環(huán)境微生物試驗(yàn)常州大學(xué)課件

環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常州大學(xué)趙遠(yuǎn)孫向武環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常州大學(xué)趙遠(yuǎn)孫向武實(shí)驗(yàn)概況環(huán)境微生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)教材包括（1）基礎(chǔ)微生物學(xué)技術(shù)，（2）現(xiàn)代微生物學(xué)技術(shù)，共10個實(shí)驗(yàn)。包括微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)、在環(huán)境科學(xué)及環(huán)境工程中應(yīng)用、現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)等有關(guān)內(nèi)容。對每個實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容，力求較詳細(xì)的介紹每種方法的技術(shù)特點(diǎn)和基本操作要求，反映現(xiàn)代環(huán)境微生物學(xué)最新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時兼具實(shí)用性和可操作性。目的：是使學(xué)生得到微生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)、基本操作和技能訓(xùn)練，同時也初步掌握現(xiàn)代微生物技術(shù)的操作方法。本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書主要用于環(huán)境與安全工程學(xué)院環(huán)境工程、給水排水專業(yè)和環(huán)境科學(xué)專業(yè)的本科生的微生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教材。實(shí)驗(yàn)概況環(huán)境微生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)教材包括（1）基礎(chǔ)微生物學(xué)技術(shù)，（實(shí)驗(yàn)守則一、學(xué)生在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持安靜，不得高聲喧嘩、打鬧，不準(zhǔn)隨地吐痰、抽煙、亂丟紙屑和雜物，不準(zhǔn)將食物帶入實(shí)驗(yàn)室。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)穿實(shí)驗(yàn)服，服從指導(dǎo)老師和實(shí)驗(yàn)員的安排。二、學(xué)生必須按時到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，遲到10分鐘不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，并按曠課處理。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中不得脫離崗位，必須離開時，需經(jīng)實(shí)驗(yàn)老師同意。三、實(shí)驗(yàn)前要認(rèn)真做好預(yù)習(xí)，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?nèi)容、方法和步驟，閱讀有關(guān)儀器和設(shè)備說明書。學(xué)生應(yīng)在指定的實(shí)驗(yàn)崗位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不準(zhǔn)擅自變換實(shí)驗(yàn)崗位。四、應(yīng)按操作規(guī)程使用實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備，不懂即問，不可盲目、野蠻操作。五、在實(shí)驗(yàn)過程中要虛心聽取指導(dǎo)老師和實(shí)驗(yàn)員的指導(dǎo)，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，按規(guī)定格式做好原始記錄，經(jīng)老師審閱同意后，方可結(jié)束實(shí)驗(yàn)，做到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠、真實(shí)。六、愛護(hù)儀器設(shè)備，除指定使用的儀器外，未經(jīng)指導(dǎo)老師許可，不得自行拆卸、插拔儀器，不得隨意動用與本次實(shí)驗(yàn)無關(guān)的設(shè)備及用品，不得將非本人物品帶出實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)用品不準(zhǔn)挪作他用，違者教師有權(quán)令其終止實(shí)驗(yàn)并離開實(shí)驗(yàn)室。七、對實(shí)驗(yàn)室公物、門窗、水電、用具、儀器和設(shè)備，要妥善保管和愛護(hù)，凡損壞儀器設(shè)備者應(yīng)及時向指導(dǎo)老師或?qū)嶒?yàn)員報(bào)告。如果因違反實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度而造成設(shè)備的損壞、丟失、實(shí)驗(yàn)室軟環(huán)境的破壞等事故，實(shí)驗(yàn)室有權(quán)責(zé)令當(dāng)事人寫出書面檢查，并按相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理。八、要節(jié)約水、電和藥品。對有毒有害物品必須在教師指導(dǎo)下進(jìn)行處理，不準(zhǔn)亂扔、亂放。九、學(xué)生實(shí)驗(yàn)完畢后，應(yīng)按規(guī)定程序關(guān)閉儀器、設(shè)備、電源和水源，并做到清洗器皿、清理桌子和清掃地面。十、若實(shí)驗(yàn)室發(fā)生諸如火災(zāi)等重大事故時，應(yīng)及時切斷電源，并在指導(dǎo)老師的指揮下按次序撤離。實(shí)驗(yàn)守則一、學(xué)生在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持安靜，不得高聲喧嘩、打鬧，不準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是一門操作技能較強(qiáng)的課程。通過本課程學(xué)習(xí)，要求學(xué)生能牢固地建立無菌概念，掌握環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)的一套基本操作技術(shù)；樹立嚴(yán)謹(jǐn)、求實(shí)的科學(xué)態(tài)度，提高觀察、分析問題和解決問題的能力；樹立勤儉節(jié)約、愛護(hù)公物、相互協(xié)作的優(yōu)良作風(fēng)。為了提高教學(xué)效果，保證實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)室的安全，實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)如下：

1每次實(shí)驗(yàn)前必須充分預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)教材，以了解實(shí)驗(yàn)的目的、原理和方法。初步熟悉實(shí)驗(yàn)操作中的主要步驟和環(huán)節(jié)、對整個實(shí)驗(yàn)的安排做到先后有序、有條不紊和避免差錯。

2．非必要的物品不要帶進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，必須帶進(jìn)的物品（包括帽子、圍巾等）應(yīng)放在不影響實(shí)驗(yàn)操作的地方。

3．每次實(shí)驗(yàn)前須用濕布擦凈臺面，必要時可用70%酒精或“新潔爾滅”溶液（01％濃度）。實(shí)驗(yàn)前要洗手，以減少染菌的幾率。

4．微生物實(shí)驗(yàn)中最重要的一環(huán)，就是要嚴(yán)格地進(jìn)行無菌操作，防止雜菌感染。為此，在實(shí)驗(yàn)過程中，每個人要嚴(yán)格做到以下幾點(diǎn)：■在進(jìn)行接種操作時，要關(guān)閉門窗，以防止空氣對流。■接種時盡量不要走動和說話，以免因塵埃飛揚(yáng)和唾沫四濺，而導(dǎo)致雜菌污染。■用過的帶菌移液管、滴管或涂布棒等，在實(shí)驗(yàn)后應(yīng)立即投入5％石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗，以免污染環(huán)境?！鲈谇逑磶Ь呐囵B(yǎng)皿、三角燒瓶或試管等之前，應(yīng)先煮沸半小時或進(jìn)行蒸汽滅菌。

5．凡需進(jìn)行培養(yǎng)的材料，都應(yīng)注明菌名、接種日期及操作者姓名(或組別)，放在指定的溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，按時觀察并如實(shí)地記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果和按時交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。6．實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙，不準(zhǔn)吃東西，以免感染。7．節(jié)約藥品和水、電、煤氣。8．各種儀器應(yīng)按要求操作，用畢按原樣放置。9．實(shí)驗(yàn)完畢、立即關(guān)閉煤氣，整理和擦凈臺面，離開實(shí)驗(yàn)室之前要用肥皂或清潔劑洗手，值日生負(fù)責(zé)打掃實(shí)驗(yàn)室及進(jìn)行安全檢查（門窗、水、電、煤氣等）。10．意外事故的處理：◆如因玻璃器皿打碎而使菌液灑到桌面或地上時、應(yīng)立即以5％石炭酸液或0.1%新潔爾滅溶液投蓋其上，半小時后再擦去?！羧缇何廴臼植繒r，應(yīng)先用70％乙醇棉花拭去、再用肥皂水洗刷干凈；如污染致病菌時、應(yīng)將手浸于2％—4％來蘇爾或0．1％新潔爾滅溶液中，10min—20min后用自來水刷洗干凈?！羧绮簧鲗⒕杭叭肟谥?，應(yīng)立即吐出．并用大量自來水漱口。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是一門操作技能較強(qiáng)的課程。通過本實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察、大小測定和計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的配置和滅菌實(shí)驗(yàn)三純種微生物的分離、培養(yǎng)及接種技術(shù)實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察、大小測定和計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察、大小測定和計(jì)數(shù)1、掌握光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理，學(xué)習(xí)顯微鏡的操作方法和保養(yǎng)2、觀察細(xì)菌、真菌、原生動物的標(biāo)本裝片，學(xué)會繪制生物圖3、掌握使用測微尺測量微生物大小的方法4、了解血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)，掌握使用和計(jì)算方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察、大小測定和計(jì)數(shù)1顯微鏡的構(gòu)造現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常被稱為復(fù)式顯微鏡，由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。機(jī)械裝置包括鏡筒、轉(zhuǎn)換器、載物臺、鏡臂、鏡座、調(diào)節(jié)器：光學(xué)系統(tǒng)包括目鏡、物鏡、聚光器、電光源。顯微鏡的總放大倍數(shù)為目鏡和物鏡的放大倍數(shù)的乘積。顯微鏡的構(gòu)造現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放顯微鏡的使用1、低倍鏡觀察將標(biāo)本波片用標(biāo)本夾夾住，移動到物鏡的正下方。下降10×物鏡，使其接近標(biāo)本，用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡簡，使標(biāo)本在視野中初步聚焦，再使用微調(diào)調(diào)節(jié)圖像清晰。移動標(biāo)本，找到合適的目的物，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。2、高倍鏡觀察在低倍鏡下找到合適的觀察目標(biāo)并將其移至視野中心后，輕輕轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器將高倍鏡移至工作位置。對聚光器光圈及視野亮度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)后微調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器使物象清晰，移動標(biāo)本，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。3、油鏡觀察在標(biāo)本的蓋玻片上滴少量香柏油，將物鏡轉(zhuǎn)換到油鏡，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心降下，使鏡頭侵入香柏油中。開足光圈，旋轉(zhuǎn)細(xì)調(diào)節(jié)器至標(biāo)本顯出，清晰為止。顯微鏡的使用1、低倍鏡觀察微生物大小的測量標(biāo)定目鏡測微尺裝在目鏡上的目測微尺中央刻有等分為100格或更多格的標(biāo)尺，使用前要用物測微尺標(biāo)定。物測微尺中央刻有1mm長的標(biāo)尺，等分為100格，10μm／格。將物測微尺的刻度朝上放在載物臺上，用低倍鏡找出物測微尺的刻度，移動物測微尺使其第一條線與目測微尺的第一條線重合，順著刻度線找出另一條重合線。算出低倍鏡下目測微尺每格的長度。換高倍鏡用同樣方法標(biāo)定出高倍鏡下目測微尺每格的長度。微生物大小的測量標(biāo)定目鏡測微尺微生物大小的測量微生物大小的測量將物測微尺取下，換上標(biāo)本片，選擇適當(dāng)物鏡測量微生物的長度和寬度占目測微尺的格數(shù)，再按目測微尺1格的長度算出微生物的長度和寬度。10╳10

顫藻微生物大小的測量微生物大小的測量10╳10硝化細(xì)菌大腸桿菌酵母菌硝化細(xì)菌大腸桿菌酵母菌作業(yè)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果完成下列任務(wù)并提交一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告。1、繪制所觀察的一種或兩種微生物的形態(tài)，并測量其大小。2、將菌液濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表：計(jì)數(shù)次數(shù)每個中方格菌數(shù)稀釋倍數(shù)原菌液濃度（個/ml）平均值（個/ml）第一次第二次作業(yè)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果完成下列任務(wù)并提交一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告。每個中方格菌實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的配置和滅菌1、明確培養(yǎng)基配置的原理2、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟3、掌握滅菌鍋的使用方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的配置和滅菌1、明確培養(yǎng)基配置的原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)基本原理本次需要配制的培養(yǎng)基是為下次從土壤或活性污泥中分離細(xì)菌用的，所以選擇配制適合細(xì)菌生長的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。這是一種應(yīng)用最廣泛最普遍的細(xì)菌基本培養(yǎng)基，牛肉膏提供碳原和能源，蛋白胨主要提供氮源，NaCI提供無機(jī)鹽，用HCI和NaOH調(diào)節(jié)pH，還要加入一定量的瓊脂最為凝固劑。瓊脂在大于96℃時融化，小于40℃時凝固，通常不被微生物利用。培養(yǎng)基配方如下：（調(diào)節(jié)pH7.2~7.4）牛肉膏蛋白胨NaCI瓊脂水5g10g5g25g1000ml實(shí)驗(yàn)基本原理本次需要配制的培養(yǎng)基是為下次從土壤或活性污泥中分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟1.配制溶液：取一定容最的燒杯或搪瓷杯盛入適量蒸餾水，按培養(yǎng)基配方逐一稱取各種成分，依次加入水中溶解。牛肉膏、蛋白胨可加熱促進(jìn)溶解，待全部溶解后，加水補(bǔ)足所需容量。2.調(diào)節(jié)pH：用精密pH試紙測量培養(yǎng)基原始pH值。若偏酸，逐滴加入1mol\L的NaOH溶液，邊加邊攪拌，隨時測pH值，直至達(dá)約7.4。若偏堿，同法用1mol\L的HCI溶液調(diào)節(jié)。3.分裝：將配制好的培養(yǎng)基裝入三角瓶和試管中，三角瓶裝量不要超過容積的1/2，試管裝量不要超過試管高度的1/3，約為5ml。5、加塞：分裝完畢后，在試管口和三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入并保證良好的通氣性能。4.加塞：分裝完畢后，在試管口和三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入并保證良好的通氣性能。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟1.配制溶液：取一定容最的燒杯或搪瓷杯盛入適量實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟5.包扎：加塞后，三角瓶外包一層牛皮紙或兩層舊報(bào)紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好：試管先用橡皮筋全部捆好，再在棉塞外包牛皮紙或舊報(bào)紙，防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。6.滅菌：將包扎好的培養(yǎng)基放進(jìn)高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，0.103MPa，121℃，20min，高壓蒸汽滅菌。7.擱置斜面：將滅菌的試管培蕎基冷卻至50℃左右，將試管口端擱在玻璃棒或其它合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。8.無菌檢套：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h，檢查滅菌是否徹底。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟5.包扎：加塞后，三角瓶外包一層牛皮紙或兩層環(huán)境微生物試驗(yàn)常州大學(xué)課件作業(yè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束完成下列思考題，并提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。1、配制培養(yǎng)基的過程中應(yīng)該注意些什么問題？為什么？2、培養(yǎng)基配制好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的?作業(yè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束完成下列思考題，并提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)三純種微生物的分離、培養(yǎng)及接種技術(shù)l、掌握梯度稀釋平板法分離純種微生物的原理、方法2、掌握常規(guī)接種技術(shù)3、建立無菌操作意識實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)三純種微生物的分離、培養(yǎng)及接種技術(shù)l、掌握梯度稀釋平實(shí)驗(yàn)基本原理土樣或活性污泥中含有的微生物數(shù)量很多，而且聚集在一起，經(jīng)過無菌水的梯度稀釋可以將微生物充分分散，成單個細(xì)胞，涂布到固體平板上，長成單菌落，一個單菌落對應(yīng)于原土樣（或活性污泥）中的一個微生物，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)可以計(jì)算出土樣的微生物濃度；將單菌落進(jìn)一步劃線純化可分離到純種微生物。實(shí)驗(yàn)基本原理土樣或活性污泥中含有的微生物數(shù)量很多，而且聚集在（一）梯度稀釋平板法1、制備土壤（或活性污泥）稀釋液準(zhǔn)確稱取土樣10g或活性污泥10ml，加入裝有90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約20min，使土樣與水充分混勻，將細(xì)胞分散。用一支無菌吸管從中吸取1ml土壤或活性污泥懸液加入裝有9ml無菌水的試管中，吹吸（深吸淺吹）3次，讓菌液混合均勻，即成10-2稀釋液：再換一支無菌吸管吸取10-2稀釋液1ml．移入裝有9ml無菌水的誠管中，也吹吸三次，即成10-3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀釋菌液。（一）梯度稀釋平板法1、制備土壤（或活性污泥）稀釋液（一）梯度稀釋平板法

2、加菌將無菌平板編上10-4、10-5、10-6號碼，每一號碼設(shè)置三個重復(fù)，用無菌吸管按無菌操作要求吸取10-6稀釋液各1ml放入編號10-6的3個平板中，同法吸取10-5稀釋液各1ml放入編號10-5的3個平板中，再吸取10-4稀釋液各1rnl放入編號10-4的3個平板中（圖3-1）（由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換）。3、倒平板上述操作的同時，將培養(yǎng)基加熱融化，再冷卻到40~50℃，傾注10~15ml培養(yǎng)基入已含有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)（約2~3mm厚）。迅速蓋上皿蓋，平放在工作臺上，輕輕轉(zhuǎn)動，是培養(yǎng)基和稀釋的菌液充分混合均勻，冷卻后，即制成平板。4、培養(yǎng)將培養(yǎng)皿倒置，放于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~36h，觀察結(jié)果。（一）梯度稀釋平板法2、加菌（二）平板劃線平板劃線的主要目的是長出單菌落，得到純培養(yǎng)。將融化的培養(yǎng)基無菌操作倒入無菌的空培養(yǎng)皿中。接種環(huán)在火焰上徹底殺菌并冷卻后，蘸取少量菌種，在平板表面輕輕地劃線（如圖），使得初始聚集在一起的細(xì)胞漸漸稀釋，最后有單個分散的細(xì)胞，長出單菌落，達(dá)到分離純化的目的。將劃好線的培養(yǎng)皿倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~36h，觀察結(jié)果。（二）平板劃線平板劃線的主要目的是長出單菌落，得到純培養(yǎng)。將（三）斜面接種1、在待接種的斜面培養(yǎng)基的試管上部，貼上標(biāo)簽，寫上菌名、接種日期等。2、將一支斜面菌種和一支待接的斜面培養(yǎng)基放在左手上，拇指壓住兩只試管，中指位于兩只試管之間，斜面向上，管口齊平。3、右手先將棉塞擰松動，以便接種時拔出。右手拿接種環(huán)，將接種環(huán)可能進(jìn)入試管的部分在火焰上灼燒滅菌。4、在火焰旁，用右手小指、無名指和手掌央住棉塞將它拔出。試管口在火焰上微燒一周，將管口上可能沾染的少量茵燒掉。將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先觸及沒長菌的培養(yǎng)基使環(huán)冷卻，然后輕輕挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出管外迅速伸入另一試管底部，在斜面上由底部向上劃曲線。抽出接種環(huán)，將試管塞上棉塞，最后再次灼燒接種環(huán)，則接種完畢。（三）斜面接種1、在待接種的斜面培養(yǎng)基的試管上部，貼上標(biāo)簽，環(huán)境微生物試驗(yàn)常州大學(xué)課件作業(yè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束完成下列思考題，并提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。1、梯度平扳稀釋法分離純種微生物的方法和原理是什么？2、平板培養(yǎng)皿為什么要倒置培養(yǎng)？3、觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并對結(jié)果進(jìn)行分析。作業(yè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束完成下列思考題，并提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常州大學(xué)趙遠(yuǎn)孫向武環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常州大學(xué)趙遠(yuǎn)孫向武實(shí)驗(yàn)概況環(huán)境微生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)教材包括（1）基礎(chǔ)微生物學(xué)技術(shù)，（2）現(xiàn)代微生物學(xué)技術(shù)，共10個實(shí)驗(yàn)。包括微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)、在環(huán)境科學(xué)及環(huán)境工程中應(yīng)用、現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)等有關(guān)內(nèi)容。對每個實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容，力求較詳細(xì)的介紹每種方法的技術(shù)特點(diǎn)和基本操作要求，反映現(xiàn)代環(huán)境微生物學(xué)最新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時兼具實(shí)用性和可操作性。目的：是使學(xué)生得到微生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)、基本操作和技能訓(xùn)練，同時也初步掌握現(xiàn)代微生物技術(shù)的操作方法。本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書主要用于環(huán)境與安全工程學(xué)院環(huán)境工程、給水排水專業(yè)和環(huán)境科學(xué)專業(yè)的本科生的微生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教材。實(shí)驗(yàn)概況環(huán)境微生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)教材包括（1）基礎(chǔ)微生物學(xué)技術(shù)，（實(shí)驗(yàn)守則一、學(xué)生在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持安靜，不得高聲喧嘩、打鬧，不準(zhǔn)隨地吐痰、抽煙、亂丟紙屑和雜物，不準(zhǔn)將食物帶入實(shí)驗(yàn)室。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)穿實(shí)驗(yàn)服，服從指導(dǎo)老師和實(shí)驗(yàn)員的安排。二、學(xué)生必須按時到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，遲到10分鐘不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，并按曠課處理。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中不得脫離崗位，必須離開時，需經(jīng)實(shí)驗(yàn)老師同意。三、實(shí)驗(yàn)前要認(rèn)真做好預(yù)習(xí)，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?nèi)容、方法和步驟，閱讀有關(guān)儀器和設(shè)備說明書。學(xué)生應(yīng)在指定的實(shí)驗(yàn)崗位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不準(zhǔn)擅自變換實(shí)驗(yàn)崗位。四、應(yīng)按操作規(guī)程使用實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備，不懂即問，不可盲目、野蠻操作。五、在實(shí)驗(yàn)過程中要虛心聽取指導(dǎo)老師和實(shí)驗(yàn)員的指導(dǎo)，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，按規(guī)定格式做好原始記錄，經(jīng)老師審閱同意后，方可結(jié)束實(shí)驗(yàn)，做到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠、真實(shí)。六、愛護(hù)儀器設(shè)備，除指定使用的儀器外，未經(jīng)指導(dǎo)老師許可，不得自行拆卸、插拔儀器，不得隨意動用與本次實(shí)驗(yàn)無關(guān)的設(shè)備及用品，不得將非本人物品帶出實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)用品不準(zhǔn)挪作他用，違者教師有權(quán)令其終止實(shí)驗(yàn)并離開實(shí)驗(yàn)室。七、對實(shí)驗(yàn)室公物、門窗、水電、用具、儀器和設(shè)備，要妥善保管和愛護(hù)，凡損壞儀器設(shè)備者應(yīng)及時向指導(dǎo)老師或?qū)嶒?yàn)員報(bào)告。如果因違反實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度而造成設(shè)備的損壞、丟失、實(shí)驗(yàn)室軟環(huán)境的破壞等事故，實(shí)驗(yàn)室有權(quán)責(zé)令當(dāng)事人寫出書面檢查，并按相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理。八、要節(jié)約水、電和藥品。對有毒有害物品必須在教師指導(dǎo)下進(jìn)行處理，不準(zhǔn)亂扔、亂放。九、學(xué)生實(shí)驗(yàn)完畢后，應(yīng)按規(guī)定程序關(guān)閉儀器、設(shè)備、電源和水源，并做到清洗器皿、清理桌子和清掃地面。十、若實(shí)驗(yàn)室發(fā)生諸如火災(zāi)等重大事故時，應(yīng)及時切斷電源，并在指導(dǎo)老師的指揮下按次序撤離。實(shí)驗(yàn)守則一、學(xué)生在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持安靜，不得高聲喧嘩、打鬧，不準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是一門操作技能較強(qiáng)的課程。通過本課程學(xué)習(xí)，要求學(xué)生能牢固地建立無菌概念，掌握環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)的一套基本操作技術(shù)；樹立嚴(yán)謹(jǐn)、求實(shí)的科學(xué)態(tài)度，提高觀察、分析問題和解決問題的能力；樹立勤儉節(jié)約、愛護(hù)公物、相互協(xié)作的優(yōu)良作風(fēng)。為了提高教學(xué)效果，保證實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)室的安全，實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)如下：

1每次實(shí)驗(yàn)前必須充分預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)教材，以了解實(shí)驗(yàn)的目的、原理和方法。初步熟悉實(shí)驗(yàn)操作中的主要步驟和環(huán)節(jié)、對整個實(shí)驗(yàn)的安排做到先后有序、有條不紊和避免差錯。

2．非必要的物品不要帶進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，必須帶進(jìn)的物品（包括帽子、圍巾等）應(yīng)放在不影響實(shí)驗(yàn)操作的地方。

3．每次實(shí)驗(yàn)前須用濕布擦凈臺面，必要時可用70%酒精或“新潔爾滅”溶液（01％濃度）。實(shí)驗(yàn)前要洗手，以減少染菌的幾率。

4．微生物實(shí)驗(yàn)中最重要的一環(huán)，就是要嚴(yán)格地進(jìn)行無菌操作，防止雜菌感染。為此，在實(shí)驗(yàn)過程中，每個人要嚴(yán)格做到以下幾點(diǎn)：■在進(jìn)行接種操作時，要關(guān)閉門窗，以防止空氣對流?！鼋臃N時盡量不要走動和說話，以免因塵埃飛揚(yáng)和唾沫四濺，而導(dǎo)致雜菌污染?！鲇眠^的帶菌移液管、滴管或涂布棒等，在實(shí)驗(yàn)后應(yīng)立即投入5％石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗，以免污染環(huán)境?！鲈谇逑磶Ь呐囵B(yǎng)皿、三角燒瓶或試管等之前，應(yīng)先煮沸半小時或進(jìn)行蒸汽滅菌。

5．凡需進(jìn)行培養(yǎng)的材料，都應(yīng)注明菌名、接種日期及操作者姓名(或組別)，放在指定的溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，按時觀察并如實(shí)地記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果和按時交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。6．實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙，不準(zhǔn)吃東西，以免感染。7．節(jié)約藥品和水、電、煤氣。8．各種儀器應(yīng)按要求操作，用畢按原樣放置。9．實(shí)驗(yàn)完畢、立即關(guān)閉煤氣，整理和擦凈臺面，離開實(shí)驗(yàn)室之前要用肥皂或清潔劑洗手，值日生負(fù)責(zé)打掃實(shí)驗(yàn)室及進(jìn)行安全檢查（門窗、水、電、煤氣等）。10．意外事故的處理：◆如因玻璃器皿打碎而使菌液灑到桌面或地上時、應(yīng)立即以5％石炭酸液或0.1%新潔爾滅溶液投蓋其上，半小時后再擦去?！羧缇何廴臼植繒r，應(yīng)先用70％乙醇棉花拭去、再用肥皂水洗刷干凈；如污染致病菌時、應(yīng)將手浸于2％—4％來蘇爾或0．1％新潔爾滅溶液中，10min—20min后用自來水刷洗干凈。◆如不慎將菌液及入口中，應(yīng)立即吐出．并用大量自來水漱口。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是一門操作技能較強(qiáng)的課程。通過本實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察、大小測定和計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的配置和滅菌實(shí)驗(yàn)三純種微生物的分離、培養(yǎng)及接種技術(shù)實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察、大小測定和計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察、大小測定和計(jì)數(shù)1、掌握光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理，學(xué)習(xí)顯微鏡的操作方法和保養(yǎng)2、觀察細(xì)菌、真菌、原生動物的標(biāo)本裝片，學(xué)會繪制生物圖3、掌握使用測微尺測量微生物大小的方法4、了解血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)，掌握使用和計(jì)算方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察、大小測定和計(jì)數(shù)1顯微鏡的構(gòu)造現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常被稱為復(fù)式顯微鏡，由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。機(jī)械裝置包括鏡筒、轉(zhuǎn)換器、載物臺、鏡臂、鏡座、調(diào)節(jié)器：光學(xué)系統(tǒng)包括目鏡、物鏡、聚光器、電光源。顯微鏡的總放大倍數(shù)為目鏡和物鏡的放大倍數(shù)的乘積。顯微鏡的構(gòu)造現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放顯微鏡的使用1、低倍鏡觀察將標(biāo)本波片用標(biāo)本夾夾住，移動到物鏡的正下方。下降10×物鏡，使其接近標(biāo)本，用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡簡，使標(biāo)本在視野中初步聚焦，再使用微調(diào)調(diào)節(jié)圖像清晰。移動標(biāo)本，找到合適的目的物，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。2、高倍鏡觀察在低倍鏡下找到合適的觀察目標(biāo)并將其移至視野中心后，輕輕轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器將高倍鏡移至工作位置。對聚光器光圈及視野亮度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)后微調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器使物象清晰，移動標(biāo)本，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。3、油鏡觀察在標(biāo)本的蓋玻片上滴少量香柏油，將物鏡轉(zhuǎn)換到油鏡，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心降下，使鏡頭侵入香柏油中。開足光圈，旋轉(zhuǎn)細(xì)調(diào)節(jié)器至標(biāo)本顯出，清晰為止。顯微鏡的使用1、低倍鏡觀察微生物大小的測量標(biāo)定目鏡測微尺裝在目鏡上的目測微尺中央刻有等分為100格或更多格的標(biāo)尺，使用前要用物測微尺標(biāo)定。物測微尺中央刻有1mm長的標(biāo)尺，等分為100格，10μm／格。將物測微尺的刻度朝上放在載物臺上，用低倍鏡找出物測微尺的刻度，移動物測微尺使其第一條線與目測微尺的第一條線重合，順著刻度線找出另一條重合線。算出低倍鏡下目測微尺每格的長度。換高倍鏡用同樣方法標(biāo)定出高倍鏡下目測微尺每格的長度。微生物大小的測量標(biāo)定目鏡測微尺微生物大小的測量微生物大小的測量將物測微尺取下，換上標(biāo)本片，選擇適當(dāng)物鏡測量微生物的長度和寬度占目測微尺的格數(shù)，再按目測微尺1格的長度算出微生物的長度和寬度。10╳10

顫藻微生物大小的測量微生物大小的測量10╳10硝化細(xì)菌大腸桿菌酵母菌硝化細(xì)菌大腸桿菌酵母菌作業(yè)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果完成下列任務(wù)并提交一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告。1、繪制所觀察的一種或兩種微生物的形態(tài)，并測量其大小。2、將菌液濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表：計(jì)數(shù)次數(shù)每個中方格菌數(shù)稀釋倍數(shù)原菌液濃度（個/ml）平均值（個/ml）第一次第二次作業(yè)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果完成下列任務(wù)并提交一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告。每個中方格菌實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的配置和滅菌1、明確培養(yǎng)基配置的原理2、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟3、掌握滅菌鍋的使用方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的配置和滅菌1、明確培養(yǎng)基配置的原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)基本原理本次需要配制的培養(yǎng)基是為下次從土壤或活性污泥中分離細(xì)菌用的，所以選擇配制適合細(xì)菌生長的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。這是一種應(yīng)用最廣泛最普遍的細(xì)菌基本培養(yǎng)基，牛肉膏提供碳原和能源，蛋白胨主要提供氮源，NaCI提供無機(jī)鹽，用HCI和NaOH調(diào)節(jié)pH，還要加入一定量的瓊脂最為凝固劑。瓊脂在大于96℃時融化，小于40℃時凝固，通常不被微生物利用。培養(yǎng)基配方如下：（調(diào)節(jié)pH7.2~7.4）牛肉膏蛋白胨NaCI瓊脂水5g10g5g25g1000ml實(shí)驗(yàn)基本原理本次需要配制的培養(yǎng)基是為下次從土壤或活性污泥中分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟1.配制溶液：取一定容最的燒杯或搪瓷杯盛入適量蒸餾水，按培養(yǎng)基配方逐一稱取各種成分，依次加入水中溶解。牛肉膏、蛋白胨可加熱促進(jìn)溶解，待全部溶解后，加水補(bǔ)足所需容量。2.調(diào)節(jié)pH：用精密pH試紙測量培養(yǎng)基原始pH值。若偏酸，逐滴加入1mol\L的NaOH溶液，邊加邊攪拌，隨時測pH值，直至達(dá)約7.4。若偏堿，同法用1mol\L的HCI溶液調(diào)節(jié)。3.分裝：將配制好的培養(yǎng)基裝入三角瓶和試管中，三角瓶裝量不要超過容積的1/2，試管裝量不要超過試管高度的1/3，約為5ml。5、加塞：分裝完畢后，在試管口和三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入并保證良好的通氣性能。4.加塞：分裝完畢后，在試管口和三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入并保證良好的通氣性能。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟1.配制溶液：取一定容最的燒杯或搪瓷杯盛入適量實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟5.包扎：加塞后，三角瓶外包一層牛皮紙或兩層舊報(bào)紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好：試管先用橡皮筋全部捆好，再在棉塞外包牛皮紙或舊報(bào)紙，防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。6.滅菌：將包扎好的培養(yǎng)基放進(jìn)高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，0.103MPa，121℃，20min，高壓蒸汽滅菌。7.擱置斜面：將滅菌的試管培蕎基冷卻至50℃左右，將試管口端擱在玻璃棒或其它合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。8.無菌檢套：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h，檢查滅菌是否徹底。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟5.包扎：加塞后，三角瓶外包一層牛皮紙或兩層環(huán)境微生物試驗(yàn)常州大學(xué)課件作業(yè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束完成下列思考題，并提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。1、配制培養(yǎng)基的過程中應(yīng)該注意些什么問題？為什么？2、培養(yǎng)基配制好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的?作業(yè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束完成下列思考題，并提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)三純種微生物的分離、培養(yǎng)及接種技術(shù)l、掌握梯度稀釋平板法分離純種微生物的原理、方法2、掌握常規(guī)接種技術(shù)3、建立無菌操作意識實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)三純種微生物的分離、培養(yǎng)及接種技術(shù)l、掌握梯度稀釋平實(shí)驗(yàn)基本原理土樣或活性污泥中含有的微生物數(shù)量很多，而且聚集在一起，經(jīng)過無菌水的梯度稀釋可以將微生物充分分散，成單個細(xì)胞，涂布到固體平板上，長成單菌落，一個單菌落對應(yīng)于原土樣（或活性污泥）中的一個微生物，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)可以計(jì)算出土樣的微生物濃度；將單菌落進(jìn)一步劃線純化可分離到純種微生物。實(shí)驗(yàn)基本原理土樣或活性污泥中含有的微生物數(shù)量很多，而且聚集在（一）梯度稀釋平板法1、制備土壤（或活性污泥）稀釋液準(zhǔn)確稱取土樣10g或活性污泥10ml，加入裝有90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約20min，使土樣與水充分混勻，將細(xì)胞分散。用一支無菌吸管從中吸取1ml土壤或活性污泥