細(xì)胞培養(yǎng)周l課件

細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)合適的環(huán)境和必需的條件1營(yíng)養(yǎng)需要2環(huán)境要求3無(wú)毒及無(wú)污染環(huán)境要求實(shí)驗(yàn)室：基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室——一級(jí)生物安全水平、

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室——二級(jí)生物安全水平、

防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——三級(jí)生物安全水平

最高防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——四級(jí)生物安全水平有關(guān)手冊(cè)有相關(guān)敘述：與各危險(xiǎn)度等級(jí)微生物相對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)室生物安全水平1

級(jí)

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室——一級(jí)生物安全水平基礎(chǔ)的教學(xué)、研究,GMT

不需要；開放實(shí)驗(yàn)臺(tái)2

級(jí)

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室——二級(jí)生物安全水平初級(jí)衛(wèi)生服務(wù)；診斷、研究；GMT

加防護(hù)服、生物危害標(biāo)志開放實(shí)驗(yàn)臺(tái)，此外需BSC

用于防護(hù)可能生成的氣溶膠BSC

：生物安全柜；GMT

：微生物學(xué)操作技術(shù)規(guī)范

典型的二級(jí)生物安全水平實(shí)驗(yàn)室門保持關(guān)閉并貼上適當(dāng)?shù)奈ｋU(xiǎn)標(biāo)志。潛在被污染的廢棄物同普通廢棄物隔開。基本生物安全設(shè)備

1

.移液輔助器—避免用口吸的方式移液2

.生物安全柜，在以下情況使用：

—

處理感染性物質(zhì)；如果使用密封的安全離心杯，并在生物安全柜內(nèi)裝樣、取樣，則這類材料可在開放實(shí)驗(yàn)室離心

—

進(jìn)行極有可能產(chǎn)生氣溶膠的操作時(shí)（離心、研磨、混勻、劇烈搖動(dòng)、超聲破碎、打開內(nèi)部壓力和周圍環(huán)境壓力不同的盛放有感染性物質(zhì)的容器、動(dòng)物鼻腔接種以及從動(dòng)物或卵胚采集感染性組織）。

3.一次性塑料接種環(huán)；也可在生物安全柜內(nèi)使用電加熱接種環(huán)，以減少生成氣溶膠。

4

.螺口蓋試管及瓶子。

5

.用于清除感染性材料污染的高壓滅菌器或其他適當(dāng)工具。

6

.一次性巴斯德塑料移液管，盡量避免使用玻璃制品。

7

.在投入使用前，像高壓滅菌器和生物安全柜等設(shè)備必須用正確方法進(jìn)行驗(yàn)收。應(yīng)參照生產(chǎn)商的說(shuō)明書定期檢測(cè)。

3

級(jí)

防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——三級(jí)生物安全水平特殊的診斷、研究，在二級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加特殊防護(hù)服、進(jìn)入制度、定向氣流BSC

和／或其他所有實(shí)驗(yàn)室工作所需要的基本設(shè)備4

級(jí)

最高防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——四級(jí)生物安全水平危險(xiǎn)病原體研究在三級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加氣鎖入口、出口淋浴、污染物品的特殊處理Ⅲ級(jí)BSC

或Ⅱ級(jí)BSC。穿著正壓服、雙開門高壓滅菌器（穿過墻體）、經(jīng)過濾的空氣。傳染病原危害等級(jí)。第一級(jí)危害群微生物：與人類成人健康和疾病無(wú)關(guān)；（無(wú)或極低的個(gè)體和群體危險(xiǎn)）不太可能引起人或動(dòng)物致病的微生物第二級(jí)危害群微生物：在人類所引起的疾病很少是嚴(yán)重的，而且通常有預(yù)防及治療的方法；（個(gè)體危險(xiǎn)中等，群體危險(xiǎn)低）實(shí)驗(yàn)室暴露也許會(huì)引起嚴(yán)重感染，但對(duì)感染有有效的預(yù)防和治療措施，并且疾病傳播的危險(xiǎn)有限。第三級(jí)危害群微生物：在人類可以引起嚴(yán)重或致死的疾病，可能有預(yù)防和治療方法；第四級(jí)危害群微生物：在人類可以引起嚴(yán)重或致死的疾病，通常無(wú)預(yù)防和治療的方法，如炭疽桿菌、霍亂弧菌、埃博拉病毒、天花病毒等。

無(wú)毒：無(wú)毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。凡與細(xì)胞直接或間接接觸的東西都必須是無(wú)毒的。無(wú)污染微生物的污染不同細(xì)胞類型的交叉污染細(xì)菌霉菌支原體等廢棄物處理首要原則：所有感染性材料必須在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清除污染、高壓滅菌或焚燒。

處理潛在感染性微生物或動(dòng)物組織的所有的實(shí)驗(yàn)室物品，在被丟棄前應(yīng)考慮的主要問題有：

1

.是否已采取規(guī)定程序?qū)υ撐锲愤M(jìn)行了有效的清除污染或消毒？

2

.丟棄已清除污染的物品時(shí)，是否會(huì)對(duì)直接參與丟棄的人員，或在設(shè)施外可能接觸到丟棄物的人員造成任何潛在的生物學(xué)或其他方面的危害？

3.清除污染

高壓蒸汽滅菌是清除污染時(shí)的首選方法。需要清除污染并丟棄的物品應(yīng)裝在容器中。任何高壓滅菌后重復(fù)使用的污染（有潛在感染性）材料不應(yīng)事先清洗，任何必要的清洗、修復(fù)必須在高壓滅菌或消毒后進(jìn)行。也可采用其他除去／或殺滅微生物的替代方法

4.污染性材料和廢棄物的處理和丟棄程序

相關(guān)工作要遵守國(guó)家和國(guó)際規(guī)定。實(shí)驗(yàn)設(shè)備及用品：超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板，凍存管CO2培養(yǎng)箱倒置像差生物顯微鏡超凈工作臺(tái)生物安全柜自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀濾器培養(yǎng)板及瓶實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備清洗在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿的清洗膠塞的清洗塑料制品的清洗玻璃器皿的清洗基本方法經(jīng)典方法：浸泡、刷洗、浸酸和沖洗浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、流水沖洗、60℃烘干、酸泡（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、60℃烘干清洗后的玻璃器皿：干凈透明無(wú)油跡，無(wú)殘留物質(zhì)刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)刷洗要適度，過度會(huì)損害器皿表面光澤度浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中清潔液對(duì)玻璃器皿無(wú)腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面浸泡時(shí)間：一般為過夜，不應(yīng)少于6小時(shí)清潔液常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）

強(qiáng)清潔液63∶1000∶200次強(qiáng)清洗液120∶200∶1000弱清潔液100∶100∶1000配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色

沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡最好用洗滌裝置如用手工操作需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用膠塞的清洗新購(gòu)置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來(lái)水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘（以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)），自來(lái)水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用塑料制品的清洗

塑料制品現(xiàn)多是采用無(wú)毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品必要時(shí)用2%NaOH浸泡過夜，用自來(lái)水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來(lái)水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用

本實(shí)驗(yàn)：

自來(lái)水洗→蒸餾水洗→甩干水→干燥→裝盒→消毒。消毒細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染常見原因：操作間或周圍空間的不潔培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染消毒滅菌方法物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器皿，30min濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min干烤：160℃,2小時(shí)過濾：0.22μm化學(xué)消毒滅菌法70%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無(wú)菌室內(nèi)的壁面處理1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒抗生素主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇參考：(1）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)胞株時(shí)咨詢。(2)其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。(3)根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來(lái)選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選RPMI1640。(4)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys5A、M199、F10等

制備1000mlRPMI

1640培養(yǎng)基RPMI

1640

干粉培養(yǎng)基10.4g（1包）

三蒸餾水

400ml

↓

磁力攪拌至完全溶解

↓

加三蒸餾水定容至1000ml

在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下，用滅菌后的并置有0.22μm孔徑濾膜的過濾器除菌，分裝200ml/瓶，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用前取一瓶溶解，每200ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。-------細(xì)胞培養(yǎng)液消化液分離組織和分散細(xì)胞常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)單獨(dú)或混合使用胰蛋白酶溶液：

胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補(bǔ)足D-Hanks平衡鹽溶液（常用濃度為0.25%（0.1%-0.5%））攪拌混勻，置室溫4小時(shí)或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌，分裝入瓶中，-20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐В?，胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7.2左右胰蛋白酶溶液配制D-Hanks’平衡鹽溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

EDTA·4Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)EDTA溶液配制：用D-Hanks’平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存血清熱滅活：56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。如果不做細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，建議血清不要滅活。

因?yàn)闊崽幚頃?huì)造成血清沉淀物顯著增多，還會(huì)影響血清的質(zhì)量。滅活后嚴(yán)重影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度，且細(xì)胞貼壁率降低。血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號(hào)的血清血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染?？咕氐氖褂茫涸谂囵B(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定pH調(diào)整液NaHCO3溶液（堿）常用濃度為7.5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液一種弱酸，羥乙基哌秦乙硫磺酸，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES