蛋白質(zhì)溶液的濃縮方法演示文稿

蛋白質(zhì)溶液的濃縮方法演示文稿1第一頁，共三十三頁。優(yōu)選蛋白質(zhì)溶液的濃縮方法第二頁，共三十三頁。3蛋白質(zhì)的種類第三頁，共三十三頁。4蛋白質(zhì)的性質(zhì)膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子量在1萬-100萬之間，直徑在1-100nm之間，屬于膠體粒子。蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團(tuán)，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2等和水有高度親和性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇時，就很容易在蛋白質(zhì)顆粒外面形成—層水膜。兩性解離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)同氨基酸一樣也是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下，能解離為帶電基團(tuán)從而使蛋白質(zhì)帶電。蛋白質(zhì)的變性第四頁，共三十三頁。5蛋白質(zhì)溶液的濃縮方法蛋白質(zhì)溶液的濃縮連接了蛋白質(zhì)的提取和蛋白質(zhì)的分離純化，是獲取高濃度或高活性蛋白質(zhì)的重要步驟。濃縮目的：提高蛋白質(zhì)濃度；減少樣品體積；便于進(jìn)一步純化。常用的濃縮方法：沉淀法（蛋白質(zhì)的沉淀性質(zhì)）吸附法（吸水劑）凍干法（真空低溫脫水）超濾法（分子量）第五頁，共三十三頁。61.1鹽析法1.2低溫有機(jī)溶劑沉淀法1.3等電點(diǎn)沉淀法1.4

生成鹽復(fù)合物沉淀法1.沉淀法1.5選擇變性沉淀法1.6非離子多聚物沉淀法第六頁，共三十三頁。71.沉淀法沉淀法濃縮蛋白質(zhì)溶液，指將蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象。沉淀法是比較傳統(tǒng)的分離純化蛋白質(zhì)的方法，目前仍然廣泛使用。一般常用的沉淀濃縮有硫酸銨沉淀法、（低溫）有機(jī)溶劑沉淀法、丙酮沉淀法、免疫沉淀法、三氯醋酸沉淀法、聚乙二醇沉淀法等。第七頁，共三十三頁。81.1鹽析法定義：鹽析一般指溶液中加入無機(jī)鹽而使某種蛋白質(zhì)溶解度降低而析出的過程。原理：高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競爭水分子，使溶液中自由水分子數(shù)減小，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。第八頁，共三十三頁。91.1鹽析法鹽類的選擇：價格低； 溶解度好； 溶解過程中產(chǎn)熱少； 鹽溶液密度與沉淀的密度有明顯差別。

一般來說：高價陰離子：PO43->SO42->Ac-和NO3-， 單價陽離子：NH4+>K+和Na+， 高價陰離子的沉淀效果優(yōu)于單價陽離子。第九頁，共三十三頁。101.1鹽析法e.g硫酸銨鹽析法濃縮蛋白質(zhì)溶液 硫酸銨因其價格便宜、溶解度高且對溫度的敏感性低而被常用于沉淀蛋白質(zhì)。

操作方法：（1）加入固體硫酸銨，適用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況； （2）加入飽和硫酸銨溶液，適用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況； （3）透析平衡法（多用于結(jié)晶），先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，透析袋內(nèi)硫酸銨飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后目的蛋白析出。第十頁，共三十三頁。111.1鹽析法硫酸銨鹽析法的注意事項： （1）由于蛋白質(zhì)沉淀的密度與硫酸銨飽和溶液的密度相近，因此離心分離沉淀物時一般需要高速離心機(jī)。 （2）硫酸銨會使溶液略微酸化，可用氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)。 （3）注意飽和度表中規(guī)定的溫度，加入固體硫酸銨鹽后的體積變化已考慮在表中； （4）鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過濾或離心。離心多用于低濃度硫酸銨溶液，而過濾多用于高濃度硫酸銨溶液； （5）硫酸銨中可能含有少量的重金屬離子，使用前必須用H2S處理。第十一頁，共三十三頁。121.2低溫有機(jī)溶劑沉淀法原理： （1）甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑加入水中使溶劑介電常數(shù)降低，增加了相反電荷的吸引力； （2）上述有機(jī)溶劑是強(qiáng)親水試劑，破壞蛋白質(zhì)膠體分子表面的水化層而使分子聚集沉淀。有機(jī)溶劑的選擇：

有機(jī)溶劑首選能與水混容的，常用乙醇、甲醇、丙酮等。大多數(shù)蛋白質(zhì)通過加入等體積的丙酮或四倍體積的乙醇就可以沉淀下來，但也造成的了蛋白質(zhì)溶液的稀釋，所以蛋白質(zhì)溶液的濃度一般要在1mg/ml以上。

第十二頁，共三十三頁。131.2低溫有機(jī)溶劑沉淀法影響因素：（1）溫度：低溫可保持生物大分子活性，同時降低其溶解度，提高提取效率； （2）樣品濃度和pH：與鹽析法中的作用基本相同； （3）金屬離子：一些多價陽離子如Zn2+和Ca2+在一定pH下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物在水中或有機(jī)溶劑中的溶解度都大大下降，而且不影響蛋白質(zhì)的生物活性。 （4）離子強(qiáng)度：鹽濃度太高或太低都對分離有不利影響，對蛋白質(zhì)和多糖而言，鹽濃度不超過5%比較合適，使用的乙醇量不宜超過二倍體積。第十三頁，共三十三頁。141.2低溫有機(jī)溶劑沉淀法優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：（1）分辨力高于鹽析法，即蛋白質(zhì)只在一個比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀； （2）沉淀不用脫鹽，過濾更為容易。

缺點(diǎn)：容易使蛋白質(zhì)變性失活，操作要求在低溫下進(jìn)行。如利用丙酮沉淀蛋白質(zhì)時，必須在0~4℃低溫下進(jìn)行。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白質(zhì)會變性。第十四頁，共三十三頁。151.3等電點(diǎn)沉淀法原理：兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時溶解度最低。適用范圍：只適用于水化程度不大、在等電點(diǎn)時溶解度很低的蛋白質(zhì)，如酪蛋白。對于親水性很強(qiáng)的蛋白質(zhì)，在等電點(diǎn)附近仍然有很大的溶解度，用等電點(diǎn)法沉淀不完全。 等電點(diǎn)法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在偏酸性范圍內(nèi)，調(diào)節(jié)pH時所需要的無機(jī)酸價格低，操作也比較方便。 缺點(diǎn)：對低pH敏感的蛋白應(yīng)避免使用此法。第十五頁，共三十三頁。161.4生成鹽復(fù)合物沉淀法蛋白質(zhì)可生成鹽類復(fù)合物沉淀，主要方法： （l）與酸性功能團(tuán)作用的金屬復(fù)合鹽法（如銅鹽、銀鹽、鋅鹽、鉛鹽、鋰鹽、鈣鹽等），沉淀可通以H2S使金屬變成硫化物而除去； （2）與堿性功能團(tuán)作用的有機(jī)復(fù)合鹽法（如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、丹寧酸鹽等），沉淀加入無機(jī)酸并用乙酸萃取，或用離子交換法除去。 （3）無機(jī)復(fù)合鹽法（如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等）。

但值得注意的是，重金屬、某些有機(jī)酸與無機(jī)酸和蛋白質(zhì)形成復(fù)合鹽后，常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀，應(yīng)用時必須謹(jǐn)慎。第十六頁，共三十三頁。171.5選擇變性沉淀法原理：利用蛋白質(zhì)對某些物理或化學(xué)因素的敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達(dá)到分離提純的目的。方法： （1）利用表面活性劑（三氯乙酸）或有機(jī)溶劑； （2）利用生物大分子的熱不穩(wěn)定性，加熱破壞某些組分，而保存另一些組分； （3）酸堿變性沉淀。很多蛋白質(zhì)在pH5.0或以下被沉淀，只有少數(shù)蛋白質(zhì)在中性或堿性條件下形成沉淀，且可以通過調(diào)節(jié)pH來去除雜蛋白。第十七頁，共三十三頁。181.6非離子多聚物沉淀法背景：非離子多聚物是六十年代發(fā)展起來的一類重要沉淀劑，最早用于提純免疫球蛋白、沉淀一些細(xì)菌和病毒，近年來逐漸廣泛應(yīng)用于核酸和酶的分離提純。 包括不同分子量的PEG（常用PEG-6000）、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐硫酸鈉等。方法：（1）基于不同蛋白質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)不同，分配系數(shù)不同，可選用兩種水溶性非離子多聚物組成液/液兩相體系，不等量分配而分離沉淀。 （2）選用一種水溶性非離子多聚物，使蛋白質(zhì)在同一液相中，由于分子相互排斥而凝聚導(dǎo)致蛋白析出。該方法操作時先離心除去大懸浮顆粒，調(diào)整溶液PH值和溫度至適度，然后加入中性鹽和多聚物至一定濃度，冷貯一段時間，即形成沉淀。第十八頁，共三十三頁。192.1透析袋吸附法2.2凝膠吸附法2.吸附法第十九頁，共三十三頁。20吸附法定義：通過吸附劑直接去除溶液中的水分子以達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 吸附法是最簡單快速的濃縮蛋白質(zhì)溶液的方法，所需儀器簡單，特別適用于穩(wěn)定性較差的蛋白質(zhì)。吸附劑的選擇：（1）吸附劑不能與溶液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（2）吸附劑對蛋白質(zhì)不吸附；（3）吸附劑易于溶液分開。常用的吸附劑：PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖、凝膠等。常用的吸附方法：透析袋法和凝膠濃縮法。第二十頁，共三十三頁。212.1透析袋吸附法透析袋吸附法在透析技術(shù)的基礎(chǔ)上改良而來的。

傳統(tǒng)的透析是基于分子質(zhì)量大小的液相分離技術(shù)，它由透過半透膜的選擇性擴(kuò)散來實(shí)現(xiàn)。但是純粹的透析主要用于除去小分子類的溶質(zhì)，而要達(dá)到濃縮（即除去溶劑）的目的則費(fèi)時較長。

透析袋吸附法是將透析液換成可以吸水的溶液或者固體吸附劑，這樣可實(shí)現(xiàn)很好的濃縮作用。第二十一頁，共三十三頁。222.1透析袋吸附法具體操作： 將蛋白質(zhì)溶液加入到透析袋中（無透析袋可以用玻璃紙代替），結(jié)扎好后將PEG、蔗糖等吸附劑撒在透析袋外；或者把吸水劑配成30%-40%的溶液，將裝有蛋白質(zhì)溶液的透析袋放入吸附劑溶液中。吸水劑用過后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后重復(fù)利用。優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：該方法簡單高效，操作過程中可以保持蛋白質(zhì)不變性，吸附劑可回收利用。 缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)可能吸附在透析膜上，導(dǎo)致回收率低。操作過程需要低溫。第二十二頁，共三十三頁。232.2凝膠吸附法定義：凝膠是一種惰性多孔聚合物，孔徑較小的凝膠具有很強(qiáng)的吸水性，適宜濃縮分子量在10000以上的蛋白質(zhì)。 常用的凝膠有SephadexG系列以及Bio-GelP系列凝膠。具體操作：將干的凝膠加入到蛋白質(zhì)溶液中吸收水分子和其他小分子，當(dāng)凝膠完全膨脹后，用過濾或立信德方法除去凝膠，即可得到濃縮后的蛋白質(zhì)溶液。注意事項：溶液的pH值應(yīng)大于被濃縮物質(zhì)的等電點(diǎn)，否則在凝膠表面會產(chǎn)生陽離子交換，影響蛋白質(zhì)的回收率。第二十三頁，共三十三頁。243.1原理3.2操作過程3.真空冷凍干燥法第二十四頁，共三十三頁。253.1原理 凍干法是指將蛋白質(zhì)溶液在低溫下凍結(jié)，然后在真空條件下升華干燥，除去冰晶，待升華結(jié)束后再進(jìn)行解吸干燥，除去部分結(jié)合水的干燥方法，最終達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。第二十五頁，共三十三頁。263.1原理蛋白凍干粉冷凍初級干燥二次干燥避光貯存冷凍速率會影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量。慢速冷凍，快速冷凍。>80%的溶劑被除去，殘留的溶劑以濕氣的形式吸附在產(chǎn)品上。殘留溶劑降低到足以抑制微生物生長或化學(xué)反應(yīng)發(fā)生的水平，同時保持了凍干蛋白的活性和完整性。需要使用時，加蒸餾水或生理鹽水制成懸浮液，即可恢復(fù)原狀態(tài)。第二十六頁，共三十三頁。273.2操作過程油面一定不能低于油鏡的中線。嚴(yán)禁無油或低油位開啟真空泵。第二十七頁，共三十三頁。284.1原理4.2超濾裝置及類型4.超濾法4.3超濾膜的選擇4.4注意事項第二十八頁，共三十三頁。294.1原理超濾（Ultrafiltration）技術(shù)是一種膜濾法，也有錯流過濾（CrossFiltration）之稱。其基本原理是在常溫下以一定壓力和流量，利用不對稱微孔結(jié)構(gòu)和半透膜介質(zhì)，依靠膜兩側(cè)的壓力差作為推動力，以錯流方式進(jìn)行過濾，使溶劑及小分子物質(zhì)通過，大分子物質(zhì)和微粒子如蛋白質(zhì)、水溶性高聚物、細(xì)菌等被濾膜阻留，從而達(dá)到分離、分級、純化、濃縮目的的一種新型膜分離技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)室常用超濾管和冷凍離心機(jī)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)溶液的超濾濃縮。第二十九頁，共三十三頁。304.2裝置及類型第三十頁，共三十三頁。314.2裝置及類型超濾裝置裝置較簡單，只是在密閉的容器中施加一定壓力，使小分子和溶劑分子擠壓出膜外。無攪拌裝置濃差極化嚴(yán)重，只適于濃度較稀的少量超濾。

超濾裝置位于電磁攪拌器之上。向容器內(nèi)施加壓力的同時開動磁力攪拌器，大分子向?yàn)V膜表面堆積時，被電磁攪拌器分散到溶液中。濃度極化較弱，超濾速度略有提高。在一支空心柱內(nèi)裝有許多中空纖維毛細(xì)管，兩端相通，管的內(nèi)徑一般在0.2mm左右，有效面積可以達(dá)到1平方厘米。極大地提高了超濾速度。攪拌式超濾無攪拌式超濾中空纖維超濾第三十一頁，共三十三頁。324.3超濾膜的選擇超濾技術(shù)的關(guān)鍵是膜。常用的膜一般是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物制成。近年來為適應(yīng)制藥和食品工業(yè)上滅菌的需要，發(fā)展了非纖維型的各向異性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH1～14都是穩(wěn)定的，且能在90℃下正常工作。超濾膜通常是比較穩(wěn)定的，若使用恰當(dāng)，能連續(xù)用1～2年。暫時不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％疊氮化鈉NaN3中保存。第三十二頁，共三十三頁。33超濾膜相對流速(ml/min/cm2)性能特點(diǎn)聚醚砜，pH范圍1~143,000MWCO0.05肽的回收率高5,000MWCO0.24肽的回收率高，流速較快10,000MWCO0.41應(yīng)用范圍廣，流速快，吸附低30,000MWCO0.41應(yīng)用范圍廣，流速快50,000MWCO0.45精確的截留分子量限100,000MWCO0.35免疫球蛋白的收率高三醋酸纖維素，pH范圍4~85,000MWCO0.04去除肽和蛋白10,000M