瓊脂糖凝膠電泳詳細過程與步驟課件

瓊脂糖凝膠電泳

Agarosegelelectrophoresis

天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉是從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。

瓊脂糖（agarose）半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷D-半乳糖

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲2.對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測定6.樣品易回收，常用于制備。瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)點一、實驗?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳分離DNA的原理和方法DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。二、實驗原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。溴化乙錠（EthidiumBromide,

EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。三、實驗材料、器具及藥品質(zhì)粒DNA樣品。電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。瓊脂糖，1XTBE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X載樣緩沖液四、實驗步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。⑸打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約30min-60min。123M4、凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠

溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加。5、所用的電壓

低電壓時DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。6、瓊脂糖種類

常見的有兩種：標準瓊脂糖和低熔點瓊脂糖；

不同類型瓊脂糖的性質(zhì)

瓊脂糖類型凝結(jié)溫度/℃熔化溫度/℃

標準瓊脂糖35~3890~95不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40~4285~90

高強度瓊脂糖34~4385~95

修飾的低熔點/凝點瓊脂糖25~3563~653565

超低熔點8~1540~45

低黏性低熔點瓊脂糖25~307038853075常用的電泳緩沖液4℃保存?zhèn)溆?7、電泳緩沖液TAE和TBE電泳緩沖液比較都是常用電泳緩沖液，二者相比：1）TAE的緩沖容量較低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE比TAE花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE中遷移快10%；4）對于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，對于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。6×凝膠載樣緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍4℃0.25%二甲苯氰40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍室溫0.25%二甲苯氰15%聚蔗糖(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍4℃0.25%二甲苯氰30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍4℃40%(m/V)蔗糖水溶液瓊脂糖凝膠中DNA的檢測

通過染色,紫外燈下檢測。主要采用溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法。凝膠中DNA的成像

可以用透射或入射紫外光對EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計算機觀察。關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳的實驗技巧和方法\幾點注意事項1）加樣時槍頭不要碰壞凝膠壁，否則DNA的帶型將不會整齊，加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中的溶液，以趕走樣品空中的氣泡。2）每孔最大DNA上樣量決定于DNA樣品片段的大小、數(shù)目及樣品孔形狀與容量。3）應(yīng)注意每孔最大上樣容量及樣品孔體積，以免加樣時樣品流入附近樣品孔造成交叉污染，影響結(jié)果分析。4）在實驗加樣中不一定每一個樣品都換一個槍頭，可在陽極槽中反復(fù)吸打電泳緩沖液以清洗。（對于Southern印跡轉(zhuǎn)移和需要回收DNA片段的電泳，則應(yīng)該每一個樣品用一個槍頭加樣，避免樣品交叉污染。）5）凝膠中加入EB進行電泳，便于紫外線下觀察電泳狀態(tài)，但EB會導致線形DNA遷移率下降，這在酶切質(zhì)粒與空白對照質(zhì)粒一起電泳時應(yīng)值得注意。6）電泳過程中，溴化乙錠向負極移動，與DNA泳動的方向相反