實驗一 特殊顯微鏡的工作原理和使用課件

實驗一特殊顯微鏡的工作原理和使用放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑10/0.25，40/0.65，100/1.3標(biāo)準(zhǔn)機械筒長和蓋玻片厚度160/0.17160/0或160/160/-∞/0或∞/-油浸物鏡：oil、oel、Hi等水浸物鏡：W或Water甘油浸物鏡：Glyz和Glye復(fù)消色差物鏡：APO半復(fù)消色差物鏡：FL平場物鏡：PL特殊顯微鏡是與明視場普通顯微鏡相對而言，在成像原理、結(jié)構(gòu)和用途上存在差異的顯微鏡。這里介紹：1、暗視場顯微鏡2、相差顯微鏡3、熒光顯微鏡

(一)原理和結(jié)構(gòu)特點在日常生活中，室內(nèi)飛揚的微?；覊m是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進來，灰塵便粒?？梢娏?，這是光學(xué)上的丁達爾現(xiàn)象。暗視場顯微鏡就是利用此原理設(shè)計的。丁達爾現(xiàn)象暗視場顯微鏡是在普通光學(xué)顯微鏡中去除明視場聚光器，換上一個暗視場聚光器而成。它的結(jié)構(gòu)特點主要是使用中央遮光板或暗視場聚光器，常用的是拋物面聚光器，使光源的中央光束被阻擋,不能由下而上地通過標(biāo)本進入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上。明場普通顯微鏡成像光路圖暗場照明光路圖成像特點及優(yōu)缺點在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像,并非物體的本身，所以只能看到物體的存在和運動，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)，只能呈現(xiàn)出物體的輪廓而且比實物要大。但被檢物體為非均質(zhì)時，并大于1／2波長，則各級衍射光線同時進入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構(gòu)造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運動，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運動等。要求與注意事項(1)制作標(biāo)本時所用的載玻片和蓋玻片均應(yīng)清潔干凈，必須使用薄玻片(載玻片厚度約1.O～1.1mm，蓋玻片厚度約0.1mm)，否則會影響暗視野集光器斜射光焦點的調(diào)節(jié)，如載玻片太厚，焦點只能落在載玻片內(nèi)，就不能看到物像。標(biāo)本也不能過厚。(2)采用的光源宜強，一般均用強光燈照明。光線暗則物像不清晰。(3)調(diào)節(jié)光源：使光線集中在暗視野集光器上。先用低倍鏡觀察，移動暗視野集光器，使其中央的一個圓圈恰好處在視野的中央。如暗視野集光器已準(zhǔn)確固定好，則可免去這一步驟。(4)先在暗視野的集光器上加香柏油一滴，然后將標(biāo)本放在載物臺上，把暗視野集光器向上移，使其上的柏木油與標(biāo)本片的底面接觸，中間不能有氣泡存在。(5)高倍觀察：在標(biāo)本蓋玻片上再加香柏油一滴，降下鏡筒，使油鏡浸在香柏油內(nèi)，再用粗、細(xì)螺旋調(diào)節(jié)物鏡的焦距，有時還需稍微升降暗視野集光器以調(diào)節(jié)斜射光焦點，使其正好落在標(biāo)本上，并且調(diào)節(jié)油鏡頭的光圈，相互配合，直到物像清楚為止，即可開始檢查。也可用低倍或高倍物鏡進行鏡檢，這就不必在蓋玻片上加香柏油。（二）相差顯微鏡但是，光線通過厚度不同的透明物體時，其相位卻會發(fā)生改變，形成相差。不過，相差不表現(xiàn)為明暗和顏色的差異，這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。我們可以利用光學(xué)的相干干涉原理，可以把相差改變?yōu)檎穹?，這樣就能使透明的、厚度和性質(zhì)不均勻的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)明暗的不同，能夠較清楚地予以區(qū)別。如果這兩條光波射到光屏的同一點上，而且一條光波比另一條光波遲滯了半個波長，即兩條光波因位相相反而互相干涉抵消則光線消失，或者相對振幅相互影響而光線減弱。如果一條光波雖然遲滯了一個波長,但兩條光波位相相同,則因波的疊加而光線增強-明相差+暗相差相差顯微鏡，能夠通過其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成振幅差，即明暗差，可以被我們的感覺器官所感知。同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細(xì)胞或未染色標(biāo)本。相差顯微鏡的構(gòu)造特點相差顯微鏡的構(gòu)造以普通顯微鏡為基礎(chǔ)，與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡(通常標(biāo)有PH的標(biāo)記)代替普通物鏡，并帶有一個調(diào)節(jié)合軸用的望遠鏡。相差環(huán)則是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，放置在光源通路上，使光線只能由環(huán)狀部分通過，環(huán)狀光圈的大小可由集光鏡的數(shù)值口徑(N.A)來調(diào)節(jié)。環(huán)狀光圈的大小由不同大小的環(huán)狀孔控制。環(huán)狀光闌的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來。相差環(huán)相差物鏡是在物鏡的后焦點處加一環(huán)狀相板。相板由光學(xué)玻璃制成，安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜，具有改變相位的作用。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。放大倍數(shù)不同的物鏡，其相板也不同。調(diào)軸望遠鏡：是用來進行合鈾調(diào)節(jié)的。使用不同的相差物鏡時，應(yīng)配合相應(yīng)的環(huán)狀光圈，并用合軸調(diào)節(jié)望遠鏡觀察環(huán)狀光圈和相板，調(diào)節(jié)至環(huán)狀光圈的亮環(huán)與相板的暗環(huán)完全重合。這樣，光線通過標(biāo)本后，就必須經(jīng)過相板而發(fā)生相位的改變，造成明暗差異的影像。要使得聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合對齊，才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。環(huán)狀光圈、相差物鏡配合與調(diào)節(jié)好之后，其他操作方法與普通光學(xué)顯微鏡相同。（3）合鈾調(diào)整拔出目鏡，插入合鈾望遠鏡，一邊從望遠鏡向內(nèi)觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動望遠鏡內(nèi)筒使其上升，當(dāng)對準(zhǔn)焦點就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合。（4）觀察換回目鏡，按常規(guī)要領(lǐng)進行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌。用途相差顯微鏡是利用樣品中質(zhì)點折射率的不同或質(zhì)點厚度的不等，產(chǎn)生光線的相位差，使新鮮標(biāo)本不必染色就可以看到，而且能夠觀察到活細(xì)胞內(nèi)線粒體及染色體等精細(xì)結(jié)構(gòu)，還可以應(yīng)用于霉菌、細(xì)菌、病毒等更微小活體的研究，進行標(biāo)本形態(tài)、數(shù)量、活動及分裂、繁殖等生物學(xué)行為觀察，并可進行量度與比較。用途特點:鑒定活體細(xì)胞最實用、最經(jīng)濟的方法缺點:需要光強高切片不能太厚(5~10um)蓋片、載片需符合標(biāo)準(zhǔn)最好配用單色濾光鏡熒光效果不如明場物鏡三、熒光顯微鏡熒光的性質(zhì)：1、吸收光，必需有激發(fā)光源2、熒光波長＞激發(fā)波長（損失熱能）3、熒光強度小于激發(fā)光的強度4、有不同程度的衰減5、熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率熒光的產(chǎn)生一次熒光：又叫自發(fā)熒光或固有熒光，經(jīng)過紫外光照射直接發(fā)出熒光。二次熒光：又叫繼發(fā)熒光，被觀察物體經(jīng)過熒光染料處理之后，經(jīng)過紫外光照射才能發(fā)出熒光。熒光染料種類很多：熒光顯微鏡原理熒光顯微鏡利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如波長短的紫外光365nm或紫藍光420nm)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。光源現(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時，可達50～70個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強的紫外和藍紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min。超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動幾個部分。在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。濾色系統(tǒng)熒光光源的采用超高壓汞燈，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：

一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛?二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠家名稱常不統(tǒng)一各種濾色鏡落射式熒光顯微鏡這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光鈾呈45度角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。分色后成像光路圖使用方法1．打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達到最亮點。2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。3．用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個照明光斑的中央。4．放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時，必須用無熒光的特殊油鏡；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。5.觀察在示教臺上的熒光顯微鏡下（用藍紫光濾光片），可見經(jīng)0．01％的丫啶橙熒光染料染色的細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。使用熒光顯微鏡的注意事項（1）嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。（2）應(yīng)在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。（3）防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡。（4）檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。（6）標(biāo)本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。長時間的激發(fā)光照射標(biāo)本，會使得熒光衰減和消失現(xiàn)象，故應(yīng)盡可能縮短照射時間。暫時不觀察時可用擋光板遮蓋激發(fā)光。（7）標(biāo)本觀察時候應(yīng)采用無熒光油，應(yīng)避免眼睛直視紫外光源。（8）電源應(yīng)安裝穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)會降低熒光燈的壽命。熒光顯微鏡的應(yīng)用范圍生物體內(nèi)的各種組織、細(xì)胞、細(xì)胞器、微生物、病毒等，對激發(fā)光的敏感度不同，使用時應(yīng)選擇不同的激發(fā)濾色鏡來得到最佳的激發(fā)光。激發(fā)方式激發(fā)波長應(yīng)用范圍U激發(fā)334病理切片，細(xì)菌、FITC染料、V激發(fā)365.405.435自發(fā)熒光、一般熒光抗體、四環(huán)素染色物B激發(fā)405.435.490FITC染料、吖啶橙染色、染色體、紅細(xì)胞、癌細(xì)胞、蛔蟲G激發(fā)546浮爾根染色、DNA各種標(biāo)記熒光素的特性優(yōu)點：檢出能力高對細(xì)胞的刺激小能進行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途

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WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察FITC+TexasRed+DAPI多重染色標(biāo)本的多色觀察原位雜交技術(shù)六、倒置顯微鏡倒置顯微鏡的組成與普通顯微鏡相同,不同的是光源在載物臺上,物鏡與照明系統(tǒng)在載物臺下,與其它顯微鏡的結(jié)構(gòu)位置相反,故稱倒置顯微鏡.一般具有相差物鏡，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞。結(jié)構(gòu)和使用特點：1、長工作距離聚光器，其上一般帶有濾光片，孔徑光闌。2、物鏡有較長的工作距離。3、記錄裝置：安裝有攝影鏡筒，