接下來(lái)可以用單種類的分析方法進(jìn)行來(lái)確認(rèn)存在的特定種類。的明確的樣品，接下來(lái)可以用單種類的分析方法進(jìn)行來(lái)確認(rèn)存在的特983.4未來(lái)的發(fā)展

單種類的單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展比多種類的發(fā)展更難，主要因?yàn)閷?duì)于特定種類抗原確認(rèn)所檢測(cè)的天然蛋白抗原比動(dòng)物學(xué)相關(guān)種類的檢測(cè)蛋白抗原更稀少。對(duì)于包括特定種類抗體的肌肉蛋白的確認(rèn)可以為單種類單克隆抗體的有效產(chǎn)物提供有價(jià)值的信息。豬類中24kd熱穩(wěn)定肌肉蛋白的發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)單一體的應(yīng)用，來(lái)確認(rèn)特定種類肌肉蛋白同別的種類相似3.4未來(lái)的發(fā)展

單種類的單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展比99或一致。對(duì)于恢復(fù)多種類的抗原有很多影響因素，例如PH值，鹽含量，加熱方法，而且為了獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果也應(yīng)對(duì)基質(zhì)進(jìn)行仔細(xì)的研究。與此同時(shí)也應(yīng)大力推進(jìn)基于單一體的傳感和別的免疫測(cè)定方法和發(fā)展，例如用一步分析可以用于確認(rèn)攙雜的水平?；蛞恢?。對(duì)于恢復(fù)多種類的抗原有很多影響因素，例如PH值，鹽含1004加熱終點(diǎn)溫度的確認(rèn)

4.1非免疫方法

美國(guó)農(nóng)業(yè)部使用基于減少蛋白溶解性或是酶活性的各種方法來(lái)驗(yàn)證肉制品是否加熱到所需的最低終點(diǎn)溫度。依據(jù)產(chǎn)物的類型和所需的終點(diǎn)加熱溫度來(lái)選擇使用的方法?，F(xiàn)行的方法包括凝結(jié)實(shí)驗(yàn)，作用于加熱溫度低于65℃的牛肉和豬肉產(chǎn)品，酸性磷酸鹽反應(yīng)方法作用于灌裝漢堡，后蝤肉和午餐肉.牛過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)作用于數(shù)量十分少的烘烤和加熱牛肉4加熱終點(diǎn)溫度的確認(rèn)

4.1非免疫方法

美國(guó)農(nóng)業(yè)101，但這些方法自身由于其經(jīng)驗(yàn)主義和主觀主義而受到批評(píng)。在提高現(xiàn)有方法方面已做了十分多的嘗試而且已形成了新的方法可以更準(zhǔn)確的確定加熱終點(diǎn)溫度。許多技術(shù)，例如電泳法，色譜法，微分掃描測(cè)熱計(jì)以及近紅外線光譜法也在嘗試著應(yīng)用在加熱終點(diǎn)溫度確定過程中。大部分這些方法主要的影響因素是解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果的困難性,加熱終點(diǎn)溫度相對(duì)精確的估計(jì)，但這些方法自身由于其經(jīng)驗(yàn)主義和主觀主義而受到批評(píng)。在提高現(xiàn)102，并且需要高尖的設(shè)備，操作人員要進(jìn)行培訓(xùn)。Callins等認(rèn)為乳酸脫氫酶在豬肉和牛肉加熱終點(diǎn)溫度確定中可作為分析檢測(cè)指標(biāo)，因?yàn)槊傅幕钚酝訜嶂薪K點(diǎn)溫度和攙雜肉的加熱終點(diǎn)溫度呈反比例的關(guān)系。另外，許多方