2013級五年制實驗課小鼠脾臟單個核細胞分離

2013級五年制本科生

免疫學實驗課李冬基礎醫(yī)學院免疫學系

小鼠脾臟單個核細胞的分離實驗內(nèi)容小鼠脾臟單個核細胞的分離（實驗）淋巴細胞分離及檢測技術（講解）實驗目的掌握小鼠脾臟單個核細胞的分離及淋轉的原理和方法熟悉淋巴細胞的檢測技術細胞分離純化的目的測定細胞免疫功能首先要從人或動物外周血或組織中獲取有活性的細胞，如淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞等。根據(jù)實驗目的不同，采用不同方法，主要需考慮(1)細胞純度；(2)細胞獲得量；(3)細胞活力；Ficoll密度梯度離心法常用來分離單個核細胞的分層液：比重是1.077左右的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分層液。紅細胞、粒細胞比重大(1.092)，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重(1.070)，離心后漂浮于分層液的液面上，吸取分層液液面的細胞，就可從外周血/組織液中分離到單個核細胞。本次課分離小鼠脾臟單個核細胞FicollFicoll密度梯度離心法脾細胞懸液培養(yǎng)液實驗材料分組：兩人一組，每組一只小鼠器材數(shù)量試劑及動物數(shù)量滴管1支/2人分層液1ml/2人EP管3個/2人PBS1瓶/4人計數(shù)板1塊/2人計數(shù)液1瓶/室1ml加樣器(tip)1把/4人RPMI1640（無血清）100ml/室20ul加樣器(tip)1把/4人RPMI1640(5%NCS)100ml/室滴管1支/2人平皿（含紗布塊）1套/4人剪刀、鑷子1套/4人顯微鏡1臺/4人實驗步驟1、處死小鼠，取4ml無血清RMPI1640培養(yǎng)液放入平皿中。2、取出脾臟放到平皿中，將3-4層紗布覆蓋到組織上，用直頭鑷子固定組織，用彎頭鑷子輕壓組織，將其搗碎。然后用1000μl加樣器隔著紗布將細胞懸液吸出，放入1.5mlEP管中，做好標記。3、加樣：吸取2ml細胞懸液沿試管壁緩慢加至分層液頂部(距1cm處)NOTE：不要打破細胞懸液與分層液的界面；4、1800轉，室溫離心30分鐘；5、用毛細管插入液面下，盡量吸取白色毛玻璃層，放入EP管中；

NOTE：盡量少吸分層液；6、每管加PBS到1ml，重懸細胞，3000轉離心5分鐘。7、計數(shù)：吸棄上清，用100mlPBS重懸細胞，取出20ml加入新的EP管中，再加入20ml細胞計數(shù)液，混勻后取出10ml，加到計數(shù)板內(nèi)，顯微鏡下計數(shù)。細胞計數(shù)方法查出四個大方格的總細胞數(shù)(X)算出每個大方格的平均細胞數(shù)：Y=X/4每個大方格的體積為V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制備的細胞懸液的細胞濃度（/ml)=Y×104×稀釋倍數(shù)4淋巴細胞分離及檢測技術巨噬細胞淋巴細胞DC細胞紅細胞淋巴細胞分離及檢測技術淋巴細胞的分離淋巴細胞的功能測定技術淋巴細胞分離一、外周血單個核細胞的分離淋巴細胞分離液密度梯度離心法二、淋巴細胞亞群的分離及鑒定

1.E花環(huán)分離法

2.

尼龍纖維分離法

3.

流式細胞術

4.

磁珠分離術E花環(huán)分離法

（純化T細胞）

T細胞表面的CD2分子－綿羊紅細胞受體（E受體）尼龍纖維分離法B細胞和單核細胞具有易粘附特性，將淋巴細胞懸液加到尼龍纖維上，37℃作用1－2小時后，洗脫的為非粘附性T細胞。T細胞尼龍纖維毛柱PBMCB細胞單核細胞流式細胞術

（FlowCytometry，F(xiàn)CM）FCM將免疫熒光技術應用于流式細胞儀，對單個細胞的表面標志（抗原或受體）進行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細胞分選收集。FCM還可對同一細胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細胞體積等）進行多信息分析，是當代生命科學研究領域中廣泛使用的一項新技術。流式細胞儀工作原理免疫磁珠分離術1.直接法：

抗細胞表面分子抗體+磁性微球

免疫磁珠+細胞懸液

強磁場與免疫磁珠結合的細胞2.間接法：

第二抗體+磁性微粒

第一抗體+細胞